第四章 病毒遗传分析.ppt

　　第四章 病毒遗传分析

　　病毒是亚显微、没有细胞结构、专性寄生于活细胞内的实体。

　　病毒结构十分简单，它们仅含一种核酸，或DNA或RNA，和一个蛋白质外壳。病毒必须感染活细胞，改变和利用活细胞的代谢合成机器，才能合成新的病毒后代。 依其宿主范围可分为感染细菌、真菌及藻菌的菌类病毒，以及感染动物和植物的动物病毒和植物病毒。 依其遗传物质的性质，可以有单链DNA、单链RNA、双链DNA和双链RNA等四种类型。 感染细菌的病毒又叫噬菌体(bacteriophage)，是目前了解比较清楚的病毒。依其与宿主细胞的相互关系，可以有烈性(virulent)和温和(temperate)噬菌体两大类型。

　　(Gp:) 呼肠病毒

　　第一节 T4噬菌体

　　噬菌体基本上是由一个蛋白质外壳和其中包含的核酸组成的。 遗传学上应用最广泛的是大肠杆菌的T噬菌体系列(T1到T7)。它们的结构大同小异，外貌一般呈蝌蚪状。 T偶数噬菌体具有六角形的头部，其内含有双链DNA分子。头下的尾部包括一个中空的针状结构及外鞘。末端是基板，由尾丝及尾针组成。当T偶数噬菌体的尾丝附着在大肠杆菌表面时，通过尾鞘的收缩将噬菌体DNA经中空尾部注入宿主细胞。

　　The structure of bacteriophage T4 including an icosahedral head filled with DNA, a tail consisting of a collar, tube sheath, base plate, and tail fibers.

　　一、T4噬菌体的结构

　　Life cycle of bacteriophage T4.

　　二、T4噬菌体的基因组和遗传图谱

　　T4噬菌体的基因组为双链线性DNA，由1.69x105个核苷酸组成。基因组由约200个编码平均大小蛋白质的基因，其中135个基因是已知的，另外约70个是未知基因。根据功能可分成两类： 代谢基因：82个，其中仅22个是必需的，参与DNA合成、转录、裂解，其它60个只是细菌基因的翻版。 颗粒装配基因：53个，其中34个编码结构蛋白，19个编码催化所需的酶和蛋白质因子。

　　其DNA含A、T、G，不含C，C由5-羟甲基胞嘧啶(HMC)取代。HMC在碱基配对上与C相同，只是可以进一步糖基化。T偶数噬菌体DNA中的稀有碱基和它的糖基化可以抵抗细菌中限制酶的切割作用。 T4噬菌体的DNA是线性的，但其连锁图为环状。这是由于末端冗余(terminal redundancy)和循环排列(circular permutation)造成的。 循环排列(环状排列)：指T偶数噬菌体 DNA分子的核苷酸排列虽然是不变的，可是从哪一核苷酸开始则有种种可能。 末端冗余：指T噬菌体 DNA分子的两端有极少数相同的核苷酸的重复。

　　T7噬菌体双链 DNA也有末端冗余，且在两端的160bp几乎完全相同。其 DNA通常不发生环化，但通过末端冗余部分重组可形成线状多联体。

　　(Gp:) 6

　　三、研究噬菌体感染的方法

　　噬菌斑(plague)：大小、形状、透明度和边缘。 一步生长曲线：用来测定烈性噬菌体侵染和成熟病毒体释放的时间间隔，并用以估计每个被侵染的细胞释放出来的新的噬菌体粒子的数量的生长曲线。该曲线可以用来确定噬菌体的潜伏期、裂解期和裂解量。 单菌释放实验(single burst experiment)：测定单个细菌所释放的噬菌体的数量。T1的单菌释放量一般是100~200。 感染复数(multiplicity of infection，MOI)：单个宿主细菌细胞感染的噬菌体颗粒数，即实验时所用噬菌体颗粒数与宿主细胞数的比值。

　　四、噬菌体的突变型

　　宿主范围突变型: 细菌细胞表面的专一受体上如果发生改变，有可能使噬菌体不能附着，从而该噬菌体的寄主范围就缩小。 噬菌体突变也可以扩大寄生范围。 T2噬菌体的h-突变体 E.coli B E.coli B/2 E.coli B+E.coli B/2 h+ + - 半透明噬菌斑 h- + + 透明噬菌斑 2) 噬菌斑形态突变型: 侵染寄主后溶菌速度的快慢而形成大小不同的噬菌斑(plaque); 被感染细菌是全部或是部分被杀死而形成清晰或混浊的噬菌斑。 (1). r+ 小噬菌斑,边缘模糊 (2). r- 大噬菌斑,边缘清晰: 快速溶菌(rapid lysis，T噬菌体r突变体)

　　3) 条件致死突变型: (1). 温度敏感突变 热敏感突变型ts：30℃增殖，40~42℃不能形成 噬菌斑。 冷敏感突变型cs：在“ 限制温度”下不稳定而丧 失活性。 (2). 抑制因子敏感突变 (sus) sus突变噬菌体感染一种寄主菌(带有抑制基因su+，许可条件)时能产生子代，但感染另一种寄主菌(无 抑制基因su-，限制条件)时不能产生子代。

