食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验.ppt

　　GB /T 4789.36-2008食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验

　　一、背景

　　1. 背景资料 认识 爆发与流行情况：国际、国内

　　中国1999年HUS病例

　　我国O157：H7/NM检验标准进展情况

　　GB 4789.6-1994 食品卫生微生物检验致泻大肠埃氏菌检验 GB/T 4789.6-2003 食品卫生微生物检验致泻大肠埃氏菌检验 GB/T 4789.36-2008 食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7NM检验 GB 17012—1997 感染性腹泻的诊断标准及处理原则 WS 271-2007 感染性腹泻诊断标准 全国肠出血性大肠杆菌O157:H7区监测方案(试行) 2005年06月12日

　　二、标准制订遵循的原则

　　参照美国FDA、美国USDA、北欧食品分析委员会(NMKL)、国际分析家学会(AOAC)的有关标准。 结合标准的比对与验证试验结果，吸取快速检测方法，力求科学实用、准确可靠，易于掌握和推广使用。

　　三、国际现状

　　食品中O157:H7大肠杆菌检验的传统方法，FDA/BAM、USDA/BAM、NMKL、AOAC/BAM等均制定了相关及检测方法标准，FDA/BAM、AOAC/BAM 方法中将免疫磁珠分离技术作为选用方法，USDA/BAM、 NMKL将免疫磁珠分离技术作为指定方法。 增菌培养基：FDA/BAM使用EHEC Enrichment Broth (EEB)+CCV，USDA/BAM使用mEC+n，NMKL使用 mTSB+Nov20mg/l，CCFRA使用BPW-VCC或mEC+n，AOAC/BAM使用mTSB+Nov。 分离培养基：FDA/BAM为CT-SMAC、USDA/BAM为Rainbow agar、NMKL为CT-SMAC、CCFRA为SMAC 和CT-SMAC、AOAC/BAM为Rainbow agar。分析样品量USDA/BAM为65g，其余为25g。 培养温度：NMKL为41.5±0.5℃，USDA/BAM为35±2℃，其余为37℃。 质量控制与安全性控制：USDA/BAM

　　四、主要修订内容

　　本标准第一法修改采用美国FDA Bacteriological Analytical Manual Online Chapter 4A September 2002 。第二法修改采用欧洲NMKL Nordic Committee On Food Analysis No 164 1999。第三法修改采用AOAC-RI Performance Tested Methods VIDAS E.Coli O157(ECO)Test，2005.18。第四法等同采用AOAC-RI Performance Tested Methods BAX ? E.Coli O157:H7 ,2004.3。 本标准第一法与美国FDA/BM 方法的主要差异如下： —增菌培养基以mEC+nov肉汤替代了EEB+CCV肉汤。 —增加了CHROMagarTMO157显色培养基。 —增加了质量控制与生物安全方面的内容描述。 本标准第二法与NMKL Nordic Committee On Food Analysis No 164 1999的 —增菌培养基以mEC+nov肉汤替代了mTSB肉汤。 —修改增菌培养温度41.5℃±0.5℃为36℃±1℃。 —增加了CHROMagarTMO157显色培养基。 本标准第三法\第四法与AOAC-RI E.Coli O157(ECO)Test的主要差异如下： —增菌培养基以mEC+nov肉汤替代了mTSB肉汤。 —生肉以外的食品增菌培养基以mEC+nov肉汤替代了EEB肉汤。

　　五、第一法与美国FDA方法比较

　　实验设计 - 样品的选择：生猪肉馅、生菜。 - 样品的染菌：将样品充分混匀，称取25g样品，加入O157:H7标准菌株(ATCC43888)生理盐水悬液，染菌样品的各种浓度见表1。 - 实验操作：见大肠埃希氏菌O157:H7检验SOP。 - 结果判断：大肠埃希氏菌O157:H7常规检验方法与美国FDA方法、免疫磁珠捕获方法与NMKL方法进行两两配对检验，经统计学的方法Chi-square Test(X2检验)进行分析。

