食品中各类微生物检验.ppt

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　　第二章 食品中各类微生物检验

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　　正文： 第一节 食品中菌落总数的测定 第二节 食品中大肠菌群的测定 第三节 食品中金黄色葡萄球菌的检验 第四节 食品中沙门氏菌的检验 第五节 食品中志贺氏菌的检验

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　　正文： 第六节 食品中溶血性链球菌的检验 第七节 食品中病原性大肠艾希氏菌的检验 第八节 食品中变形杆菌的检验 第九节 食品中空肠弯曲菌的检验 第十节 食品中致病性弧菌检验

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　　正文： 第十一节 食品中耶尔森氏菌的检验 第十三节 食品中肉毒梭菌的检验 第十四节 食品中蜡样芽胞杆菌的检验 第十五节 食品中产气荚膜梭菌的检验 第十六节 食品中霉菌和酵母菌的检验

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　　标题： 第一节 食品中菌落总数的测定

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　　正文： 食品中细菌数量越多，则食品腐败变质的速度就越快，甚至可引起食用者的不良反应。如有人认为细菌数量达到100~1000万个/g时，食品就可能引起食用者的食物中毒。 食品中细菌数量越少，食品存放的时间越长。如：

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　　正文： 0℃时菌落数为105cfu/cm2的牛肉，可存放7d;菌落数为102cfu/cm2时， 可存放18d。 0℃时菌落数为105cfu/cm2的鱼可存放6d，菌落数为103cfu/cm2时， 可存放12d。

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　　菌落(colony)：生长在固体培养基上，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞群体。

　　菌落总数(total colony number)：通过平板菌落计数的方法，对被检样品单位重量、容积、面积的活菌在普通营养琼脂平板上形成的菌落进行计数，所得到的所有嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数。是活的细胞总数。

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　　正文： 按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数.所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此,菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

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　　标题： 检验方法

　　正文： 基本操作一般包括 :样品的稀释--倾注平皿--培养48小时--计数报告。 以无菌操作取检样25g(或25mL)，放于225mL灭菌生理盐水玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠) 制成1：10的均匀稀释液。 用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液

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　　正文： 另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL灭菌吸管。 倾注培养 根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。 将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克(每毫升)样品所含菌落总数。

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　　正文： 计数和报告 选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落总数测定标准。 我国饮用水卫生标准： ≤ 100个细菌总数/1mL饮水

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　　标题： 第二节 食品中大肠菌群的测定

　　正文： 一、大肠菌群与食品卫生质量 大肠菌群系指一群在37℃能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。 从种类上讲，大肠菌群包括许多生化及血清学特性均很不相同的细菌，其中有埃希氏菌属，枸椽酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等等。以埃希氏菌属为主。 大肠菌群MPN是指在100mL(或100g)食品检样中所含的大肠菌群的最近似或最可能数。

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　　大肠杆菌

　　(埃希氏菌属 Escherichine)

　　是人类和动物肠道中的正常菌群

　　出生后数小时就进入肠道，并终生伴随

　　以大肠埃希氏菌(E.coli)最为重要

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　　在环境和食品卫生学上， 常被用作粪便污染的检测指标; 作为肠道病原菌污染食品的指示菌。 当然食品中检验出大肠菌群，只能说明有 肠道病原菌存在的可能，两者并非一定平行 存在。但只要食品中检出大肠菌群，则说明 有粪便污染。该食品仍可被认为是不卫生的。

　　卫生学指标

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　　在分子生物学和基因工程实验中

　　重要的实验材料和研究对象

　　大肠杆菌也是重要的实验材料和研究对象

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　　正常菌群，一般不致病

　　1、条件致病

　　某些带有致病基因的血清型，引起肠道感染

　　两大原因可以致病

　　细菌居住部位改变引起的肠外感染;

　　尿路感染最常见

　　2、致病菌株

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　　日本再度发生O157病菌感染事件 -------------------------------------------------------- 　　新华网东京4月6日专电日本最近再度发生病原性大肠杆菌O157集体感染事件，到5日为止，东京、千叶、埼玉、神奈川、茨木、群马等地已有125人受到感染。 　　这次集体感染于3月12日首先在千叶县柏市被发现。诊断和调查结果表明，患者是由于食用了一些工厂生产的不洁净的食品而被感染的。 　　日本曾于5、6年前首次发生病原性大肠杆菌O157集体感染事件。患者有发烧、恶心、呕吐等症状。

　　2001年4月9日17:29　新华网报道

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　　正文： 2001年，江苏、安徽等地，肠出血性大肠杆菌O157:H7，造成177人死亡，中毒人数超过2万人。