　　抑制因子敏感性突变型( suppressor sensitive mutant )：通过抑制而使表型得以回复的突变型。一般多指无义突变型。简称sus突变型。

　　例如：噬菌体mRNA基因 细菌tRNA基因反密码子 正常 突变 突变 正常 基因：5`TAC 3`?5`TAG 3` 3`ATC 5`?3`ATG 5` ? ? ? ? mRNA 5`UAC 3` 5`UAG 3` 3`AUC 5` 3`AUG 5` ? ? 表型：酪氨酸 终止 5`UAG 3`

　　?酪氨酸

　　?酪氨酸

　　3`AUC 5` ?酪氨酸

　　携带不同专一性抑制基因宿主中sus突变噬菌体的表现

　　噬菌体的抑制因子敏感突变型类型及表现 琥珀型(amber)UAG 赭石型(ocher)UAA 乳白型(opal) UGA

　　五、重组测验(recombination test)

　　1. T4噬菌体突变型

　　Benzer等从T4噬菌体中分离获得数千个迅速裂解(rapid lysis)突变株，它们位于T4染色体DNA的不同区段，能使所侵染细胞迅速裂解形成比野生型大的噬菌斑，分别称为rⅠ，rⅡ，rⅢ等。这3组突变型由于在大肠杆菌不同菌株上的反应不同可以相互区别 。

　　Benzer利用两个rⅡ不同突变型如r47+和+ r104在许可条件下进行双重感染，即同时侵染大肠杆菌B菌株，形成噬菌斑后收集溶菌液，将此溶菌液等分两份，一份再接种大肠杆菌B菌株，在大肠杆菌B菌株的细胞中r47+、+r104、r47r104、++都能生长，因此在此平板上可统计噬菌体的总数; 另一份溶菌液接种于大肠杆菌K(λ)菌株中倒平板，在这里，只有++重组子才能长。

　　2、重组测验(recombination test)

　　T4 rⅡ不同突变子之间重组频率的测定

　　由于rⅡ双重突变的交互重组子r47r104不能生长，所以无法检出，但是它的频率和++相等，因此估算重组子数要把++数乘以2，代入公式：

　　图距(map distance):指两个基因在染色体图上距离的数量单位，某两个基因间的距离为一个图距单位(map unit, mu)即表示重组值为1% 。后人为了纪念现代遗传学的奠基人摩尔根，将图距单位称为"厘摩"(centimorgan, cM)。假设两基因a-b间的重组率为17%，即这两个基因相距17个图距单位(17cM)。

　　图距=重组频率*100

　　这一测定方法称为重组测验(recombination test)，它是以遗传图的方式确定突变子之间的空间关系。这种方法测定重组频率是极其灵敏的，即使在106rⅡ噬菌体中只出现一个rⅡ+重组子，也可通过感染大肠杆菌K(λ)菌株的平板检查出来。 实际上所观察的最小重组频率为0.02%，即0.02个图距单位，还没有发现小于这个数值的重组频率。也有可能所观察的最低重组频率与假定相邻核昔酸对可以重组的预期值是接近的。

　　T4 rⅡ突变位点间距离的测定

　　T4染色体有1.69×105核苷酸对，其长度为1500个图距单位，因此0.02个图距单位约等于2个核苷酸对，即(0.02/1500)1.69×105=2.2核苷酸对。这当然是粗略的估算，即使如此，也有理由认为基因内相邻核苷酸位置上的突变是可能重组的。至于有些rⅡ点突变之间不产生重组子，有可能是同一核苷酸对的不同改变。由此可见重组子的单位可小到相当于一个核苷酸对。

　　T4 rⅡ的遗传学图

　　六、互补测验(complementary test)

　　互补测验是确定突变的功能关系的一种常用方法。用不同的rⅡ突变型成对组合同时去感染大肠杆菌K(λ)菌株。如果被双重感染的细菌中产生两种亲代基因型的子代噬菌体(也有少量重组型的噬菌体)，那么就必然是一个突变型补偿了另一个突变型所不具有的功能，这两个突变型就称为彼此互补(complementation)。如果双重感染的细菌不产生子代噬菌体，那么这两种突变型一定有一个相同功能受到损伤。

　　1. 互补测验的原理

　　突变噬菌体之间的互补作用

　　2. 互补测验的方法

　　斑点测试法(spot test)：用一种rⅡ突变型以0.1的感染比(噬菌体1/细菌10)去感染大肠杆菌K(λ)菌株。噬菌体和细菌在温热的琼脂中混合，涂布在营养平板上，琼脂凝固后，在平板上所划出的一定位置上再加一滴含有另一种rⅡ突变型的培养基，在这一滴培养基的范围内，一些细菌就会被两种噬菌体所感染。如在这范围内形成噬菌斑，就证明这两种突变型互补，相反就不能互补。在一个培养皿平板上可做6～8个斑点试验。 互补测验的结果发现，除了一些缺失突变型外，rⅡ突变型可分为rⅡA和rⅡB两个互补群。

　　3. 互补测验的遗传学分析

　　反式排列：用于互补测验中所用的两个突变型，如果分别位于两条染色体上，这种组合方式称为反式排列。 顺式排列：如果两个突变同时位于一条染色体上，则称为顺式排列。 顺反子：将不同突变之间没有互补的功能区称为顺反子，顺反子就是一个功能水平上的基因。