　　结果

　　表1 常规法与美国FDA方法检出率的比较 表

　　结论

　　常规法与美国FDA法比较，分生肉类和蔬菜类两类样品进行检验，染菌量在0.5 cfu/g、1 cfu/g、5 cfu/g时，检出率比较P值范围在0.594～1.000，均大于0.05，无显著性差异。

　　六、免疫磁珠捕获方法与NMKL方法的比较

　　表2 磁珠法与NMKL方法的比较表

　　结论

　　磁珠法与NMKL法比较，分生肉类和蔬菜类两类样品进行检验，染菌量在0.1 cfu/g、0.5 cfu/g、1 cfu/g时，检出率比较：P值范围在0.286～1.000，均大于0.05，无显著性差异。

　　七、大肠埃希氏菌O157:H7常规检验方法与免疫磁珠捕获方法检测限的测定

　　实验设计 -样品的选择：生猪肉陷、生菜。 -样品的染菌：将样品充分混匀，称取25g样品，加入O157:H7标准菌株(ATCC43888)生理盐水悬液，染菌样品的各种浓度见表。 -实验操作：见标准协作组下发的SOP。 -结果判断：以回收检出率80%的最低染菌浓度，作为该方法的检测限。

　　表3 大肠埃希氏菌O157:H7常规法检测限的测定结果

　　从表3可以看出，生肉类和蔬菜类样品混合统计，当样品染菌量在1 cfu/g时，检出率在75%～95%之间，平均86.9%;在5 cfu/g时，平均检出率为93.8%;在0.5 cfu/g时，平均检出率为60%，故该方法的检测限定为在25g样品中≤1 cfu/g。

　　表4 大肠埃希氏菌O157:H7免疫磁珠捕获方法检测限的测定

　　从表4可以看出，生肉类和蔬菜类样品混合统计，当样品染菌量在0.5cfu/g时，检出率在75%～100%，平均86.6%;在1cfu/g时，平均检出率为91.5%;在0.1 cfu/g时，平均检出率为72.3%，故该方法的检测限定为在25g样品中≤0.5cfu/g。

　　八、常规法、免疫磁珠捕获方法VIDAS、BAX方法的比较

　　目标 -通过对O157:H7检验常规法、免疫磁珠捕获方法、VIDAS、BAX方法的配对比较，对方法进行有效的评价，考察4种方法间是否存在差异，同时判断VIDAS、BAX方法的可行性。 实验设计 -样品的选择：生猪肉陷、生菜。 -样品的染菌：将样品充分混匀，称取25g样品，加入O157:H7标准菌株(ATCC43888)生理盐水菌悬液，染菌样品的各种浓度见表1。 -实验操作：详见标准协作组下发的SOP。 -结果判断：常规法与免疫磁珠捕获方法、VIDAS、BAX方法的配对比较检验，用统计学的方法Chi-square Test(X2检验)进行分析;仪器法与磁珠法进行两两配对检验，经χ2检验进行分析。仪器法与磁株法比较，假阳性率≤10%、假阴性率≤2%为可接受方法。

　　结果

　　表5 常规法与免疫磁珠捕获方法、VIDAS、BAX方法的比较

　　从表5可以看出，常规法与免疫磁珠捕获方法、VIDAS、BAX方法在染菌浓度5 cfu/g时，P值均大于0.05，无显著性差异;染菌量在0.5 cfu/g的P值均小于0.05，表明常规法与免疫磁珠捕获方法、VIDAS、BAX方法之间有显著性差异;自然样品，常规法与免疫磁珠捕获方法、BAX方法比较，结果无显著性差异(P>0.05)，与VIDAS方法结果有显著性差异(P<0.05);总体P值分别为0.049、0.0004、0.0023，均小于0.05，表明常规法与免疫磁珠捕获方法、VIDAS、BAX方法之间有显著性差异。