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　　正文： 大肠菌群MPN的常规检验方法是将不同倍数的检样稀释液接种到乳糖胆盐发酵管内，经一定的温度、时间发酵，若均不产气者则可报告为阴性;如有产气者，则需进行分离培养，证实试验，然后查取MPN检索表，报告出每100mL(g)大肠菌群的最近似数。大肠菌群MPN的检验程序如下：

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　　标题： 检样稀释：

　　正文： (1)以无菌操作将检样25mL(或25g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用匀质器。以8000-10000转/分钟的速度处理1分钟，做成 1：10的均匀稀释液。 (2)用1mL灭菌吸管吸取1：10稀轻液1mL.注入含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀.作1：10的稀释液。

　　操作步骤

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　　正文： (3)另取1mL灭菌吸管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用 1支1mL灭菌吸管： (4)根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接 种3管。

　　操作步骤

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　　标题： 检验方法(一)乳糖发酵试验

　　正文： 在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡(有时比小米粒还小)，有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。

　　操作步骤

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　　正文： 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管;1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每一稀释度接种3管，置36+1℃温箱内，培养24+2小时，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为大肠菌群阴性。如有产气者，按下列程序进行。

　　操作步骤

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　　标题： (二)分离培养

　　正文： 将产气的发酵管分别转种到伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置36±1℃温箱内培养18—24小 时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。

　　操作步骤

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　　标题： 证实试验

　　正文： 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1—2个进行革兰氏染色。同时接种乳糖发酵 管，置36±1℃温箱内培养24+2小时，观察产气情况，凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性 。

　　操作步骤

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　　标题： 报告

　　正文： 根据证实为大肠群阳性的管数，查MPN的检索表(见附录一)，报告每100mL(g)大肠菌群的最近似数(MPN)。

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　　正文： 大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。 抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。

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　　标题： 大肠菌群MPN的其它检验方法

　　正文： 大肠菌群MPN的其他测定方法有琉水网膜法、TTC(2、3、5、—氯化三苯四氮唑)显色法，DC(去氧胆酸钠)半固体法、纸片法等。

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　　正文： 我国饮用水卫生标准： ≤ 3个大肠菌群/1L饮水

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　　北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念;而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。

　　项目 依据 耐热大肠菌群 NMKL、ISO 粪大肠菌群 NMKL AOAC

　　定义 在44.5℃培养，24h内能产酸产气的细菌 在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h内产生吲哚的耐热大肠菌群 于LST中36℃培养48h内产气，并于EC内培养44℃24h产气的一群细菌

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　　标题： 第三节 食品中金黄色葡萄球菌的检验

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　　金黄色葡萄球菌

　　急性化脓性感染

　　食物中毒

　　正常人带菌，30-80%

　　通过工人手和呼吸道污染食品

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　　金黄色葡萄球菌在生牛奶、熟肉制品及冰激凌等3类食品中的检出率为19.67%;前两种食品的污染率分别为25.13%和20.33%。

　　浙江CDC 2000-2004年监控结果

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　　(Gp:) 金葡感染

　　(Gp:) 染色观察

　　(Gp:) 在BP平板上的典型菌落

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　　大阪市政府5日宣布的调查结果显示，因食用日本雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒者已逾万人。 　　在大阪府和京都府以及附近6县，因食用雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒发病者已达10682人，其中有155人被送往医院，目前还有37人在医院接受治疗。 　　据化验，该工厂生产的一些乳制品中含有黄色葡萄球菌，这种细菌可产生使人出现腹泻、呕吐症状的A型肠毒素。该厂乳制品染菌是生产设备没有按规定定期清洗而造成的。

　　媒体关于日本雪印牛奶金黄色葡萄球菌中毒事件的报道

　　日本因食用染菌乳制品中毒者已逾万人 (2000年7月6日12:39)

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　　标题： 检验方法

　　正文： 样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成1：10稀释液。 增菌培养：将1：10稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C培养24小时。

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　　正文： 分离培养：将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37°C培养24-48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。

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　　正文： 染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0.5-1μm。 血浆凝固酶试验：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置36±1°C培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。

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　　正文： 耐热核酸酶试验：将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，36±1°C培养24小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。

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　　标题： 第四节 食品中沙门氏菌的检验

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　　其中许多为人畜共患病

　　一大群人与动物肠道中的寄生菌

　　菌群菌型甚多，仅少数对人致病

　　沙门氏菌

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　　广泛存在于动物 肠道、内脏中。

　　引起中毒的主要是 动物源性食品。

　　本菌对热、消毒药及 外界环境的的抵抗力 不强。60℃，20-30min 即被杀死。

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　　1、致病物质：

　　致病性与免疫性

　　侵袭力：

　　O抗原、 VI抗原

　　毒 素：

　　内毒素

　　2、所致疾病：

　　伤寒副伤寒

　　食物中毒(急性胃肠炎，表现为头痛、 恶心、面色苍白、出冷汗、随之出现呕吐 腹泻、体温升高，并伴有水样便，有时带 脓血粘液，重者出现寒战、抽搐和昏迷等 病程3~7d，死亡率0.5%。)

