盐山微生物资源多样性研究及新种鉴定.ppt

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　　盐山微生物资源多样性研究及新种鉴定

　　报告内容

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　　国内外研究动态

　　研究目的与意义

　　主要研究内容

　　研究材料、方法与主要技术路线

　　研究条件、可行性与困难

　　研究进度安排

　　预期结果及后期计划

　　参考文献

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　　4

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　　8

　　国内外研究动态

　　盐山或称盐矿是指大量聚集及出产 NaCl 等盐类的地域。 由于其含盐量大，营养成分少，使得大部分微生物难以生存。只有一些嗜盐菌、耐盐菌和化学自养菌才能生存。

　　嗜盐菌能在高盐环境中生存，可分为中等嗜盐菌(最适生长盐浓度为 5%～20%)和极端嗜盐菌(最适生长盐浓度 > 15%～30%) 。其中极端嗜盐菌(嗜盐古菌)，分类地位归属于古菌域(Archaea ) 广古菌门(Euryarchaeota )嗜盐菌纲(Halobacteria) 嗜盐菌目(Halobacteriales) 嗜盐菌科(Halobacteriaceae)下面的各属。

　　目前研究最多的是极端嗜盐菌中的盐生盐杆菌( H. halobi um).一般认为嗜盐古菌生长所需最低盐浓度不低于1. 5 mol /L， 但是在最近的研究中很多科学家在低盐环境中也发现了大量的嗜盐古菌新类群，这也是分离古菌新种的一种新思路。

　　极端嗜盐菌多为圆形小菌落, 规则、湿润、有光泽,菌落颜色多样, 一般有粉红、桃红、朱红、橙红等色,镜检多为杆状、球状、三角形、方形以及多角形等各种形态。

　　嗜盐古菌

　　化能自养菌 利用无机化合物的氧化取得生活必需的能量,用二氧化碳作为碳源合成自己的细胞物质,不能像异养菌一样地利用现成有机质。 根据来源的不同，可以细分为硝化细菌、硫细菌、铁细菌、氢细菌等。其中硝化细菌和硫细菌研究的比较多，硝化细菌大部分为厌氧菌，一部分硫细菌为厌氧菌。

　　智利，阿塔卡玛盐湖(Salar de Atacama)是世界第三大干盐湖Tebenquiche lake

　　文章采用DGGE、非培和可培等方法对该盐环境中的微生物进行研究，发现的主要菌株为Bacteroidetes 和 Gammaproteobacteria

　　澳大利亚鲨鱼岛

　　采用可培和非培的方法分离得到 蓝细菌：Synechococcus, Xenococcus,Microcoleus, Leptolyngbya, Plectonema, Symploca,Cyanothece, Pleurocapsa and Nostoc. 真菌：seven phylogenetic groups: OP9, OP10, Marine A group, Proteobacteria, Low G+C Gram-positive,Planctomycetes and Acidobacteria. 古菌：Euryarchaeota、Crenarchaeota、methanogenic archaea.

　　秘鲁安第斯山脉Maras Salterns

　　文章采用?uorescence in situ hybridization (FISH)、可培及非培的方法研究该盐场的微生物组成，结果(80 - 86%) Archaea, Haloquadra和Halobacterium两个属， (10-13%) Bacteria 主要是Pseudomonas。

　　从艾比盐湖和艾丁盐湖分离到86株嗜盐古菌分属9个属，以 Natrinema属最多

　　中国科学院微生物研究所，新疆大学，新疆师范大学，云南大学，塔里木大学生命科学学院，中科院新疆生物土壤沙漠研究所，新疆石河子大学生命科学学院，浙江大学嗜极微生物实验室

　　分离出44株菌分属18个属，以Bacillus 属最多。

　　分离出65株嗜盐古菌分属6个属. 艾比湖以Haloterrigena和Natrinema属的菌株为主, 伊吾湖由Haloarcula和Halorubrum属的菌株构成。

　　分离培养盐山样品中的微生物，为微生物资源开发提供材料，分析盐山中可培养微生物群落结构，评价其多样性

　　研究目的

　　对疑似新种进行多相分类学研究。

　　研究目的与意义

　　研究意义

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 极端微生物能产生特殊性质的生物活性物质及功能酶

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 环境保护方面，可用于处理高盐污水

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 极端嗜盐菌紫膜特性可应用于电子领域

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 寻找到与耐盐有关的基因片段，转入植物体内，构建耐盐植物，充分利用盐碱土壤

