乙型肝炎病毒的检测与输血安全.ppt

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　　乙型肝炎病毒的检测与输血安全

　　xx市血液中心 xxx 主任技师

　　一、概况

　　乙型肝炎病毒( hepatitis B virus, HBV)感染是危害人类健康的最严重问题之一，全世界约有3亿HBV携带者，其中我国就有1亿多感染者。我国是肝炎大国,HBsAg阳性率7.18%。抗-HBc(+)阳性率在50%左右。 1992年以来儿童感染乙肝病毒的人数减少了近8000万人，儿童乙肝表面抗原携带者减少了1900万人。 HBV隐匿性感染(OBI)问题严重：在HBsAg阴性人群中可以检出HBV全基因组DNA，其中部分还可以通过输血传播。称为隐匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)。隐匿性HBV感染(OBI)，存在于各类HBsAg 阴性的肝病及其他疾病患者中，与重症肝损伤和肝细胞癌有关。在感染人群中HBsAg(+)DNA(-)占6%，全阳性占85%， HBsAg(-)DNA(+)占9%，其中OBI占8%左右。 HBV我国每年血液检测1300万份以上，每年以10%速度增长。目前我国血液检测以HBsAg检测为主，核酸检测计划今年年底覆盖全国。

　　我国的乙肝疫苗接种

　　我国目前HBV在年龄上的分布情况

　　HBV隐匿性感染(OBI)问题严重

　　流行率高，隐匿性感染者多(1：2000左右). 疫苗接种后的突破性感染(Breakthrough infection)是OBI形成的原因之一。各种突变株的出现，增加了OBI出现的机会抗-HBc血液筛查尚难应用，HBV DNA低滴度，OBI感染者漏检概率大

　　Yield HBV DNA, Occult HBV (OBI) in Asia

　　88%

　　12%

　　我国OBI流行情况

　　1)疫苗接种儿童发生OBI概率高启东，疫苗接种儿童发生OBI的概率为4.2%(Xu L，et al. Vaccine 2010) 武汉，突破性感染儿童OBI占20%，未接种疫苗的患肝炎的儿童OBI占6.7%(胡权，等，中华肝脏病杂志2005) 2) 抗-HBc阳性者OBI比例高青岛，抗-HBc阳性者中OBI占33%(史昌河等，医药世界2007) 深圳，抗-HBc阳性者中OBI占2.86%(Ye x等，Blood transfusion在审) 深圳，疫苗接种抗-HBc阳性者献血者检出约1%OBI(Zheng X ，Ye x等 Transfusion 2014) 3) 献血者中OBI的比例为0.02-0.13% 南京，合格献血者中OBI检出率为0.13%(Liu Y，et al. Virol J 2010) 上海，合格献血者中OBI检出率为0.02%(伍晓菲等，临床输血与检验2011) 台湾，合格献血者中OBI检出率为0.11%(Su TH, et al. Transfus Med 2010) 香港，献血者中OBI流行率为0.11-0.13%(Yuen MF, et al. Gut 2010) 澳门，40149份酶免阴性献血者标本中检出24例(0.06%)OBI(梁婉仪，等，2010成都输血大会) 深圳，合格献血者检出1：3200(Ye x , et al.Transfus Aphersis sci 2013)