　　败血症

　　外毒素----肠毒素

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　　正文： 伤寒未接受过治疗的病人致死率可超过10%，而对经过适当治疗的病人其致死率低于1%，幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。这些无症状携带者不显示发病症状仍能将微生物传染给其他人(传统的例子就是玛丽伤寒)。 非伤寒型沙门氏菌败血症可由各型沙门氏菌感染所致，能影响所有器官，有时还引起死亡。幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。

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　　胆囊-----肠道-------粪排菌 皮肤----血拴出血--玫瑰疹 肾-----尿 肝脾-----肿大 骨髓------受抑制

　　伤寒和副伤寒的致病过程

　　伤寒和副伤寒杆菌

　　小肠上部粘膜

　　肠系膜淋巴结

　　固有层淋巴结

　　进入血液

　　再次进入血液

　　第一次菌血症

　　第二次菌血症

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　　病愈后免疫力较牢固，主要是细胞免疫

　　3、免疫性

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　　沙门氏菌的预防措施： SSOP、GMP控制个人卫生习惯，严格洗手、消毒以及防止粪便污染水源， 加强加工用水的消毒。 食用前充分加热以及防止交叉污染

　　沙门氏菌在SS平板上

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　　标题： 检验步骤

　　正文： 1、前增菌：用无选择性的培养基使处于濒死状态的沙门氏菌恢复活力。沙门氏菌在食品加工过程中，常常受到损伤而处于濒死状态，因此，对经过加工的食品检验沙门氏菌时应进行前增菌，即用不加任何抑菌剂的培养基BP进行增菌。 一般前增菌时间为4h，不宜过长。(为什么?)

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　　标题： 2、选择性增菌

　　正文： 前增菌后或未加工的食品进行选择性增菌，使沙门氏菌得以增殖，而大多数其他细菌受到抑制。 直接增菌的食品应制成1：1稀释液，而不能做成1：10稀释液，因为食品中沙门氏菌数量较少，1：10降低检出率，而1：1稀释液可提高检出率。 增菌液有：SC、TTB、MM。增菌时必须用一个SC和一个TTB或MM。(为什么?)

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　　标题： 3、平板分离

　　正文： 分离沙门氏菌的培养基为选择性鉴别培养基。 沙门氏菌主要来源于粪便，而粪便中埃希氏菌属占绝对优势，所以选择性增菌后，与沙门氏菌相伴随的主要是埃希氏菌属。因此，培养基中加入的指示系统主要是事沙门氏菌和埃希氏菌属的菌落特征最大限度的分开。 常用的分离沙门氏菌的选择性培养基有：BS、DHL、HE、WS、SS。

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　　标题： 4、生化试验鉴定到属

　　正文： 初步生化试验：三糖铁试验。测定细菌对葡萄糖、乳糖、蔗糖的分解、产气好产硫化氢情况。 其他生化试验：靛基质、尿素、氰化钾、赖氨酸， 4项。 若硫化氢+、靛基质-、尿素-、氰化钾-、赖氨酸+，这是典型沙门氏菌的反应。 5、血清学分型试验

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　　标题： 沙门氏菌快速检验的新方法

　　正文： 免疫荧光抗体法 酶联免疫吸附测定法(ELISA) PCR技术

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　　标题： 第五节 食品中志贺氏菌的检验

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　　多数不分解乳糖

　　志贺氏菌 shigella

　　是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，

　　通称痢疾杆菌dyseatery bacteria

　　革兰氏阴性菌、无荚膜、无鞭毛，有菌毛

　　生化反应

　　低于其他肠道杆菌，对酸敏感

　　形态

　　对理化因素的低抗力

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　　抗原与分类

　　根据O抗原分类

　　(Gp:) 亚型

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 1~15

　　(Gp:) 1~6，X，Y变种

　　(Gp:) 1~10

　　(Gp:) 型

　　(Gp:) D

　　(Gp:) C

　　(Gp:) B

　　(Gp:) A

　　(Gp:) 群

　　(Gp:) 宋内氏志贺菌

　　(Gp:) 鲍氏志贺菌

　　(Gp:) 福氏志贺菌

　　(Gp:) 痢疾志贺菌

　　(Gp:) 菌种

　　分为4群39个血清型(包括亚型)

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　　致病性

　　人类是唯一的患者和带菌者

　　粪—口传播

　　感染灶局限于结肠粘膜层，一般不入血

　　病后免疫期短，也不巩固

　　致病性较强，感染10-200个即可发病。

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　　致病物质

　　1、侵袭力：

　　菌毛—有利于菌粘附至肠粘膜

　　2、毒 素：

　　加重局部和全身症状

　　内毒素

　　作用于肠壁

　　通透性增加

　　粘膜炎症、溃疡

　　局部

　　全身

　　内毒素血症

　　外毒素(A群1型)