　　在互补测验中，两个隐性突变如表现出互补效应，则证明这两个突变型分别属于不同基因;如不能表现出互补，则证明这两个突变型是在同一基因内。 顺式排列只是作为对照，因为在顺式排列中，不论是两个基因的突变，还是同一个基因内两个位点的突变，在互补测验中均表现出互补效应。 这也就是说，对于不同基因间的突变型在互补测验中，不论是顺式还是反式排列均表现出互补效应;但如果是属于同一基因的不同位点的突变，则顺式构型表现互补，反式构型则不能互补。

　　互补作用：指两个突变型染色体同处于一个细胞中，由于相对的野生型基因的相互补偿而使表型正常化的作用。 如果说重组是DNA-DNA直接的相互作用，那么互补则是在基因表达水平上的作用。 进行互补测验必须两个突变型染色体同处一个细胞(二倍体或局部合子)，而且它们之间不发生重组或者只发生可忽略不计的极少重组，或者虽有重组发生但可以和互补结果区分开来，否则将无法判断表型正常化是重组的结果还是互补的结果。

　　噬菌体能正常繁殖，大部分噬菌体是rⅡA或rⅡB突变型，少数是野生型和双突变体重组型。

　　4. 基因内互补(intragenic complementation)

　　在互补测验中已知，一般情况下同一顺反子内两个突变是不能互补的，但是也有一些例外，这种例外发生于同一基因内两个不同位点突变致使两条原来相同的多肽转变成两条分别在不同位点上发生变异的多肽链，而后将这两条多肽构成双重杂合子，这两者配合起来，有可能表现出程度不同的恢复酶活性部位，这种现象称为基因内互补。 这可能是由于有些突变所影响的多肽区域是作为亚基而相互起作用的，而有些突变所影响的多肽区域是作为活性表达所必须的，但不参与亚基的相互作用 。

　　基因内互补作用机理

　　虽然基因内互补对互补测验存在一定的干扰，但通过进一步研究发现，基因内的互补作用与基因间的互补作用是可以区分开的： ①任何两个不同基因突变总是互补的，即基因间互补是普遍存在的，而同一基因内不同位点突变绝大多数是不能互补的，只有少数例外; ②基因内两个突变能互补的也只能是点突变，无缺失，这种突变一定是错义突变，决不是无义突变或移码突变; ③基因内互补作用的酶活性往往明显低于正常水平，最多只有野生型酶活性的25%，同时所形成的蛋白质也常有某种异常，例如温度的稳定性或pH依赖性等。

　　缺失的特点： 多bp的缺失; 具不可逆性; 有部分相同缺失突变型间不能通过重组恢复野生型表型。 缺失作图的优点：简便、精确 缺失作图的条件：要有大量已知的缺失突变型。 缺失作图的原理 把待测突变型和一系列缺失突变型分别进行重组测验，凡是能重组的，点突变一定不在缺失区内;凡是不能重组的，点突变一定在缺失区内。

　　七、缺失作图(deletion map)

　　1 将待测点突变(X)先与几个最大的缺失突变体 分别杂交，从中找出最小不重组和最大可重组 缺失突变; 2 从最小不重组区(PB242)中减去与之重叠的最 大重组区(A105)=点突变的位置(A5区内); 3 将点突变与A5区内的几个缺失突变体分别杂交 根据结果确定：点突变就在A5区内的c2区内。

　　缺失作图的方法

　　C2

　　第二节 λ噬菌体

　　温和噬菌体代表——λ噬菌体

　　Electron micrographs of phage lambda (left) and the DNA isolated from it (right).

　　双链线性DNA，由48.5kb构成,编码66个基因。 7个头部基因(必需基因：相邻) 11个尾部基因(必需基因：相邻) 噬菌斑形成必需的基因 复制所需基因：O、P 裂解、释放所需基因：S、R 基因 正调控基因：N、Q 附着区：att; 整合与切割所必需：int、xis 噬菌斑形成非必需的基因 溶源化所需：cI、cII、cIII 重组所必需：exo、red

　　一、?噬菌体的基因组：

　　左臂区：A~J，头部和尾部所必需的全部基因。 中间区：介于J与N之间，又称非必需区，与噬菌斑形成无 关，包括了一些与重组、整合及切割有关的基因。 分子克隆中，常将该区域由外源基因取代。 右臂区：位于N基因右侧，包括调控基因( cI、cII、 cro)，复制基因(O，P)以及溶菌基因(S，R)。

　　?噬菌体基因组上的7个启动子： PL和PR分别负责左向和右向转录， PRE和PRM负责cI基因的转录，分别负责建立和维持溶源; PI启动int基因的转录; P’’R负责晚期基因的转录; PAQQ蛋白反义RNA启动子。 黏性末端：双链?DNA分子的两端，各有一条由12bp组成的完全互补的5’单链突出序列，即为黏性末端。由黏性末端结合形成的双链区段称作cos位点(cohesive-end-site)。

　　(Gp:) 溶源化途径

　　二、?噬菌体的生活周期

　　溶源途径：λ噬菌体感染大肠杆菌之后，可将其基因组整合到细菌染色体上，并成为细菌基因组的一部分，随染色体DNA 的复制而复制，这一过程称为溶源途径。 溶源细菌：整合有噬菌体基因组的细菌。 原噬菌体(prophage)：整合到细菌染色体上的噬菌体叫做原噬菌体。 免疫性：溶源性细菌一般不被同种噬菌体再侵染的现象。免疫是由一个原噬菌体的整合而建立的。所以，通常一个细菌基因组只包含任何类型的一个原噬菌体的一个拷贝。 溶菌途径： λDNA进入细胞后，利用寄主的酶和原料进行自身复制并形成噬菌体颗粒，最终使宿主裂解而死亡，这一过程称为裂解循环或溶菌途径。 诱导：溶源性细菌受某些外界理化因素的作用，原噬菌体可以脱离细菌染色体而进行自主复制，最终导致细菌裂解，游离出大量噬菌体，这一过程称诱导。