　　乙肝病毒表面抗原( HBsAg)阳性 Prevalence of HBsAg in the world

　　< 0.1

　　<0.1

　　0.1-2

　　< 0.1

　　2-10

　　>10

　　2-10

　　1-4

　　乙肝病毒核心抗体( anti-HBc)阳性 Prevalence of anti-HBc in the world

　　< 1

　　2-10

　　< 1

　　15-75

　　> 80

　　15-60

　　5-10

　　(Gp:) Jiangxi

　　(Gp:) Shaxi

　　(Gp:) Chongqing

　　(Gp:) Heilongjiang

　　(Gp:) Jilin

　　(Gp:) Liaoning

　　(Gp:) Inner Mongolia

　　(Gp:) Beijing

　　(Gp:) Tianjin

　　(Gp:) Hebei

　　(Gp:) Shandong

　　(Gp:) Jiangsu

　　(Gp:) Shanghai

　　(Gp:) Zhejiang

　　(Gp:) Taiwan

　　(Gp:) Fujian

　　(Gp:) Guangdong

　　(Gp:) Hainan

　　(Gp:) Guaangxi

　　(Gp:) Yunnan

　　(Gp:) Guizhou

　　(Gp:) Sichuan

　　(Gp:) Tibet

　　(Gp:) Xinjiang

　　(Gp:) Qinghai

　　(Gp:) Gansu

　　(Gp:) Ningxia

　　(Gp:) Shanxi

　　(Gp:) Henan

　　(Gp:) Hubei

　　(Gp:) Hunan

　　(Gp:) Anhui

　　(Gp:) Jiangxi

　　(Gp:) Shaxi

　　(Gp:) Chongqing

　　(Gp:) Heilongjiang

　　(Gp:) Jilin

　　(Gp:) Liaoning

　　(Gp:) Inner Mongolia

　　(Gp:) Beijing

　　(Gp:) Tianjin

　　(Gp:) Hebei

　　(Gp:) Shandong

　　(Gp:) Jiangsu

　　(Gp:) Shanghai

　　(Gp:) Zhejiang

　　(Gp:) Taiwan

　　(Gp:) Fujian

　　(Gp:) Guangdong

　　(Gp:) Hainan

　　(Gp:) Guaangxi

　　(Gp:) Yunnan

　　(Gp:) Guizhou

　　(Gp:) Sichuan

　　(Gp:) Tibet

　　(Gp:) Xinjiang

　　(Gp:) Qinghai

　　(Gp:) Gansu

　　(Gp:) Ningxia

　　(Gp:) Shanxi

　　(Gp:) Henan

　　(Gp:) Hubei

　　(Gp:) Hunan

　　(Gp:) Anhui

　　中国HBsAg阳性率与地区分布 Geographic Distribution of HBsAg Prevalence in China

　　HBsAg Prevalence

　　? 9%

　　4~6%

　　7~8%

　　National Survey for HBV Prevalence, 2004

　　National Survey for HBV Prevalence, 1992~1995

　　1995 2004 2006

　　HBsAg + (%)

　　9.7 9.0 7.2

　　Year

　　乙型肝炎病毒基因型及亚型分布

　　乙型肝炎病毒基因型在亚洲分布

　　在深圳HBsAg阳性献血者可测序166样本中，B基因型所占88%(146/166)，C基因型占11.4% (19/166)，D基因型出现1例.

　　HBV 传播途径Modes of HBV transmission in various areas

　　Mode of transmission NW Europe Mediterranean Asia Africa Vertical 垂直 ± ± +++ + Horizontal - < 5years - - + +++ 水平 - familial - - ± ± Sexual - hetero + ++ + + 性 - homo ++ + - - Blood - IVDU +++ ++ - - 血液 - tattoo/scar. + + ? + - transfusion - ± + + Prevalent genotype 型 A/D D/A C/B E/D/A

　　深圳血液中心结果：在50342例免疫献血者中，经追踪发现2例乙肝性传播的分子生物性证据。

　　二、病毒感染过程

　　遮蔽期(Eclipse phase) 倍增前期倍增期 Ramp-up (exponential increase) 平台期Plateau phase 血清转换后期Post-seroconversion phase

　　遮蔽期的特点

　　血清缺少可检测的病毒. 早期的免疫反应对控制和清除病毒起了一定作用. 有些个体在血清中表现低浓度的病毒,血液循环中有感染的细胞.

　　倍增前期的特点

　　病毒低载量,间或有”脉冲”现象时可被检测到. 病毒缓慢增长. 是否有传染性?

　　平台期的特点

　　免疫系统产生特定B和T-细胞及免疫抗体。感染细胞内的病毒复制受抑制。游离的病毒颗粒受清区除。血清病毒的核酸浓度基本恒定。

　　血清转换后期的特点

　　病毒浓度下降，免疫抗体产生。对持续性感染情况，病毒下降到特定恒定水平。对清除性的感染情况，病毒被清除，但几周或几月内病毒或间或检出。20%-40%HCV感染有病毒清除现象。

　　三、病毒的经输血传染性

　　研究病毒(HIV,HCV和HBV)传染性的方法 1.体外细胞培养:上世纪80年代末进行HIV传染性研究. 2.动物模型方法:大猩猩实验,注入人体病毒株 3.病例调查/单病例回顾性分析 4.系统性输血传染回顾性研究

　　影响输血感染性因素

　　病毒病毒载量病毒基因型病毒变异可检测占感染性颗粒的比例病毒感染所处时期(急性/慢性) 中和抗体中和能力

　　影响输血感染性因素

　　输注因素保存导致病毒减弱复制的程度输入其它含中和抗体的成份受体因素天然或接种获得的免疫力缺少病毒受体人体免疫抑制体重/血容量

　　乙肝病毒输血传播动物实验

　　Minimum infectious dose of HBV in chimpanzees and difference in the dynamics of viremia between genotype A and genotype C 在黑猩猩中HBV最低感染剂量和基因型A和基因型C的病毒血症动态变化的区别 Yutaka Komiya, et al. Transfusion 2008;48:286-294 Chimpanzees were inoculated with preacute-phase inocula containing HBV of genotypes A or genotype C 含有基因型A和基因型C的HBV接种黑猩猩后感染的前急性期

