医学微生物学实验一.ppt

　　到显微镜室借显微镜，每人一台。

　　医学微生物学实验一

　　主讲：xxx

　　实验成绩安排

　　本实验成绩共30分： 考试10分(第五次实验课上测试)。 实验报告10分。 课堂表现、考勤、值日共10分。

　　实验内容

　　一、实验室生物安全 二、无菌接种技术 三、细菌形态学观察

　　一、实验室生物安全

　　实验室的危害源

　　生物因素：Biological hazard：指有害或有潜在危害的 生物因子对人、环境、生态和社会造成的危害 或潜在危害。 物理因素 化学因素 后两者的特性： 1.可感知，易避免 2.危害范围有限 3.危害持续时间短

　　实验室生物安全事件

　　2004年4月，中国疾病预防控制中心科研人员，采用未经论证的非典病毒灭活方法，在不符合防护要求的普通实验室内操作非典感染材料，造成北京、安徽发生非典疫情。

　　实验室生物安全事件

　　2010年12月，东北农业大学28名师生因做实验而被感染布鲁氏菌病。动物医学学院院长、党总支书记被免职。

　　实验室生物安全事件

　　2014年6月美国疾病控制和预防中心设在亚特兰大的一间高级别生物安全实验室，在对活炭疽菌进行灭活时，没有遵循正确的程序。随后，他们将可能带有活炭疽菌的样本转移到三个低级别实验室，而后者并不具备处理活炭疽的设施。6月6日至13日，两个实验室可能让芽胞成烟雾状散开。 由于相信样本已经灭活，低安全级别实验室的工作人员没有穿上适当的防护设备。最初报告称，75名员工无意中接触到炭疽菌，19日这个数字上升到86人。

　　(Gp:) P4实验室

　　(Gp:) P2实验室

　　(Gp:) P1实验室

　　(Gp:) 操作在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物

　　(Gp:) 操作能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害

　　(Gp:) 操作能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物

　　(Gp:) 操作能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，尚无有效预防或治疗方法

　　P3实验室

　　医学微生物学实验室规则

　　学生进微生物实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折， 要经常清洗消毒。 进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指 定的储物柜内。 严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。 手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡 手;避免有菌材料溅出;破损器材及时处理并报告。 实验过程中避免一切不良的个人习惯;操作中产生的废料 要扔在指定容器内;实验完毕清理台面，值日生严格认真打扫卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。

　　二、细菌接种技术 实验目的： 1.掌握细菌的平板接种方法 2.熟悉细菌生长现象的观察方法

　　接种用器材

　　1.接种环和接种针

　　2.生物安全柜

　　接种用器材

　　接种用器材

　　3.灭菌器材

　　4.培养基 概念:是人工配制的专供微生物生长繁殖的混合营养物制品。 成分：充足的营养物质(水分、碳源、氮源、无机盐);合适的pH;适宜的温度;适宜的气体环境。

　　接种用器材

　　各种培养基

　　5.恒温培养箱

　　接种用器材

　　细菌的接种技术

　　接种环及其无菌操作方法 普通琼脂培养基接种法 1.平板分区划线接种法：分离培养细菌，通过此法可以获得纯培养为进一步鉴定细菌提供条件。

　　分区划线(划、转、烧)

　　划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻接触，以腕力在琼脂表面轻快滑动，不能划破琼脂。 第一次划线应占平皿面积的1/10，以后每次划线约占面积的1/4—1/5。 划线为连续划线,不能间断，应占满平皿，划线不能交叉重复， 每次划完后应灭菌。

　　2.斜面接种法：用于纯菌的移种，可短时间保存 菌种。

　　3.半固体穿刺接种法：保存菌种或观察细菌的动力和生化反应 4.液体接种法：用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基的接种

　　生长现象的观察

　　固体培养基-菌落 一个细菌不断分裂而成的细菌群体称之为菌落。观察菌落的形态、大小、表面、边缘、湿度、透明度;在血平板上还要观察溶血情况和色素等。

　　斜面培养基

　　半固体培养基-鞭毛 观察细菌的运动

　　液体培养基

　　混浊生长(大多数细菌) 沉淀生长(链球菌) 膜样生长(专性需氧菌，如结核分枝杆菌、枯草杆菌)