　　三. λ噬菌体的复制

　　感染早期：环形的λDNA形成后即进行θ型复制。 复制起点：位于O 基因内部，包含3个部分---由4个高度保守的19bp组成的同向重复序列，称ori重复序列;约40bp 富含A/T的序列;28bp的回文序列，中间4bp为不对称部分。 复制蛋白：病毒蛋白O、P，类似于E.coli 的 DnaA 和 DnaC; DnaA 和DnaC 以外的所有E.coli 复制蛋白。 感染后期： θ型复制持续约16min 后，发生滚环复制。gam 和 red 基因产物是两种复制方式发生转换的开关。滚环复制产生出由一系列线性λDNA 组成的多连体分子。多连体被包装进入头部时，入口处的A蛋白专门识别cos位点并进行切割，使进入头部的DNA分子具有同样大小及相同的cos末端。

　　Genetic map of λ cyclized by pairing at the cos sites, shown at the top. The positions and directions of transcription from some promoters are shown in blue.

　　Overview of replication of phage λ. The E. coli gene products involved are outlined in blue.

　　四. λ噬菌体基因的转录和调控

　　λDNA进入宿主细胞后由两个黏性末端连接成环形，立即利用宿主RNA酶开始转录。转录过程分3个阶段：前早期(immediate early stage) 后早期(delayed early stage ) 晚期(late stage)

　　1. 前早期转录 从两个早期启动子PL和PR起始。这两个启动子分别位于阻遏基因cI的左侧和右侧。 左向转录终止于tL1位点，产生编码N蛋白的mRNA。 右向转录终止在tR1位点，产生编码Cro蛋白的mRNA。 ▼

　　2. 后早期转录 N蛋白：正调节蛋白，介导抗终止作用，实现前早期转录向后早期转录的转换; 结合于右向转录的nutR区，并结合到RNA聚合酶上，中和宿主编码的终止因子ρ的活性，使右向转录通过终止子tR1、tR2，从而转录出复制基因O、P和调节基因Q、cⅡ; 结合于左向转录nutL位点及RNA聚合酶上，使左向转录通过终止子tL1，转录出cⅢ、int、xis、gam基因。 Cro蛋白：同操纵基因OL和OR结合，关闭PL和PR起始的转录作用。 ★

　　3. 晚期转录 Q 蛋白：抗终止子，担负着从后早期向晚期转录的开关作用，与晚期基因的转录有关。需要特殊的识别信号qut及宿主NusA蛋白。 晚期转录由PR’启动子启动，需要Q蛋白的激活。是最强的λ启动子，它控制着所有裂解功能的表达，包括头和尾的形成、DNA的包装以及宿主细胞的裂解等。

　　?噬菌体的早，晚期转录

　　★ ? ◆ ?

　　(Gp:) qut

　　裂解性感染粗分为以上三个时期，每套基因都含有为下套基因表达所需的调控因子，利用这些连续控制形成一个级联反应。这种调控物可能是以一种新的RNA 聚合酶形式，用σ因子改变宿主RNA 聚合酶的特异性方向，或是抗终止作用使RNA 聚合酶可以转录新的基因群。

　　抗终止作用

　　N蛋白 能够阻碍依赖于ρ因子的终止子tL1、tR1和tR2的终止作用，其抗终止信号有两个，即nutR、nutL，nut即为蛋白质N利用位点的意思(pN utilization)。N生成以后，首先结合于nut位点，当RNA聚合酶通过该位点时，它便与聚合酶结合，并与核心酶的β亚基发生作用，修饰了聚合酶的构象，使之不再理睬终止子。 nut位点含有两个序列元件，称为A盒(boxA)和B盒(boxB)。A盒在细菌的操纵子中也存在，它在噬菌体和细菌的操纵子中对于抗终止是必须的。B盒只存在于噬菌体基因组中。

　　抗终止作用还涉及到细菌蛋白：nus位点编码的蛋白NusA、NusB、 NusE和NusG，nusE编码核糖体蛋白S10，它在30S亚基中的位置与它在终止中的功能之间没有什么明显的关系。N在ρ依赖性终止子上的抗终止需要所有4种Nus因子的功能。 NusA结合于RNA聚合酶的核心酶上，但不结合全酶。当σ因子加到α2ββ’NusA复合体上时，NusA 蛋白被取代下来。 NusA 与核心酶的结合在于促进转录的终止。 NusA使N和核心酶之间相连结，N 作为一种反终止蛋白通过阻止NusA发挥其功能。N 的突变可以通过nusA突变而得到恢复;而且这两种蛋白在体外能相互结合。N是一种小分子(13.5KD)强碱性蛋白，而NusA 为~55KD的酸性蛋白。NusA和N可能很快地结合成转录复合体。其实若没有宿主的蛋白(包括NusA)，N是不能对RNA聚合酶起作用，使其通过nut位点的。

　　Sequences of the nutL and nutR regions of bacteriophage λ. Box A, box B, and box C are underlined in blue. The twofold rotational symmetry in box B that causes a hairpin to form in the mRNA is shown as arrows of opposite polarity in blue.