　　与内毒素协同作用

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　　临床表现

　　急性细菌性痢疾

　　急性典型：发热、腹痛、脓血粘液便

　　非急性典型：小儿—中毒型 成人—易误漏诊

　　慢性细菌性痢疾：病程迁移二月以上

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　　中毒性痢疾病人

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　　标题： 检验方法

　　正文： 1、增菌培养：GN增菌液，6~8h。 2、选择性鉴别培养基分离志贺氏菌 选择性琼脂平板有HE、SS、EMB、麦康凯。这些培养基中都含有乳糖。在这些平板上志贺氏菌的菌落为无色半透明不发酵乳糖。

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　　标题： 3、初步生化试验、血清学分型和进一步生化试验

　　正文： 首先是三糖铁：斜面产碱(红色)、底层产酸(黄色)、不产气 硫化氢-、无动力。如出现这样的结果，可疑为志贺氏菌，接着做血清学试验。

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　　标题： 注意

　　正文： 志贺氏菌在常温存活期较短，因此，当样品采集后，应尽快进行检验。 如果在24h内检验，样品可保存在冰箱内 如果要较长时间保存，必须放在低温冰箱内。

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　　标题： 第六节 食品中溶血性链球菌的检验

　　正文：

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　　正文： 溶血性链球菌在自然界分布较广，可存在于水、空气、牛奶、粪便等中。按其在血平板上溶血能力分类，可分为甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、丙型溶血性链球菌、亚甲型溶血性链球菌。 与人类疾病有关的大多属于乙型溶血性链球菌，常可引起皮肤和皮下组织的化脓性炎症及呼吸道感染。还可以通过食品引起猩红热、流行性咽炎的爆发性流行。

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　　标题： 培养特性

　　正文： 需氧或兼性厌氧。营养要求较高，普通培养基上生长不良，在加有血液、血清、腹水等的培养基中生长良好，大多数菌株需苏氨酸、核黄素、维生素B6、烟酸等生长因子。 最适生长温度37℃，最适pH7.4~7.6。

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　　标题： 毒素和酶

　　正文： 致病性链球菌可产生多种毒素和酶。 溶血素、红疹毒素、透明质酸酶、链激酶、杀白细胞素等。

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　　标题： 抵抗力

　　正文： 不强。60℃，30min即被杀死。 乙型溶血性链球菌对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、磺胺都很敏感。 青霉素是溶血性链球菌感染的首选药物。

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　　标题： 检验步骤

　　正文： 样品处理 一般培养 分纯培养 链激酶试验 杆菌肽敏感试验

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　　标题： 第七节 食品中病原性大肠埃希氏菌的检验

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　　正文： 大肠埃希氏菌，俗称大肠杆菌，肠杆菌科、埃希氏属，是指那些能引起人、动物感染及人的食物中毒的一群大肠杆菌。 大肠埃希氏菌随粪便排除后，广泛分布于自然界，是一种条件致病菌。正常条件下不致病，而且还能合成维生素B和K，生产大肠菌素，对机体有利。

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　　标题： 培养特性

　　正文： 需氧或兼性厌氧。最适生长温度37℃，普通培养基上生长良好。 在麦康凯培养基上因发酵乳糖而产生有色菌落。 在EMB上生长成紫黑色有金属光泽的菌落。

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　　标题： 抵抗力

　　正文： 比其他肠道致病菌强。除少数外，都可被巴氏消毒法所杀灭。 在水中可存活数周至数月，在冷藏条件下存活更久。 对磺胺、链霉素、土霉素、金霉素、氯霉素等敏感。而青霉素对它的作用弱，易产生耐药菌株。

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　　标题： 致病性

　　正文： 1、致病因素：侵袭力、内毒素、肠毒素。 2、所致疾病：肠外感染、腹泻 4种大肠杆菌可引起腹泻

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　　大肠杆菌O157

　　侵袭性大肠杆菌(EIEC)

　　致泻性大肠埃希氏菌

　　肠毒素性大肠杆菌(ETEC)

　　致病性大肠杆菌(EPEC)

　　出血性大肠杆菌(EHEC)

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　　致病性大肠杆菌引起的腹泻

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　　标题： 检验程序

　　正文： 增菌 分离 生化试验 血清学试验 肠毒素试验

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　　标题： 第八节 食品中变形杆菌的检验

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　　正文： 变形杆菌属于肠杆菌科，包括普通变形杆菌、奇异变形杆菌、产粘变形杆菌三种。 变形杆菌为腐败菌，广泛分布在自然界中，如土壤、水、垃圾、腐败有机物及人或动物的肠道内。