　　表6 磁珠法和VIDAS法检出率比较

　　表7 免疫磁珠捕获方法和BAX方法检出检出率比较

　　实验结论

　　免疫磁珠捕获方法和VIDAS、BAX两两配对检验分析， VIDAS方法和免疫磁珠捕获方法结果无显著性差异(P>0.05)，VIDAS方法的假阳性率为7.8%，无假阴性;BAX方法和免疫磁珠捕获方法结果无显著性差异(P>0.05)，BAX方法的假阳性率为3.3%，无假阴性。故可以吸收这两种仪器筛选方法作为国标检验方法。

　　九、增菌培养温度对结果的影响

　　选择36和42℃进行比较(常规法)

　　十、不同培养基分离效果

　　CT-SMAC：存在较多的山梨醇发酵阴性的细菌菌落生长，干扰O157的检出 。 CHROMagar O157：较多的非O157菌落生长，影响O157菌的检出。 改良CHROMagar O157：非O157细菌生长较少且菌落相对局限，O157菌落特征性明显。

　　十一、O157检验方法的条件优化

　　1.增菌培养基：国际上采用的为mEC+n、mTSB+n、 EHEC Enrichment Broth (EEB=TSB)+CCV、BPW-VCC。通过比较，mEC与mTSB差异不大，且为我国“污染物监测网”和“全国肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻”检测中普遍使用。(2005年,国家食源性疾病监测网 食品中病原菌检验) 2.增菌培养温度：国际方法中有3个培养温度：NMKL为41.5±0.5℃ 、 USDA/BAM为35±2℃，其余为37℃。实验结果表明，在41.5±0.5℃时，温度作为一个选择性因子，能够抑制杂菌丛的生长，但同时O157也部分地受到抑制。在36±1℃ 时，O157的相对量较多。

　　3.分离培养基：目前国际上采用的培养基有：SMAC、CT-SMAC、Rainbow agar等，本实验分别使用了SMAC、CT-SMAC、CHROMagar、改良CHROMagar琼脂平板，结果表明：改良CHROMagar > CHROMagar > CT-SMAC > SMAC。 4.平板分离方法的选用： (1)常规方法：FDA、CCFRA方法均使用2块平板，涂布：取0.1ml或适当稀释后的增菌液0.1ml进行，划线取满环。通过实验表明，选择2块平板， CT-SMAC和改良CHROMagar ，取增菌液0.1ml先涂布一半，再划线一半，可以减少操作误差，得到较好的分离效果。 (2)磁珠方法(IMS)：国际上使用磁珠量为20 μl ，选择2块平板， CT-SMAC和改良CHROMagar ，取磁珠悬液各50 μl，先涂布一半，再划线一半，可以减少操作误差，同样得到较好的分离效果。

　　5. 血清学：使用O157、H7因子血清鉴别。但哈夫尼亚、变形、异常沙门菌、柠檬酸杆菌等与O157可能有交叉反应，需要用生化进一步鉴定。 6.生化项目：一般使用Indole、MUG等作为筛选试验，API20E、VITEK GNI或GNI+作为鉴定试验。本法使用TSI、MUG作为筛选，MUG可筛除E.coli、宋内氏、柠檬酸杆菌、肠杆菌、克雷伯氏菌、哈夫尼亚菌、粘质沙雷氏菌、耶耳森氏菌等。TSI可筛除沙门菌、志贺氏菌、变形、部分普罗菲登氏菌、摩根氏菌等。 API20E、VITEK GNI或GNI+作为鉴定试验。

　　肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验

　　标准操作程序

　　一、 常规方法

　　检样 ↓ 25g(mL)+改良EC肉汤(mEC+n)225ml 快速筛选 阴性 36±1℃ 18～24h 阳性 报告 CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板 36±1℃ ↓ 18～24h 挑取可疑菌落5～10个,氧化酶阴性,革兰氏阴性杆菌接种TSI ↓ MUG-LST 36±1℃ 18～24h  阳性 阴性 ↓ ↓ 非O157菌　　　血清学试验 　　　　　　　　 ↓ 　　　　　　　生化试验 　　　　　↓ 　　　　报　告

