实验五 病毒的接种技术.ppt

　　实验五所需材料

　　1.病毒接种技术： 注射器(18支/班) 病毒悬液用锥蓝染液代替(1支/组，8支/室) 小白鼠(18只/室) 鸡胚(1只/人)

　　实 验 五

　　病毒的接种技术

　　病毒的概念(virus)：是一类体积微小、结构简单、仅有一种核酸，必须用电子显微镜放大几万倍至几十万倍后才能观察到，专性活细胞内寄生，以复制方式进行增殖的非细胞型微生物。 病毒的分离培养

　　动物接种法

　　鸡胚培养法

　　组织细胞培养法

　　1.了解病毒的培养方法 　2.掌握病毒的鸡胚接种及动物接种方法

　　一、实验目的

　　二、动物接种(Animal inoculation)

　　(一) 病毒动物培养法 1.用途：分离鉴定、传代、制备免疫血清。 2.缺陷：带毒，缺敏感动物。 3.常用动物：小白鼠、地鼠、大白鼠、豚鼠、家 兔、猴和羊等。 4.接种的途径：脑内、鼻内、皮内、腹腔内和静 脉注射等。

　　1.实验材料 小白鼠(1~3天或3周龄，2人/只) 乙型脑炎病毒悬液(椎蓝染液代替) 1ml注射器(18支) 碘酒 ，棉签，眼科剪等

　　(二)小白鼠的脑内接种

　　1)取病毒悬液：用1ml注射器取0.1ml病毒悬液，去除注射器内的气泡。

　　2)抓取小白鼠(如图)

　　左手拇指和食指握住小白鼠头部，左手手掌轻轻按住小白鼠体部固定在操作台上。

　　2.方法步骤

　　小白鼠腹腔注射抓取方法

　　3)消毒注射部位：右手用棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右侧颞部皮毛(不碰到眼)。 4)接种：右手拿注射器在小白鼠颞部(眼与耳根联线的中点略偏耳朵的方向)穿刺，进入颅腔即可，(一般进针2-3mm)不要插得太深，注射量0.02~0.03ml。 5)观察：注射完毕，将用过的注射器放入煮沸消毒器内，煮沸消毒。实验动物置于防蚊设备的室内饲养，逐日观察动物发病情况。

　　6)结果观察

　　接种3~4天后小白鼠出现耸毛，活动减少或增强，表现出如震颤，绕圈，蜷曲，尾强直或麻痹，直至瘫痪死亡。一般在濒死前解剖开脑组织传代及做病毒鉴定。 (本次实验不做饲养，接种完成可立即处死小白鼠，剪开头部皮肤，打开颅腔观察锥蓝染液的分布，确定穿刺接种是否正确)

　　7)处死并解剖小白鼠

　　三、病毒的鸡胚培养法

　　接种途径 适用于流感病毒，痘类病毒，疱疹病毒，脑炎病毒等的培养，可根据病毒种类选择适宜接种部位，如分离流感病毒常用羊膜腔和尿囊腔同时接种法，而痘病毒常采用绒毛尿囊膜接种法

　　尿囊腔接种法 卵黄囊接种法 绒毛尿囊膜接种法 羊膜囊接种法

　　鸡胚结构示意图

　　(Gp:) 卵膜

　　气　室

　　鸡　胚

　　卵黄囊

　　尿囊腔

　　羊膜腔

　　绒毛尿 　囊　膜

　　卵　白

　　卵膜

　　病毒的鸡胚培养法

　　实验材料： 9~12日龄鸡胚(每人1只) 病毒悬液(椎蓝染色代替) 无菌1ml注射器 锯片，锥子，小镊子，橡皮头，小烧杯等

　　判断鸡胚是否存活

　　眼点，胚胎活动度，大血管等

　　绒毛尿囊膜接种法

　　1.定位：在检卵灯下将胚胎部分及自然气室部分用记号笔画出，在离开胎盘与大血管区画一直径约1cm的等边三角形

　　卵窗

　　2.取卵壳：依次用碘酊，酒精消毒记号处，用锯片将标记三角区卵壳锯穿，(注意勿损伤卵壳下各层膜组织)，用镊子小心取下所画三角形区域的卵壳，(注意卵壳下各层膜组织)，然后用针尖轻轻将暴露的卵膜中心刺破一个小口(不要伤及绒毛尿囊膜)。 3.造人工气室：在自然气室部分消毒后用锥子或大注射器针头在气室正中钻一孔，用橡皮头自气室端小孔将气室中空气吸出，使绒毛尿囊膜下陷形成一“人工气室”

　　4.接种：去除卵膜，用注射器抽取病毒悬液0.2ml,于绒毛尿囊膜上滴上病毒悬液0.1~0.2ml。 5.封口：用胶布封闭两口，胶布事先用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。 6.培养：放入37℃温箱培育4天 7.收获：在人工气室周围用碘酒消毒，用无菌镊子扩大卵窗，轻轻夹起绒毛尿囊膜，并用无菌小剪刀沿人工气室周围将绒毛尿囊膜剪下，放置于加有生理盐水的无菌平皿中观察。

　　本次实验不做培养，接种完病毒，可将鸡胚去除部分卵壳后，小心将卵壳内组织倒入平皿中，观察接种的病毒替代液(锥蓝染液)是否接种部位正确及各膜囊等的组织结构。

　　注意事项

　　消毒小白鼠时不要碰到眼睛 注射时不要扎的太深以免扎到手 磨卵壳及钻孔时力量要适中 看过的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的大烧杯中