　　乙肝病毒输血传播病例

　　Infectivity of OBIs in Europe

　　Infectivity of blood

　　(Gp:) T = 0

　　(Gp:) high

　　(Gp:) medium

　　(Gp:) low

　　(Gp:) NAT detection limit

　　(Gp:) antibody

　　(Gp:) virus

　　(Gp:) infectivity

　　(Gp:) neutralised

　　(Gp:) infectivity threshold

　　(Gp:) low

　　(Gp:) eclipse

　　(Gp:) NAT

　　(Gp:) serology

　　(Gp:) antigen

　　(Gp:) antibody

　　(Gp:) antigen detection limit

　　Relative infectivity according to stage of the infection natural history

　　四、目前血清学检测存在问题

　　HBsAg：ELISA国产试剂灵敏度(0.5-1ng/ml)和进口试剂灵敏度(0.1ng/ml左右)尚存很大距离，应用国产试剂献血筛查存在较大漏检风险;化学发光法(CLIA)能再缩短2-7天左右窗口期，灵敏度可高达0.005ng/ml，但成本高。 “窗口期”漏检风险,乙肝ELISA窗口期为59天,是免疫筛查漏检主要原因. HBsAg变异株导致漏检. OBI及低滴度慢性感染的漏检。

　　病毒检测方法相关研究HBV DNA水平(汇集数=50 ) ,HBsAg S/CO 值 (PRISM) Minegishi K, et al. Vox Sang 84:287-91, 2003

　　CLIA c/o VL = 2,100 copies/mL 而EIA约在6800 copies/mL

　　105/181 反应 (58%)

　　>1100万的标本测试; RPHA (HBsAg)法的临界值约为13,500 c/mL

　　76 标本的PRISM 无反应

　　181份混样NAT阳性的血样HBV DNA浓度分布和两种HBsAg检测试剂的检测结果

　　乙肝核心抗体(HBcAb)检验

　　有多个报道增加核心抗体检测可提高血液安全 [ROTH，WK，TRANSFUSION.2002，42：869-875]。世界胃肠组织临床指南建议：乙型肝炎血液筛查　HBsAg 、抗HBc和HBV DNA 三项. 美国已作为常规检测，阳性血液不得用于临床;日本采用抗-HBc和抗-HBs综合判断的标准。我国深圳，北京，天津作此方面研究，问题是我国人群阳性率在40%左右。

　　The ARCNET Data Center is a non-regulated data source, intended for research use only. ARCNET数据中心是一个非管制类的数据源，其数据仅用于研究

　　所有无偿全血献血者中的(血筛检测所得)疾病流行情况/年——1995~2006(11月)

　　深圳地区核心抗体阳性合格献血人群HBV DNA检出概况

　　五、乙肝病毒HBV DNA确认方法

　　1.全基因组检测(nested-PCR) 2. pre S/S检测 3.S和BCP/PC的检测

　　OBI标本确认流程

　　系统进化树分析法

　　又称“谱系树”、“进化树”。根据亲缘关系远近,把各类生物排列在有分枝的树状图表上, 随着分子生物学的发展，人们将不同种生物的蛋白质或核酸分子进行分析比较来绘制分子进化系统树，其结果和上述的系统树基本一致。软件：MEGA，MacVECTOR，PHYLIP 通过进化分析获得的综合的序列信息。使用它我们可以编辑序列数据、序列比对、构建系统发育树、推测物种间的进化距离等。可用于基因分型，判断传染源等。

　　基因型分析

　　基因亚型分析

　　Phylogenetic tree of 2 donor samples and 5 recipients of HBV transfusion-transmission from an OBI donor Ivanka Mihaljevic, Zagreb, Croatia

　　传染源分析

　　输血传染乙肝病毒的鉴别方法

　　对献血者和受血病人留样检测，提取病毒DNA。同时进行OBI 全基因组， pre S/S，S和BCP/PC的扩增检测。对阳性结果进行序列测定。对得到的序列同时进行系统进化树分析。若同属一簇，可判定输血传染。

　　经输血传播病毒的残余风险：美国红会

　　经输血传播病毒的残余风险：其他人群

　　? Repeat donors only

　　血液采集

　　血液筛查

　　成分分离