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　　正文： 变形杆菌一般不致病，为条件致病菌。 可引起多种感染。常见感染有呼吸道感染、腹泻、尿路感染、腹膜炎、中耳炎、乳突炎、心内膜炎、脑膜炎入败血症，还可引起食物中毒。

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　　正文： 中毒食品主要以动物性食品为主，其次为豆制品和凉拌菜，发病季节多在夏、秋，中毒原因为被污染食品在食用前未彻底加热，其产生的毒素可引起中毒。 变形杆菌食物中毒是我国常见的食物中毒之一。 抵抗力：不耐热，于60℃，5~30min皆可杀死。变形杆菌属自然耐药菌株多，治疗时应做药物敏感试验，一般认为卡那霉素为首选药物，有一定的疗效。

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　　标题： 检验程序

　　正文： 增菌培养 分离培养 初步鉴定 最后鉴定 食物中毒检验

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　　标题： 食物中毒检验

　　正文： 发生食物中毒案件时，除自粪便、呕吐物、及可疑食物分离细菌外，还需做以下试验： 测定食物中变形杆菌总数; 菌株的同一性试验; 动物试验; 特异抗体测定。

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　　标题： 第九节 食品中空肠弯曲菌的检验

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　　正文： 空肠弯曲菌(c.jejuni)菌体轻度弯曲似逗点状，菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽胞。 微需氧菌，最适温度为37～42℃。在正常大气或无氧环境中均不能生长。 已被认为是引起急性腹泻的重要原因菌。目前已证明为人畜共患病。

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　　标题： 抵抗力

　　正文： 空肠弯曲菌抵抗力不强，易被干燥、直射日光及弱消毒剂所杀灭，56℃，5分钟可被杀死。对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感。近年发现了不少耐药菌株。

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　　标题： 致病性

　　正文： 在胆管中生长，小肠上端微需氧环境中适合本菌生长繁殖，造成空肠、回肠和大肠组织损伤，通过肠粘膜侵入血液。

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　　标题： 检验程序

　　正文： 微需氧环境的制备：氧气5%、氮气85%、二氧化碳10%。(化学法、生物法、气袋法、仪器法等) 分离培养 初步鉴定 确定试验

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　　标题： 第十节 食品中致病性弧菌检验

　　正文： 弧菌是一大群菌体短小，弯曲成弧形的革兰阴性菌。 主要包括霍乱弧菌、副溶性弧菌和创伤弧菌。 大多数弧菌源于海洋，是嗜盐菌，嗜温性。 预防措施： 彻底烹调或预煮，并防止交叉污染; 控制原料收购; 产品的适宜冷藏.

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　　形态与染色

　　涂片中

　　呈穿梭样

　　运动非常活泼

　　液体中

　　排列整齐

　　呈鱼群状

　　革兰染色阴性

　　弧型或逗点状，

　　单鞭毛

　　霍乱弧菌(V.cholerae)

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　　培养特性

　　耐碱不耐酸

　　碱性琼脂平板上生长良好

　　在pH8.8~9.0的

　　碱性蛋白胨水

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　　根据O抗原不同

　　抗原构造与分型

　　现已有155个血清群

　　其中O1群、O139群引起霍乱

　　根据表型差异

　　O1群霍乱弧菌的每一个血清型

　　还可分为2 生物型

　　古典生物型

　　El Tor生物型

　　霍乱弧菌考核问题

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　　抵抗力

　　不耐酸，在正常胃酸中仅能存活4分钟

　　水中存活长，河水、井水、海水中1-3周

　　怕热，100℃,1-2min死亡

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　　霍乱肠毒素:

　　致病物质

　　激活GS，使细胞内cAMP 水平升高，主动分泌Na+、K+、HCO3—和水，导致重 的腹泻与呕吐

　　B亚单位

　　A亚单位

　　与小肠粘膜上皮细胞GM1神经节苷脂受体结合，介导A亚单位进入细胞

　　(结合亚单位)

　　(毒性亚单位)

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　　霍乱肠毒素的作用机理

　　1

　　2

　　3

　　4

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　　霍乱肠毒素的作用机理

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　　剧烈腹泻和呕吐(米泔水样腹泻物)， 大量水分和电解质丧失 ，低容量性休 克及心力不齐和肾衰竭(死亡率高达60%)

　　烈性肠道传染病，为我国的甲类法定传染病

　　传播途径

　　主要是通过污染的水源或食物经口摄入

　　所致疾病

　　传染源

　　临床表现

　　霍 乱

　　病人、无症状感染者

　　上吐下泻

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　　霍乱病人

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　　免疫性

　　感染霍乱弧菌后，

　　机体可获得牢固免疫力

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　　标题： 副溶血弧菌(V. parahaemolyticus )

　　正文： 分布极广的海洋细菌，为引起食物中毒重要的病原细菌之一，尤其是夏秋季节的沿海地区，经常发生由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产品，引起暴发性食物中毒。 嗜盐性，在30~37℃最适温度 时增长较快，一般冬季不易检出。