　　操作步骤

　　1 增菌 以无菌操作取检样25g(mL)加入到含有225mL mEC+n肉汤的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1～2　min。于36±1℃培养18～24h。同时做阳性及阴性对照。 无菌操作，阴阳行对照避免交叉污染。 1000mL增菌培养基中加1mL新生霉素储备液，使最终浓度为20mg/L。

　　2 .分离 取增菌后或筛选试验阳性的mEC+n肉汤，分别划线或适当稀释后取0.1mL涂布接种于CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板上，于36±1℃培养18～24h，观察菌落。必要时将混合菌落分纯。在CT-SMAC平板上，发酵山梨醇的菌落为红色;典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色，用接种针挑起时无拉丝现象。在改良CHROMagar O157显色琼脂平板上为圆形、较小的菌落，中心呈淡紫色-紫红色，边缘无色或浅灰色。

　　取1000ml灭菌融化并冷却至45℃±1℃的山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂, 加入1 ml亚碲酸钾溶液和10mL头孢克肟溶液，混匀后倾注平板。 亚碲酸钾最终浓度达到2.5mg/L，头孢克肟最终浓度达到0.05mg/L。

　　增菌后的肉汤在取样前，应轻微摇晃混匀。 划线时应多次往返，保证分离效果。 涂布时应适当稀释。 注意区分典型菌落，必要时进行分纯。大部分非O157 E.coli发酵山梨醇，仍有6%不发酵山梨醇，它们与摩根氏菌和哈夫尼亚菌一样在TC-SMAC上表现为与O157相同的菌落特征。

　　3. 初步生化试验 在CT-SMAC和改良CHROMagar O157显色琼脂平板上挑取5～10个典型或可疑菌落，分别接种TSI琼脂，同时接种MUG-LST肉汤，于36±1℃培养18～24h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈阳性反应呈黄色，产气或不产气，不产生H2S。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察，阳性对照应无荧光产生，阴性对照应有荧光;对分解乳糖且无荧光的菌株，在营养琼脂平板上分纯，于36±1℃培养18～24h，并进行下列鉴定。

　　菌落选择：挑取典型菌落，数量在5个以上，尽量多挑。 注意混合菌落的识别，进行分纯后挑去。 在观察MUG实验时，与阴性、阳性对照一起观察，应带上防紫外线的护目镜，注意紫外线对眼镜的伤害 。

　　4.鉴定 4.1 血清学试验 在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落，用O157:H7标准血清或O157乳胶凝集试剂作玻片凝集试验。血清凝集试验应做生理盐水对照。对于H7因子血清不凝集者，应穿刺接种半固体琼脂管，检查动力，经连续传代3次，动力试验阴性，H7因子血清凝集阴性者，确定为无动力株。 CCP:先做O157血清凝集，后做H7因子凝集，注意自凝菌，用生理盐水做对照。

　　4.2 生化试验 用API20E或VITEK-GNI+或其它肠杆菌科生化鉴定试剂盒，按照生产商提供的使用说明进行。 CCP: 进行生化试验时应是用新鲜培养物(24h)。 菌液的稀释应注意无菌操作，浊度应达到使用说明的要求。

　　二、免疫磁珠捕获法

　　检样 ↓ 25g(mL)+改良EC肉汤(mEC+n)225ml 快速筛选 阴性 36±1℃ 18～24h 阳性 报告 免疫磁珠捕获 CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板 36±1℃ ↓ 18～24h 挑取可疑菌落5～10个,氧化酶阴性,革兰氏阴性杆菌接种TSI ↓ MUG-LST 36±1℃ 18～24h  阳性 阴性 ↓ ↓ 非O157菌　　　血清学试验 　　　　　　　　 ↓ 　　　　　　　生化试验 　　　　　↓ 　　　　报　告