　　操作内容

　　1.练习平板分区划线法，液体，半固体，斜面培养基接种。 2. 液体、半固体、斜面和平板培养基每人一个。

　　三、细菌的形态学检查 一、不染色标本检查(活体) 悬滴法 压滴法 二、染色标本检查 单染法：简单染色，一种染料 (美兰染色) 复染法：复杂染色，两种以上染料(革兰染色、抗酸染色)

　　革兰染色(Gram stain) 1884年由丹麦医师Gram创立。 革兰染色是最常用的一种染色方法，可以将细菌初步分为革兰染色阳性菌和革兰染色阴性菌，在临床上具有非常重要的意义。

　　目的：

　　掌握细菌涂片的制备及革兰染色的方法

　　G+ 菌 细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且交联度高， 经革兰氏染色后能够将龙胆紫与碘的复合物牢固留 在壁内。脂质含量少，不容易被脱色液脱色而呈现 紫蓝色。 G-菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄且交联度低，含 大量脂质，易被脱除染料。

　　原理：

　　革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较

　　器材和试剂： 1.菌种 白色葡萄球菌和大肠杆菌培养物 2.试剂 革兰染色液 及其成分 龙胆紫液 龙胆紫、乙醇 碘溶液 碘、碘化钾 脱色液 丙酮、乙醇 沙黄溶液 沙黄、乙醇 3.其它材料 接种环 载玻片 染色盘 洗液瓶 酒精灯等

　　冲洗

　　染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果

　　方法与步骤 1.细菌涂片的制备 涂片 干燥 固定 2.染色 ①龙胆紫液 ②碘液 ③脱色液 ④沙黄溶液复染 吸水纸吸干

　　10s

　　10s

　　10~20s

　　10s

　　冲洗，甩干

　　冲洗，甩干

　　冲洗，甩干

　　10s 10s 10-20s 10s

　　G+菌

　　G-菌

　　龙胆紫

　　碘液

　　丙酮、乙醇

　　沙黄溶液

　　① ② ③ ④复染

　　结果

　　大肠杆菌(1000倍)革兰阴性

　　白色葡萄球菌(1000倍)革兰阳性

　　无菌操作(接种环灭菌和取菌) 涂片的厚度要适中 染色的时间控制 冲洗的方法，不要对着涂片区冲洗 观察后将玻片放入玻片缸中

　　注意事项

　　意 义

　　1.鉴别细菌

　　2.研究与致病性的关系

　　3.指导临床用药

　　G+

　　G-

　　G+ 致病 外毒素

　　G- 致病 内毒素

　　G+ 青霉素、头孢菌素等

　　G- 链霉素、庆大霉素等

　　细菌的特殊结构(示教)

　　(Gp:) 从细胞质的基础颗粒长出，伸到细胞外面的细长呈波状弯曲的丝状物。 功能：鞭毛运动可鉴定、与致病性有关、具有抗原性(H抗原)

　　鞭 毛

　　(Gp:) 荚膜

　　细菌细胞壁外包绕的一层粘液性物质，厚度≥0.2μm边界明显者称为荚膜，厚度<0.2μm者称为微荚膜 功能：荚膜护菌强致病---抗吞噬作用、抗有害物质损伤、抗干燥作用、黏附作用

　　菌体内部物质缩水(60%)形成圆或卵圆形小体。 功能：芽胞形态辨细菌， 灭菌标准抗力强。

　　芽 胞

　　1.寻找视野：在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观 察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。 2.增大光照强度：将聚光器上升到最高位置，光圈开到最 大。 3.转高倍镜头、滴加镜油、换油镜头：转动转换器，使高 倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏 油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视 镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片 为宜。

　　油镜的使用方法

　　4.调试观察：观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。 如果不出现物象或者目标不理想要重新寻找，在加油区之外 重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。在加油区内重找应按： 低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。 5.清洗镜头：油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜头上和标本上 的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯(或乙醚)擦去残余的香 柏油，最后再用干擦镜纸擦干净。

　　油镜的使用方法

　　预 习

　　1.请将实验后的玻片放入前面的消毒缸中。 2.离开实验室之前请用肥皂洗手。

　　分枝杆菌鉴定、消毒灭菌、肠道致病菌的分离培养

　　实验报告

　　1.革兰染色的材料 2.染色的方法步骤 3.结果 4.临床意义