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　　标题： 培养特性

　　正文： 需氧或兼性厌氧，对营养要求不高。 最适NaCl浓度为35g/L，110g/L以上不生长，在无盐培养基中不生长。 最适pH为7.7~8.0。 本菌的一个显著特征是：从患者分离的菌株在含有食盐的血琼脂培养基上出现β-溶血带。这种能引起红细胞溶解的现象称为“神奈川试验”。

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　　标题： 抵抗力

　　正文： 不强。 75℃，5min;90 ℃ ，1min即可杀死。 对酸敏感。在食醋中5min死亡;1%醋酸1min可杀死。 在淡水中才存活不超过2d，在海水中能存活47d。 含盐浓度低于0.5%或高于11%繁殖停止。

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　　毒素 耐热性溶血毒素、不耐热性溶血毒素、肠毒素。

　　致病性

　　致病菌株可产生的耐热性溶血素，能溶解人的红细胞，引起人的急性胃肠炎。摄入106个即可发病， 该菌经烹饪不当的海产品或盐腌制品所传，潜伏期5~72小时，主要症状为腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热等。一般病程1~7d。

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　　03年共采集41份鱼虾标本，检出副溶血性弧菌24份，检出率为58.58%。 其中鱼类中副溶血性弧菌的检出率为42.86%(9/21);虾类副溶血性弧菌检出率为75%(15/20)。在三份市场活虾的副溶血性弧菌的污染量达≥24000 MPN/100g、15000和11000MPN/100g。 监测结果表明主要肠道病原菌的菌相为副溶血性弧菌，占总病原菌的85.65%。显示目前我省城市居民肠道病原菌以弧菌为主。

　　浙江CDC系统2003年 海水产品副溶血性弧菌定量检测

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　　标题： 检验步骤

　　正文： 样品的采取 分离培养 选择性培养 涂片镜检 嗜盐试验 生化试验 动物试验

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　　标题： 第十一节 食品中耶尔森氏菌的检验

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　　正文： 　本菌为革兰氏阴性杆菌或球杆菌 耶尔森氏菌属包括11个种，其中对人有致病性的有三种：小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核菌和鼠疫菌。只有小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核菌已确定是食源性病原体。鼠疫耶尔森氏菌引起黑疽病，不通过食品传染。

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　　正文： 耶尔森氏菌食物中毒是近年来在国际上引起的一种肠道传染病，至今已在世界上40多个国家发现。 猪的带菌率较高，日本报告检出率为4%，加拿大为3.6%，丹麦为10-17%。在猪中，该菌最易在扁桃腺中发现。

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　　正文： 七十年代在加拿大魁北克地区暴发过两起，有138名儿童感染，源于摄入生牛奶。 1976年在美国纽约爆发过一起，有217名学生感染，在这起发病过程中涉及的是巴氏消毒巧克力奶。 1980年发生于华盛顿的一起有87人感染，污染源是用未经氯处理的泉水做的豆腐。由本菌引起的胃肠炎或中毒爆发，在欧洲以冬春季节较多，夏季较少，而日本则以夏季发病率较高。在我国福建省南部地区，该菌是冬春季腹泻的重要病原菌.

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　　标题： 致病性

　　正文： 耶尔森氏菌病典型症状常为胃肠炎症状、发热、亦可引起阑尾炎。有的引起反应性关节炎，另一个并发症是败血症，即血液系统感染，尽管较少见，但死亡率较高。 本菌对易染人群为婴幼儿，常引起发热、腹痛和带血的腹泻。 本菌在0~4℃可以发育，是冰箱保藏食物潜在的危险病原菌。

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　　标题： 检验程序

　　正文： 样品的采集和处理; 增菌培养; 碱处理; 分离培养; 生化试验。

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　　标题： 第十三节 食品中肉毒梭菌的检验

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　　正文： 肉毒梭菌生命力很强，并广泛存在于自然界，特别是土壤中，易污染食品，于适宜条件下可在食品中产生剧烈的肉神经毒素(又称肉毒毒素)，能引起以神经麻痹为主要症状且死亡率极高的食物中毒。

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　　正文： 肉毒素是目前所知的最强烈的细菌外毒素。故肉毒梭菌的检验目标主要是其毒素。均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据。 引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品等。在美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，中国主要以发酵食品最多，如臭豆腐、豆瓣酱、面酱、豆其等。

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　　标题： 抵抗力

　　正文： 肉毒梭菌加热80℃，30min或100 ℃ 10mi n即可杀死。 但其芽孢抵抗力强，煮沸后要6h， 105 ℃2h，110 ℃36min，120 ℃4~5min才能将其杀死。