　　(Gp:) 为微生物资源开发提供材料，对我国新的极端微生物基因库及新蛋白库建设事业起到支持作用

　　5

　　研究主要内容

　　多样性分析及对疑似新种多相分类学研究

　　(Gp:) 化学自养菌

　　(Gp:) 嗜盐古菌

　　(Gp:) 细菌

　　研究材料、方法与主要技术路线

　　材料：盐山样品 采集时间：2009.9 采集地点：拜城县7个、库车县5个、温宿县16个

　　BC03，BC07，BC09，BC10，BC12，BC13， BC14

　　KCY01，KCY03，KCY04，KCY07，KCY08

　　WSY03,WSY05,WSY07,WSY08,WSY10,WSY11,WSY12,WSY13,WSY15,WSY17,WSY18,WSY19,WSY20,WSY21,WSY22,WSY23

　　培养基设计

　　2216寡营养培养基 Bacto peptone 0.5gBacto yeast extract 0.1gNaCl 19.45gMgCl2.6H2O 8.8g Na2SO4 3.24gCaCl2 1.8gKCl 0.55gNaHCO3 0.16g SrCl2.6H2O 57mg 柠檬酸铁 0.1g微量元素液: KBr 0.08gH3BO3 22mgNa2SiO4 4mgNaF 2.4mgNH4NO3 1.6mgNa2HPO4 8mgpH 7.4

　　SNB培养基 NaCl 200g MgCl2.6H2O 12.58g 无水MgSO4 4.73g 无水CaCl2 3.6gKCl 2gNaHCO3 0.06g NaBr 0.026g YE 1g pH 7.4

　　HM培养基 NaCl 100g 无水MgSO4 1g 无水CaCl2 0.272g KCl 2g NaHCO3 0.06g NaBr 0.23g YE 1g peptone 0.5g Glucose 0.1g pH 7.4

　　ABWM培养基 NaCl 100g(5.53)MgCl2.6H20 2.76gCaCl2.2H20 0.33gKCl 0.15gNa2SO4 0.91gNaHCO3 0.48gKBr 0.023gH3BO3 0.007gSrCl2 0.005gNH4Cl 0.005gKH2PO4 0.001gNaF 0.0006gHEPES 2.383gSL-10 1mlpH 7.3

　　灭菌后加入： cAMP(环腺苷酸) 1ml BHL(N-丁酰基-高丝氨酸内酯)300ulVitamin 10 solution(10X) 1ml多种单糖+氨基酸(100X) 10ml Ps: 单糖为果糖、半乳糖、核糖、甘露糖、山梨糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖，浓度为250um per liter each氨基酸为20种氨基酸，浓度为100um per liter each

　　CM培养基 NaCl 200 g Casamino acids (Difco) 7.5 g yeast extract (Difco) 10 g KCl 2 g Na3C6H5O7 3g, MgSO4 .7H2O 20 g, FeCl2 .4H2O 0.036 g, pH 7.2

　　改良的CM培养基 NaCl 200 g Casamino acids (Difco) 5 g yeast extract (Difco) 5 g KCl 2 g Na3C6H5O7 3g, MgSO4 .7H2O 20 g, FeCl2 .4H2O 0.036 g, MnCl2 .4H2O 0.0036 g, CaCl2 0.25g K2HPO4 0.3g NH4Cl 0.25g pH 7.2 incubated at 37 0C for 1–2 weeks

　　古菌分离培养基

　　加氨苄青霉素、青霉素和链霉素各100ug/ml

　　(Gp:) 崔恒林等人从新疆地区艾比盐湖和艾丁盐湖卤水及泥土样品中分离到 86 株嗜盐古菌

　　CCMS培养基 Microcrystalline cellulose 10 g Casein 0. 3 g KNO3 2 g MgSO4?7H2O 0. 05 g K2HPO4 0. 2 g CaCO3 0. 02 g FeSO4 ?7H2O 0. 1 g KCl 20 g MgCl2 30 g NaCl 100 g pH 7.0 刘冰冰等人从 13 份土样中共分离到 56 株嗜盐古菌

　　改良高氏1号培养基 Soluble starch 20 g KNO3 1 g MgSO4 ?7H2 O 0. 5 g K2HPO4 0. 5 g NaCl 180 g pH 7.0

　　化学自养型细菌培养基 KH2PO4 0.5g K2HPO4 0.5g NH4Cl 0.5g MgSO4?7H2O 0.1g CaCl2 0.05g NaHCO3 1.0g Na2S2O3?5H2O 2g Na2S 1g trace element 1 ml pH 7.2

　　盐山样品

　　富集

　　细菌富集2-3d

　　古菌富集7-10d

　　稀释涂布

　　挑单菌落纯化

　　不同培养基

　　切割成粉末

　　抽基因组、PCR、 16S rDNA测序

　　多样性分析

　　疑似新种

　　保种

　　分菌

　　研究方法及技术路线

　　(Gp:) Text4

　　TA克隆，构建系统发育树，订购标株

　　杂交，GC测定，菌种保藏

　　形态学(革染，悬滴透射，切片)