　　Q蛋白 Q是噬菌体调节蛋白，在噬菌体感染的晚期，它阻止转录终止。qut序列是Q作用所需要的，它位于晚期转录单位的起始处。qut的上游部分位于启动子中。下游部分位于转录区的起始处，这意味着Q的作用涉及到DNA的识别。? Q的基本作用是干扰停顿，一旦Q作用在RNA聚合酶上，这个酶就明显地在所有位点减少停顿，包括在ρ依赖性终止位点和内部终止位点。所以Q并不直接地作用终止子本身，但它可以使酶急速地通过终止子。这样就消除了核心酶或附加因子产生终止的机会。

　　Functional regions of σ 70 . There are four major regions of sequence onservation in the σ 70 family; they are divided into subregions as shown. Region 1.1 is not conserved in all sigma factors. Also shown are regions functional in promoter recognition.

　　Abortive transcription and RNA polymerase escape from the promoter. RNA polymerase can escape from the promoter only if more than 10 or 11 nucleotides are polymerized. At 12 nucleotides, the RNA transcript displaces the σ3.2 region, which blocks the active-site channel. Abortive transcription results when short, newly synthesized transcripts are released, and the complex returns to the RPo state. With RNA polymerase escape, σ is released, and transcription elongation can continue.

　　五. 溶源途径和裂解途径的遗传调控

　　一般地，如果宿主细胞生长在丰富培养基上，λ噬菌体进入裂解循环;对数期以后的细菌和培养在缺乏碳源的培养基中的细菌为寄主时有利于溶源化。

　　噬菌体进入裂解循环还是整合到寄主染色体上形成溶源态，主要取决于CI蛋白和Cro蛋白的合成及其调控作用。

　　1. λ噬菌体的调控区

　　启动子：与调控有关的基因或位点集中在cⅡ和cⅢ之间，这一区域称为调控区。该区内有4个启动子，即右向启动子PR，左向启动子PL、PRE和PRM。 操纵基因：各含大约80bp的左向和右向操纵基因OL和OR，每个操纵区有3个结合位点，分别为OL1、OL2、OL3和OR1、OR2、OR3，每一位点17bp，3个位点的碱基顺序相似。CI和Cro都能与操纵基因OL和OR结合。

　　2. 调节基因cI和cro

　　cⅠ基因和溶源途径的遗传控制

　　1) CⅠ 蛋白的功能 cⅠ基因编码阻遏蛋白，它的突变使溶源性不能建立而进入裂解循环。 2)CⅠ 蛋白的结构：236个氨基酸组成，包括两个结构域： N末端结构域，1-92aa，提供与操纵基因结合的位点; C末端结构域，132-236aa，负责二聚体的形成。阻遏蛋白只有二聚体形式才能结合DNA;

　　阻遏蛋白的N 端和C 端形成独立的结构域，C 端结构域连接在一起形成二聚体，N 端结构域结合DNA。每一结构域都能独立于另一个结构域发挥作用。与DNA 特异接触的信息包含在N 末端结构域内，但结合效率因C 末端的附着而增强。

　　CⅠ蛋白的N端含有5个?螺旋,第2和第3个?螺旋形成HTH(螺旋-转角-螺旋)

　　在DNA 结合的双螺旋模型中，每个单体的螺旋3 位于同一面的DNA 大沟中，而螺旋2 跨过该大沟。螺旋-3 和DNA之间的接触是依靠氨基酸侧链与暴露位置的碱基对之间形成氢键。此螺旋负责识别特异的靶DNA 序列，因此被称为识别螺旋(Recognition helix)。螺旋-2与DNA的接触是采用与磷酸骨架形成氢键的方式。

　　3)CⅠ 蛋白对操纵基因不同区域的亲和性及其调控功能 CⅠ阻遏蛋白可独立结合在OL和OR操纵基因上，结合在OL上有负调控功能，结合在OR上有正调控和负调控功能; 在每个操纵基因上，位点1对CⅠ比其它位点有更大的亲和力。阻遏蛋白-操纵基因的结合是协同的，因此一旦一个二聚体与第一个位点结合，第二个二聚体与邻近位点的结合就更为容易。 由于OL1和OR1多少分别与PL和PR的RNA聚合酶结合位点中心相重合，因此CⅠ蛋白结合OL1-OL2和OR1-OR2，从物理上阻止了聚合酶接近相应的启动子，从而关闭了PL和PR开始的早期转录作用(负调控)。 CⅠ二聚体结合OR2后，促进RNA聚合酶结合PRM启动子，因此有激活自身转录的作用(正调控)。

　　阻遏蛋白与聚合酶的相互作用使聚合酶从封闭型复合体转变成开放型复合体。蛋白质与蛋白质的相互作用可以释放能量用于帮助转录起始。

　　螺旋2上具有正调控区，此区靠近RNA聚合酶及DNA上的磷酸化位点

　　每个操纵基因都含有3 个阻遏蛋白结合部位。每个结合位点都是一个17bp 的序列，而且围绕其中心碱基对呈部分对称性。操纵基因内的结合部位由含3~7 个富含AT 碱基对的间隔隔开。阻遏蛋白二聚体在每一结合位点都是以对称性形式结合，所以单个N 末端结构域接触半个结合部位。