　　(Gp:) 增菌 免疫分离 浓缩， 分离

　　(Gp:) 琼脂平板 PCR ELISA 其他鉴定和分型实验

　　简单易行的磁珠分选技术

　　操作步骤

　　1. 增菌：同常规法。 2. 磁珠分离： 2.1 将Eppendorff管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1只Eppendorff管，然后插入到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E.coliO157免疫磁珠溶液后，用开盖器打开每个Eppendorff管的盖子，每管加入20μL　E.coli O157免疫磁珠悬液。

　　CCP：磁珠在加入前在混旋器上短暂混匀，不可剧烈震荡，避免产生泡沫。2.2 取mEC+n肉汤增菌培养物1mL，加入到Eppendorff管中，盖上盖子，然后轻微振荡10s。每个样品更换1只加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染。CCP: 取样前混匀，避开脂肪层与杂质，必要时使用滤网。 加样后立即混匀。对照同时做。

　　2.3 结合：在18～30℃环境中，将上述Eppendorff管连同磁板架放在适合的装置上转动或用手轻微转动10min，使E.coli O157与免疫磁珠充分接触。 CCP：注意室内温度 ，保证结合时间。 结合时不要将磁铁插入到磁板架中。 用手转动时应轻轻颠倒Eppendorff管架，不可剧烈摇动。保证磁珠与O157的结合。

　　2.4 捕获：将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在3min内不断地倾斜磁板架，确保悬液中和盖子上的免疫磁珠全部被收集起来，此时，在Eppendorff管壁中间明显可见的圆形或椭圆形棕色聚物。 2.5 吸取上清液：取1支灭菌的加长吸管(或一次性的尖嘴细长移液管)，从免疫磁珠聚集物对侧深入液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠积聚物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回到Eppendorff管中，并重复2. 4步骤。每个样品换用1支加长吸管。

　　免疫磁珠的滑落：某些样品特别是那些含脂肪的样品，其磁珠积聚物易于滑落到管底。在吸取上清液时，很难做到不丢失磁珠，在这种情况下，可保留50～100μL上清液于Eppendorff管中。如果在后续的洗涤过程中也这样做的话，脂肪的影响将减小，也可达到充分捕获的目的。 2.6洗涤：从磁板架上移走磁板，在每个Eppendorff中加入1mL PBS-Tween20洗液，转动磁板架3次以上，洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤2.4～2.6。

　　2.7 重复上述步骤2. 4～2. 5 CCP: 洗涤共3次，动作要轻柔。 吸取上清液至磁珠聚集物处时，应放慢速度。上清液的吸取应尽量完全。 使用多块磁珠分离装置时，磁铁与磁铁应远离放置。 2.8 免疫磁珠悬浮：移走磁板，将免疫磁珠重新悬浮在100μL PBS-Tween20洗液中。

　　2.9涂布平板 用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取50μL免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板一侧，然后用涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，于36±1℃培养18～24h。注意，若CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157显色琼脂平板表面水分过多时，应在37℃下干燥10～20min，涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。

　　2.10 菌落识别、初步生化试验 、鉴定 同常规法。

　　第三法?全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法

　　VIDAS是生物梅里埃公司生产的一种全自动免疫荧光酶标仪，在微生物检测中主要是利用酶联免疫的原理对微生物或毒素等进行筛选检测。

　　1、原理

　　应用酶联免疫法，最后测蓝色荧光(ELFA)抗原(细菌、蛋白)的检测是应用一种夹心的技术，包被针上有抗体包被，所测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。 测试范围 用以食品及环境样本中的致病菌包括：沙门氏菌、李斯特菌、单核细胞增生李斯特菌、葡萄球菌肠毒素、大肠埃希菌O157、弯曲菌、免疫浓缩沙门氏菌、免疫浓缩大肠埃希菌O157。 即可用试剂 VIDAS一次性即可用试剂分为2部分：　　SPR，固相接受器，其内侧由抗体包被，此包被针作为固相吸管功能　　条形码标记试剂条，含所有所需试剂，取出即可用。试条类别由试条上颜色标贴及3字母的标志识别。

