实验八 酶联免疫吸附试验.ppt

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　　标题： 一 教学要求

　　正文： 掌握酶联免疫吸附试验的基本方法及其原理 学习双抗夹心法检测抗原物质的基本操作

　　实验八 酶联免疫吸附试验(ELISA)

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　　二 实验原理 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 上发展起来的一种新型免疫测定技术，ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原--待测抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。 ELISA最常用的四种方法：直接法测定抗原;间接法测定抗体;双抗体夹心法测定抗原;竞争法测定抗原。

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　　(1)? 直接法测定抗原 A.????? 将抗原吸附在载体表面; B.????? 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物; C. 加底物。底物的降解量=抗原量。

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　　(2)间接法测定抗体 A.????? 将抗原吸附于固相载体表面; B.????? 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C.????? 加酶标抗体; D. 加底物。 测定底物的降解量=抗体量。

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　　(3)双抗体夹心法测定抗原 A.????? 将抗体吸附于固相表面; B.????? 加抗原，形成抗原-抗体复合物; C.???? 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量=抗原量。

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　　(4)竞争法测定抗原 A.???? 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体; 对照只加入酶标抗原; C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差=未知抗原量。

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　　标题： 三 材料与器材(略)

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　　(1)抗体包被：羊抗人IgG 酶联板每孔加100 μL，4 ℃ 过夜;甩净。 (2)封闭：2% 小牛血清，每孔加100 μL，37 ℃ 封闭30 min;封闭后洗三次(前两次用自来水冲、甩; 第三次用洗液， 并静置 3 min，甩) (3)加待测抗原：正常人血清稀释成,1:5,1:10,1:20,1:40,1:80 ,生理盐水作为对照，每孔加 100 μL，注意从高稀释度到低稀释度加样，37 ℃ 孵育1h ;洗三次 (4)加酶标抗体：HRP-IgG(PBS-Tween，5%BS;1：800稀释)， 每孔加 100 μL，37 ℃，30 min;洗三次

　　四 操作 步骤

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　　(5)酶催化反应：底物显色剂(0.2 mol/L Na2HPO4 加1:1的0.1M柠檬酸，3% H2O2 加1.5μL/mL，TMB(DMSO溶，10 mg/mL)每孔加50 μL，37 ℃ 闭光反应15 min; (6)加2mol/L H2SO4 50 μL 终止反应，观察颜色反应，并用酶标仪测量OD。

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　　标题： 五 注意事项

　　正文： (1)正确洗涤酶标板，加洗涤液时要小心，勿使洗涤液溢出，流入周围孔中，造成交叉污染。洗涤后应尽量甩干孔内残液。洗涤液加入孔后，须保持 3 min再弃去。 (2)加样品时应从最高稀释度逐一加至最低稀释度，这样可以不换吸头。 (3)底物应在临用前配制，同时注意避光。

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　　标题： 六 思考题

　　正文： (1)分析酶标抗体不纯对抗原检测结果的影响(双抗夹心法) (2)比较免疫荧光法和ELISA的最适检测对象。