　　4) cⅡ和cⅢ这对调控产物是启动阻遏蛋白合成所必需的 作为正调控物的cⅡ和cⅢ基因，其产物对CⅠ蛋白合成系统是必须的，为的是摆脱自体调控回路不能重新从头合成的困境。◆

　　4) cⅡ和cⅢ这对调控产物是启动阻遏蛋白合成所必需的 CⅠ蛋白的合成是通过CⅡ蛋白激活和RNA聚合酶结合在PRE上的转录：PRE和PI启动子在没有CⅡ时不能起始转录，因为它们在-10区和-35区缺乏保守序列。 ? CⅡ还能阻碍Q基因的表达：它发起了从启动子Panti-Q的转录，这个启动子位于Q基因内。这个转录物是Q区域的反义转录，而且与Q基因的mRNA杂交，来阻止Q 蛋白的翻译。因此， CⅡ蛋白在决定溶源与裂解途径之间起关键作用。? CⅡ蛋白在体内极端不稳定，因为有一种HflA 的宿主蛋白质使它降解。CⅢ的作用是保护CⅡ抗拒这种降解。?

　　从启动子PRE转录的直接作用是翻译出阻遏蛋白CⅠ ，另外，其转录在cro 基因处以“错误”的方向经过。所以RNA的5’端对应的是cro的反义转录;实际上，它与真正的cro的mRNA 杂交。在PRE转录物上的编码区非常有效地翻译，事实上，阻遏蛋白的合成从PRE的表达是从PRM的约7-8 倍。 ?

　　5)溶源化的维持 CⅠ与左右操纵子OL和OR的结合，使得噬菌体的其它基因被关闭，PRE启动子也失去活性，不能继续启动cⅠ基因的转录而维持溶源状态。 能使溶源状态维持的启动子是PRM，它的激活是由于阻遏物二聚体协同地结合在位点OR1-OR2上产生的。 当细胞内阻遏物浓度过高时，便会与OR3结合，从而覆盖了PRM启动子，阻止其转录。

　　溶源化的建立和维持

　　cro基因和裂解途径的遗传控制

　　1)Cro抗阻遏蛋白的结构与功能 双重功能： 阻止阻遏蛋白的合成(如果裂解周期继续进行，这种作用是必须的)，也就是，它阻止经由PRM的转录; 关闭前早期基因的表达(在裂解周期后期是不需要的)。 结构：66个氨基酸残基构成，小分子二聚体。

　　2)对操纵基因不同结合位点的亲和力 Cro对位点3的亲和力大于位点2和1，所以首先与OL3和OR3结合; Cro 与OR 3 结合抑制了RNA 聚合酶与PRM的结合。所以Cro 的第一个作用就是阻止溶原维持回路的运转。 此后，Cro与OR2或OR1结合。它对这两个位点的亲和力相似，而且没有协同作用。它无论结合在哪一个位点上都足以阻止RNA聚合酶利用PR。并进而停止产生早期功能基因(包括Cro 自身)。 由于CⅡ不稳定，PRE的使用也被停止。因此Cro 的这两种作用完全阻断了阻遏蛋白的合成。 Cro和CⅠ相互拮抗，其中心是解决溶源和裂解发育之间的平衡。

　　以双螺旋方式与DNA接触的两个蛋白识别λ噬菌体操纵基因的情景，亲和性由螺旋3 的氨基酸序列决定

　　3.溶原与裂解之间存在微妙的平衡

　　建立溶原的起始活动是CⅠ在OL1 和OR1处的结合。第一个位点的结合将使另一个阻遏蛋白二聚体在OL2 和OR2 处的协同结合快速成功。这就关闭了Cro的合成，并开始经由PRM进行阻遏蛋白的合成。 进入裂解周期的起始活动是Cro在OR3处的结合。这就阻止了溶原维持回路在PRM处的开始。接着，Cro必须与OR2或OR1，以及OL2 或OL1 结合，以降低早期基因的表达。 通过停止合成CⅡ和CⅢ，关闭了经由PRE的阻遏蛋白的合成。当不稳定的CⅡ和CⅢ降解时，阻遏蛋白新建回路就被关闭。 溶原与裂解间转变的关键因子是CⅡ。如果CⅡ有活性，经由PRE的阻遏蛋白的合成是有效的，结果，阻遏蛋白获得占据操纵基因的能力。如果CⅡ没有活性，阻遏蛋白的合成失败并且Cro 与操纵基因结合。

　　六. 溶源与溶菌途径和寄主基因表达的关系

　　1. 营养状态

　　营养丰富时，寄主hfl( hfl代表高频率的溶原化)基因编码的蛋白水解酶水解CⅡ，促进溶菌; 营养枯竭时，cAMP-CAP增加，hfl关闭，促进溶源; 寄主himA基因编码整合酶的一个亚基，对整合必不可少。