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　　标题： 检验程序

　　正文： 样品的采集和处理; 增菌培养; 毒素检测; 分离培养。

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　　标题： 第十四节 食品中蜡样芽胞杆菌的检验

　　正文： 蜡样芽孢杆菌分布广泛，特别是在谷物制品中。主要通过泥土、灰尘、昆虫、不干净的食具和食品从业人员传播。夏、秋季多发，中毒食品主要为剩米饭、米粉、甜酒酿、剩菜、甜点心及乳、肉类食品。中毒原因食品在食用前保存温度较高(20℃以上)和放置时间较长。

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　　正文： 蜡样芽孢杆菌产生致吐肠毒素和致腹泻肠毒素，前者耐热。主要作用于胃肠道，引起胃肠功能紊乱。 ?? 中毒表现：食用被蜡样芽胞杆菌污染的食品后，一般在8~16小时内出现中毒症状，可分为呕吐型和腹泻型，或两者兼有。呕吐型症状以恶心、呕吐为主，并有头晕、四肢无力等;腹泻型以腹痛、腹泻为主。中毒症状8~36小时可消失，一般不会导致死亡。 ?? 紧急处理：停止食用可疑污染的食品，多饮水。一般不需要使用抗生素治疗。腹泻较重者可到医院就诊。 ?? 中毒预防：蜡样芽胞杆菌在15℃以下不繁殖，剩饭、剩菜应放在低温保存。该菌污染的食品一般无腐败变质的异味，不易被发觉。因此，剩饭、剩菜在食用前一定要再加热。注意食品的贮藏和个人卫生，防止尘土、昆虫及其他不洁物污染食品。

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　　标题： 口服蜡样芽孢杆菌活菌片

　　【适 应 症】主要用于婴幼儿 腹泻、慢性腹泻、 肠功能紊乱及肠炎的治疗。

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　　标题： 检验程序

　　正文： 菌数测定; 分离培养; 证实试验

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　　标题： 第十五节 食品中产气荚膜梭菌的检验

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　　正文： 产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。可引起典型的食物中毒、爆发。由产气荚膜梭菌引起的疾病为魏氏梭菌中毒。患者临床特征是剧烈腹绞痛和腹泻。 在食品中该菌数量必须达到很高时(1.0×107或更多)，才能在肠道中产生毒素，已报导有少数病人因脱水和其它混合感染而导致死亡。

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　　正文： 据美国人类卫生教育福利部报导魏氏梭菌引起的食物中毒，在美国占细菌性食物中毒的30%左右，另据美国疾病控制中心，估计每年因产气荚膜梭菌引起的食物中毒约近1万人，其中大约只报导1200例，暴发约20起，大量的暴发和少量的发病都与公共饮食有关。例如：学校的自助食堂和护理病房，产气荚膜梭菌中毒最常发生于儿童和老人。

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　　正文： 产气荚膜梭菌广泛分布于环境中，经常在人和许多家养及野生动物的肠道中发现该细菌的芽胞，长期存在于土壤和沉淀物中，从牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁中分离的产气荚膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染而引起中毒 。

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　　正文： 本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要求并不太严。　　 在普通培养基上能生长，若加葡萄糖，血液，则生长更好。生长适宜温度为37-47℃ 所有菌株均发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气，液化明胶，不产生靛基质，还原硝酸盐为亚硝酸盐，但也有例外。 发酵牛奶中的乳糖、使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎裂，即所谓暴力发酵，这是本菌的主要生化特征之一，也是主要鉴别的指标。

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　　正文： 检样25g(mL)或稀释液225mL ↓ SPS琼脂混合倾注 ↓ 黑色菌落记数 ↓ 任挑黑色菌落10个,分别接种FT培养基 ↓ 确证试验 ↓ 镜 动 销 牛 卵 检 力 酸 奶 磷 形 试 盐 发 脂 态 验 还 酵 分 　　 原　 解 ↓ 菌落计数

　　128张

　　标题： 第十六节 食品中霉菌和酵母菌的检验

　　正文： 酵母和霉菌都是真菌，广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。 长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品。 但在某些情况下，霉菌和酵母菌也可以造成食品腐败变质。

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　　正文： 由于他们生长缓慢和竞争力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐好含糖高的食品、低温储藏的食品、含有抗生素的食品等。 他们能抵抗热、冷冻、以及抗菌素和辐照等储藏技术，还能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病菌的生长。有些霉菌能合成有毒代谢产物——霉菌毒素。 因此，霉菌和酵母菌也可作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母菌计数来制定食品被污染的程度。

　　130张

　　标题： 酵母菌

　　正文： 利用酵母菌酿酒、制造美味可口的饮料和营养丰富的食品(面包、镘头)，生产多种药品(核酸、辅酶A、细胞色素C、维生素B、酶制剂等)，进行石油脱蜡、降低石油的凝固点和生产各种有机酸。由于酵母菌细胞的蛋白质含量很高(一般大于细胞干重的50%)，且含有多种维生素、矿物质和核酸等，所以，人类在利用拟酵母、热带假丝酵母、白色假丝酵母、粘红酵母等酵母菌处理各种食品工业废水时，还可以获得营养丰富的菌体蛋白。