　　生长曲线及限制因子NaCl,pH,T

　　生理生化，底物利用

　　脂肪酸，呼吸醌，极性脂

　　新种鉴定

　　(Gp:) 撰写论文

　　连续传代法，通过不断传代培养,逐步淘汰其他微生物, 而只有极端嗜盐古菌得到较好生长,并富集 NaCl浓度梯度法，在较高浓度 NaCl溶液的丰富营养的培养基中,其他微生物由于不能适应很高的渗透压而不能良好生长,而极端嗜盐古菌只能生长较高盐浓度的环境

　　古菌PCR通用引物: 正向引物 P1: 5' -ATTCCGGTTGATCCTGCCGGA- 3' 反向引物 P2: 5'- AGGAGGTGATCCAGCCGCAG- 3' PCR反应体系: Buffer 5.0 ul， dNTP 4.0 ul， P1 1.0 ul， P2 1.0 ul， Taq 酶 0.3 ul， ddH2O 37.7 ul， DNA模版1. 0 ul

　　扩增条件为: 95℃ 预变性4 min; 95℃ 变性1 min; 55℃ 退火30 s; 30个循环 72℃ 延伸2 min; 72℃ 延伸7min

　　可行性

　　2、实验室有较成熟的微生物分离培养和鉴定平台

　　1、丰富的样品资源，共有28个样

　　3、参考国内外分离嗜盐菌、古菌的方法

　　研究条件、可行性与困难

　　2、富集后单一菌种(如芽孢杆菌)为优势菌，使得其他菌难以生长

　　3、盐山样品成分未知，需要摸索分离嗜盐菌，古菌生长的培养条件

　　1、盐山样品中可培养微生物种类较少，不富集直接涂布长不出菌

　　困难

　　经费预算

　　研究进度安排

　　预期结果及后期计划

　　预期结果： 1、预期能分离2个以上疑似新种，鉴定1-2个疑似新种并发表论文。 2、分析盐山微生物资源多样性，分离到的菌株多样性较好。 后期计划： 对鉴定的新种做全基因组测序，拼接成全基因组，通过全基因组内基因的分析，研究其适应盐山特殊环境的一些机理。

　　参考文献

　　[1]Microbial diversity of extant stromatolites in the hypersaline marine environment of Shark Bay, Australia. Environmental Microbiology (2004) 6(10), 1096–1101. [2]Microbial Diversity in Maras Salterns, a Hypersaline Environment in the Peruvian Andes. Applied And Environmental Microbiology, 2006, 3887–3895. [3]Microbial diversity and complexity in hypersaline environments: A preliminary assessment. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2002) 28, 48–55. [4]Halotolerant Aerobic Heterotrophic Bacteria from the Great Salt Plains of Oklahoma. Microbial Ecology.2004,449-462. [5]Bacterial, archaeal and eukaryotic diversity of smooth and pustular microbial mat communities in the hypersaline lagoon of Shark Bay. Geobiology (2009), 7, 82–96. [6]Compatible solutes of organisms that live in hot saline environments. Environmental Microbiology (2002) 4(9), 501–509 [7]Diversity of Archaea in hypersaline environments characterized by molecular-phylogenetic and cultivation studies. Extremophiles (2002) 6:267–274. [8]Diversity, Activity, and Abundance of Sulfate-Reducing Bacteria in Saline and Hypersaline Soda Lakes. Applied And Environmental Microbiology, 2007, 2093–2100.

　　[9]许学伟等. 新疆艾比湖和伊吾湖可培养嗜盐古菌多样性. 生物多样性, 2006, 14 (4): 359–362. [10]刘冰冰等.新疆罗布泊地区可培养嗜盐古菌多样性及其功能酶筛选.微生物学报,2011,51(9):1222-1231. [11]Halococcus hamelinensis sp. nov., a novel halophilic archaeon isolated from stromatolites in Shark Bay, Australia. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2006), 56, 1323–1329. [12]Thiovirga sulfuroxydans gen. nov., sp. nov., a chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacterium isolated from a microaerobic waste-water bio?lm. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2005), 55, 1059–1064. [13]崔恒林等. 新疆两盐湖可培养嗜盐古菌多样性研究. 微生物学报,2006, 46( 2) : 171-176. [14]刘爱民. 嗜盐菌的研究进展. 安徽师范大学学报.2002, 25(2):181-183. [15]陈绍兴等. 极端嗜盐古菌的分离与纯化方法初探. 江苏农业科学. 2009, (2):291-292. [16]Novelty and spatio–temporal heterogeneity in the bacterial diversity of hypersaline Lake Tebenquiche (Salar de Atacama). Extremophiles (2008) 12:491–504. [17]Natrinema altunense sp. nov., an extremely halophilic archaeon isolated from a salt lake in Altun Mountain in Xinjiang, China. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2005), 55, 1311–1314. [18]肖炜等. 昆明盐矿古老岩盐沉积中可培养细菌多样性研究. 微生物学报. 2006,46(6):967-972.

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