　　2、仪器

　　VIDAS30是一自动免疫分析仪，它由VIDAS30、电脑部分、终端机、打印机及键盘组合而成。系统分5个测试室，每个测试室可放入6个标本，同时共测定30个标本的容量。　　250个标本/每工作日

　　mini-VIDAS是一台全自动荧光免疫分析仪，它集合计算机、键盘及打印机于一身。控制整个酶联反应的操作直至打印结果。内置计算机管理数据及报告。Mini-VIDAS由两个独立的仓各含6个试验通道，可同时进行不同的VIDAS试验。

　　3?、试剂

　　3.1?E.coli?O157?试剂条(VIDAS?ECO?)。 3.2?校正液：纯化灭活的E.coli?O157抗原标准溶液 3.3?阳性对照。 3.4?阴性对照 3.5?MLE?卡。

　　4、操作步骤

　　前增菌 36?℃?士1?℃?培养6h?一7h?。 增菌与处理 取1?mL?前增菌肉汤接种于9?mL?改良麦康凯肉汤(CT?-?MAC?)?，于36?℃?土1?℃?培养17h?一19h?。 取1?mL?增菌后的CT-MAC?肉汤加入试管中，在100?℃?水浴中加热15?min?。 剩余增菌肉汤存于2?℃?一8?℃?，以备对阳性检测结 果确认

　　4.3?上机操作4.3.1?输入MLE?卡信息4.3.2?校正 4.3.3?检测所有分析过程均由仪器自动完成，检测约需45?min?。 4.4?结果报告检测值是由每份样本的相对荧光值(RVF?)与标准溶液RVF?相比得出，见式(1?)。检测值=样品RFV/标准RFV?………(1)若检测值<0.10?，则报告为阴性;若检测值>=10?，则报告为阳性。 4.5阳性结果的确认用第一法或第二法对保存于2?℃-8?℃?的增菌肉汤分离鉴定确认. 4.6阴性结果的报告阴性结果可直接报告25g(mL)样品中未检出大肠埃希氏菌O157:H7?。

　　第四法 全自动病原菌检测系统筛选法

　　1 原理BAX 系统利用多聚酶链反应(PCR )来扩增并检测细菌DNA中特异片段来判断目标菌是否存在反应所需的引物、DNA 聚合酶和核苷酸等被合并成为一个稳定、干燥的片剂，并装人PCR 管中，检测系统运用荧光检测来分析PCR 产物每个PCR 试剂片都包含有荧光染料，该染料能结合双链DNA ，并且受光激发后发出荧光信号。在检测过程中，BAX 系统通过测量荧光信号的变化，分析测量数据，从而判定阳性或阴性结果。

　　2 、仪器和材料

　　2.1 BAX 系统主机及工作站2.2 仪器校正板。2.3 带帽裂解八联管及管架。2.4 盖帽、去帽器。2.5 加热槽两个。2.6 温度计2.7 单道加样器：20 uL 一200 uL 、5 uL 一50uL 8 道加样器： 5 uL 一50 uL 及配套带滤芯的吸头2.8 冷却槽。2.9 PCR 管支架2.10 打印机。

　　BAX? System Q7

　　Advanced DNA-based detection of bacteria and other microbes in food and environmental samples. Provides food safety and food quality testing on the same platform.

　　3 、试剂

　　3.1 PCR 管。3.2 裂解缓冲液。3.3 蛋白酶。3.4 溶菌试剂

　　4 、操作步骤

　　4.1 增菌 同第一法 4.2 上机操作 4.3 结果报告

　　4.4 不确定和错误结果的处理取保存于2 -8摄氏度 的增菌肉汤重新上机检测。 4.5 阳性结果的确认用第一法或第二法对保存于2一8摄氏度 的增菌肉汤分离鉴定确认 4.6 阴性结果的报告阴性结果可直接报告25g(mL)样品中未检出大肠埃希氏菌O157 : H7

　　谢谢