　　2. MOI值的高低

　　MOI较低时，有利于裂解循环;反之，有利于溶源途径。

　　3. 细胞紧急状态

　　理化因子的处理、SOS反应、损伤DNA激活RecA，引起CⅠ切割;同时，RecA还可代替Xis切割酶的作用，切割原噬菌体脱离寄主染色体。

　　七. λ噬菌体的溶源化和诱导

　　λ噬菌体的整合 Int：整合酶，特异性地促进λ噬菌体的附着位点attP(attachment phage)与细菌附着位点attB(attachment bacteria)之间的重组。 Int促进的重组属于位点特异性重组(site-specific recombination)，attP和attB之间只有15bp的相同序列：GCTTT(TTTATAC)TAA，这个序列被称为核心序列，简称O，重组常常发生在括号中的7个序列。O两侧的序列在attP和attB中各不相同，位于attB两侧的序列称为B和B’，位于attP两侧的序列称为P和P’。

　　2. λ噬菌体的诱导和切割

　　UV可激活RecA蛋白，活化的RecA蛋白与CⅠ蛋白结合，引起CⅠ蛋白自我切割，从而使两个末端结构域分离， CⅠ失去阻遏作用 PL和PR开始转录，PL转录的基因包括int和xis， λ的切割需要Int和Xis(切割酶excisase)，并通过位于原噬菌体DNA和细菌DNA接合处的杂合序列attP-attB之间的重组进行切割。

　　Steps leading to lytic growth and lysogeny

　　Summary

　　1. Phages have a lytic life cycle, in which infection of a host bacterium is followed by production of a large number of phage particles, lysis of the cell, and release of the viruses.  2. Lytic infection falls typically into three phases. In the first phase a small number of phage genes are transcribed by the host RNA polymerase. 3. In phage lambda, the genes are organized into groups whose expression is controlled by individual regulatory events.

　　4. Each operator consists of three binding sites for repressor. 5. The helix-turn-helix motif is used by other DNA-binding proteins, including lambda Cro, which binds to the same operators, but has a different affinity for the individual operator sites, determined by the sequence of helix-3.6. Establishment of repressor synthesis requires use of the promoter PRE, which is activated by the product of the cII gene.

　　Summary

　　第三节 反转录病毒

　　反转录病毒(retroviruses )是一类单链RNA病毒，其基因组RNA是在反转录酶的作用下，经过双链DNA中间体，再进行复制。 反转录病毒的生活周期中有一个和转座类似的过程，使双链DNA插入到宿主基因组，并使DNA靶位点产生短的正向重复序列。 大多数反转录病毒都具有致瘤性，重要的反转录病毒有：HIV、引起禽类Rous肉瘤的RSV病毒、引起小鼠白血病的MLV-F(Friend)、MLV-M(Moloney)、MLV-R(Rauscher)病毒。

　　逆转录病毒的共同特性： 1.病毒为球形，有包膜，表面有刺突，(与病毒的吸附和穿入有关)。 2.基因组为单正链RNA双体结构。 3.病毒体含逆转录酶。 4.具有gag、pol、env三个结构基因。 5.病毒增殖的突出特点是在复制病毒RNA时要通过DNA复制中间型(DNA replicative intermediate)，并与宿主细胞的染色体整合。

　　一、毒粒结构

　　脂质包膜：外膜蛋白(SU)、跨膜糖蛋白(TM)突起 基质蛋白(MA)：位于包膜内表面 衣壳：二十面体对称结构，由衣壳蛋白(CA)构成 核心：含两条相同的正链RNA形成的基因组双体结构、核酸结合蛋白(NC)即核蛋白、反转录酶(RT)、整合酶(IN)、蛋白酶(PR)。

　　二、生活周期

　　1. 吸附、穿入与脱壳：病毒粒子侵染细胞，病毒RNA和反转录酶一起进入细胞。 2. 逆转录：RNA被反转录成双链DNA(前病毒)，环化，进入细胞核。 3. 整合：反转录病毒的DNA整合到宿主染色体DNA中。 4. 复制、转录：前病毒DNA进行复制，转录出功能基因、基因组RNA和病毒蛋白。 5. 装配、芽生：基因组RNA和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子，转移到质膜，通过出芽方式释放新病毒粒子。

　　三、反转录病毒的基因组

　　基因组RNA的长度为5~8kb; 具有二倍体基因组：由两条相同的正链RNA在5’端附近通过氢键连接形成的双体结构，这2条RNA分子又叫做38S RNA链; 单体RNA为正链，相当于真核mRNA，并具有与其相似的5’端帽子结构和3’端的poly(A)尾巴; 小分子RNA：大多数为tRNA，少数为rRNA。tRNA 3’端含有与基因组RNA 5’端互补的核苷酸序列，在反转录病毒复制过程中，tRNA 3’端的这一序列可以作为基因组正链RNA反转录合成DNA的引物; 5’端和3’端各有一段相同的、10~80bp的、称之为R的正向重复序列;R内侧，5’端有一个80~100bp的U5顺序(unique to the 5’ end)及一个tRNA引物结合位点PBS， 3’端有一个170~1250bp的U3顺序; 含3个结构基因：gag-po1-env。