　　131张

　　正文： 当然，也有少数酵母菌(约25种)是有害的，如鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii)、蜂蜜酵母(Saccharomyces mellis)等能使蜂蜜、果酱变质，有些酵母菌是发酵工业污染菌，使发酵产量降低或产生不良气味，影响产品质量，白假丝酵母(Candida albicans)又称白色念珠菌)可引起皮肤、粘膜、呼吸道、消化道以及泌尿系统等多种疾病。新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)可引起慢性脑膜炎、肺炎等。

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　　标题： 酵母菌的菌落特征

　　正文： 菌落表面湿润、粘稠、易被挑起。有些种因培养时间太长使菌落表面皱缩。其色多为乳白，少数呈红色，如红酵母、掷孢酵母等。

　　啤酒酵母的菌落

　　红酵母的菌落

　　各种酵母菌的菌落

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　　标题： 霉菌

　　正文： 霉菌是丝状真菌的统称 。在自然界分布极广 ，与人类的关系密切，对人类有利也有害。有利的方面：食品工业利用霉菌制酱、制曲;发酵工业则用霉菌来生产酒精、有机酸(如柠檬酸、葡萄糖酸等);医药工业利用霉菌生产抗生素(如青霉素、灰黄霉素等)、酶制剂(淀粉酶等)、维生素等;在农业上可用霉菌发酵饲料、生产农药;此外，霉菌还可分解自然界中的淀粉、纤维素、木质素、蛋白质等复杂大分子有机物，使之变成葡萄糖等微生物能利用的物质，从而保证了生态系统中的物质得以不断循环。

　　134张

　　正文： 霉菌对人类有害方面主要是：使食品、粮食发生霉变，使纤维制品腐烂。据统计每年因霉变造成的粮食损失达2%; 霉菌能产生100多种毒素，许多毒素的毒性大，致癌力强，即使食入少量也会对人畜有害。

　　135张

　　标题： 霉菌的菌落特征

　　正文： 菌落较疏松、常呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状 。 菌落表面常呈现出肉眼可见的不同结构和色泽特征，这是因为霉菌形成的孢子有不同形状、构造和颜色，有的水溶性色素可分泌到培养基中，使菌落背面呈现不同颜色;一些生长较快的霉菌菌落，处于菌落中心的菌丝菌龄较大，位于边缘的则较年幼。

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　　青霉的菌落

　　各种曲霉的菌落

　　137张

　　霉菌菌落周围出现抑制萄葡球菌生长的抑制现象

　　产黄青霉菌落

　　细菌生长 抑制区域

　　正常细菌 生长区域

　　138张

　　标题： 检验方法

　　正文： 1.样品的处理 2.样品的稀释 3.培养基的选择 ：马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(PDA)：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好。用PDA作平板计数时，必须加入抗菌素以抑制细菌。 孟加拉红(虎红)培养基 ;高盐察氏培养基

　　139张

　　正文： 4.倾注培养 5.菌落计数及报告 选取菌落数10~150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告。固体检样以g为单位报告，液体检样以mL 单位报告。

　　140张

　　标题： 思考题

　　正文： 1、何谓菌落总数?它有何卫生学意义? 2、何谓大肠菌群?它有何卫生学意义? 3、如何提高沙门氏菌的检出率? 4、沙门氏菌在三糖铁培养基上的反应如何?为什么? 5、沙门氏菌检验有哪5个基本步骤? 6、致病性大肠埃希氏菌有哪几种?主要引起哪几种症状的疾病?

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　　正文： 7、金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落特征如何?为什么? 8、鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标是什么?并叙述其试验? 9、简述溶血性链球菌的检验程序? 10、副溶血性弧菌检验的意义是什么? 11、简述小肠结肠耶尔森氏菌的检验方法? 12、检验食品中的肉毒梭菌有何意义? 13、肉毒梭菌有无芽孢?是需氧菌还是厌氧菌?

　　142张

　　革兰氏染色法

　　1.涂片固定

　　2.单染—结晶紫染液第一次染色 1min

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　　3.媒染—碘-碘化钾溶液浸湿30S

　　4. 脱色—95%乙醇溶液进行颜色洗脱

　　5.复染—红色的藩红染液第二次染色

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　　呈现第二次染色的效果红色;称革兰氏阴性菌(红阴G -)

　　细菌呈现第一次染色的效果紫色，革兰氏阳性菌(紫阳G+);

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　　(Gp:) 染色观察

　　95%乙醇脱色30秒左右(过度，假阴性/阳性)