　　四、反转录过程及整合

　　1. 反转录过程中DNA双链的合成和LTR的产生

　　反转录酶以病毒基因组RNA为模板，进行双链DNA的合成。在此过程中发生了2次跳跃，最后产生出具有长末端重复序列LTR的双链线性DNA。

　　在反转录中通过模板转换产生负链DNA

　　(Gp:) PBS

　　(Gp:) R U5

　　(Gp:) U3 R

　　(Gp:) R U5

　　(Gp:) R U5

　　(Gp:) U3 R

　　(Gp:) U3 R

　　(Gp:) R U5

　　(Gp:) U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　正链DNA的合成需要第二次跳跃

　　(Gp:) U3 R

　　(Gp:) U3 R

　　(Gp:) U3 R U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　(Gp:) R U5

　　(Gp:) R U5

　　(Gp:) U5

　　(Gp:) U5

　　(Gp:) U5

　　(Gp:) U5

　　(Gp:) U5

　　(Gp:) U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　(Gp:) U3 R U5

　　2. 病毒线性DNA整合到寄主细胞基因组

　　病毒的整合酶可作用于反转录病毒线性DNA和靶DNA，它使线性DNA的末端靠拢并切去两个LTR 3’端的2个碱基，产生黏性末端;同时，对寄主的靶位点进行交错切割，切点相距4-6bp。 整合后，原病毒在每个LTR末端丢失2bp，在插入区两端有来源于细胞DNA的6bp正向重复。 原病毒的整合作用与噬菌体DNA的不同。噬菌体DNA整合的结果，它的DNA序列既没有丧失也没有增多;而原病毒在整合过程中，其末端序列有少量的丧失，又有大片段的LTR DNA的重复，发生了微妙重排，但它的遗传信息量即编码区序列并没有丧失。

　　反转录病毒整合入宿主DNA中的分子机制，其本质是转座

　　反转录病毒RNA的末端是正向重复序列。反转录病毒线性DNA的末端是LTRs，整合到宿主DNA中时，两端各丢失了2 bp。

　　五、原病毒的基因表达

　　1. 病毒基因的转录

　　反转录病毒只有整合到宿主染色体DNA后才能被转录，转录产物经拼接可以产生不同的病毒mRNA。 原病毒能够利用细胞的转录系统如RNA聚合酶Ⅱ合成mRNA，如大部分真核细胞的转录一样，其转录也需要启动子和增强子。 LTR对前病毒DNA整合到宿主染色体上以及整合后的转录均起着重要作用。 5’-LTR含有转录起始信号，使整个基因组转录成一个全长的RNA分子;而3’-LTR则含有一个使病毒RNA转录本多聚腺苷酸化的信号。

　　LTR序列事实上是一种完整的调节区，含有反转录病毒 DNA基因组表达活性所需要的全部调节元件。

　　2. 转录后加工与翻译

　　整合的原病毒被宿主的转录系统转录为病毒RNA，这个RNA既能充当mRNA 也能作为基因组被包装成为病毒。 它存在两种mRNA：长的mRNA翻译Gag和Po1多蛋白。从起始密码子到第一个终止密码的阅读框翻译成Gag产物。Po1表达一定要越过第一个终止密码子。 不同的病毒采用不同的机制来越过第一个终止密码子，它取决于gag和po1两个阅读框之间的关系。当gag和po1需要连续的时候，通过可识别此终止密码子的Gln-tRNA来抑制，产生单个的一个蛋白。当gag和po1在不同可读框中，核糖体发生移框来产生单个的蛋白。通常连续率约在5%，因此Gag蛋白在数量上胜过Gag-Po1蛋白约20倍。

　　Env是通过另一种机制进行表达，它是将mRNA重新拼接成一个短的亚基因组的(subgenomic)mRNA，翻译成Env产物。 Gag或Gag-Po1和Env两者的产生是多蛋白(polyprotein)，它能被蛋白水解酶切成单个的各种蛋白，存在于成熟的的病毒中，这种蛋白酶的活性是由病毒的各种形式编码的。它可能是gag或po1的一部分，有时又可以一个独立的附加读框存在。 最后，将RNA包装进核心蛋白中，外周包以衣壳蛋白和从宿主细胞膜上取下的片断。病毒是通过和一个新的宿主细胞质膜的融合来感染的，然后将病毒粒子的内容物释放到宿主细胞中。

　　2. 转录后加工与翻译

　　多蛋白：一些蛋白质在合成之初是含有一系列头尾相连的蛋白质的长多肽链，多肽链的水解将裂解释放出各种可能具有完全不同功能的蛋白质，这些蛋白质被称为多蛋白。

　　(Gp:) 整合酶

　　gag 基因编码病毒的核心蛋白质(Nucleoprotein core)，pol基因编码与核酸合成以及重组相关的酶类，env 基因编码病毒外壳蛋白质(Envelope)，外壳蛋白质同时也能从细胞的细胞膜上得到组分。

　　The structure of a? prokaryotic?operon ?of protein-coding genes.

　　本章复习思考题

　　一步生长曲线 、末端冗余、环状排列?噬菌体有哪些突变型? 2. 重组测验的目的?其结果说明什么? 3. 互补测验的原理及其遗传学分析?缺失作图的原理和方法? 4. 什么是intragenic complementation? 与intergenic complementation的区别? 5. 黏性末端? cos位点?与 A蛋白的关系? 6. 溶源途径?溶菌途径?二者之间如何进行遗传调控? 7. CⅠ蛋白的结构和功能?CⅡ和CⅢ在溶源途径中的作用? 8. Cro蛋白的功能?它是怎样阻断阻遏蛋白的合成的? 9. λ噬菌体复制方式的转换? 10. λ噬菌体基因的转录过程及其调控? 11.逆转录病毒的共同特性、基因组特点，为什么称其为正链病毒? 12. LTR的产生及其功能? 13. 反转录病毒基因组、反转录病毒线性DNA及原病毒DNA在结构上有何区别? 14. 什么是polyprotein?请举例说明?