染色质免疫沉淀实验.ppt

　　Chromatin Immunoprecipitation(ChIP) Assay

　　染色质免疫沉淀实验

　　前言

　　基因表达是一个十分复杂而有序的过程，它是众多的反式因子和顺式作用元件之间相互作用的结果。 与原核生物不同，真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。 因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核基因表达机制的基本途径。

　　常用的研究蛋白质与DNA相互作用的方法

　　1.凝胶电泳迁移率改变分析 (EMSA) 2.DNaseⅠ足迹法(foot printing) 3.染色质免疫沉淀实验(CHIP)

　　凝胶电泳迁移率改变分析 (EMSA)

　　在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，若目的DNA与特异性蛋白质结合，其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可找到DNA结合蛋白 。由于其特异性好，DNA迁移率变动试验常用来鉴定其他方法筛选出的结果

　　DNaseⅠ足迹法(foot printing)

　　蛋白结合在DNA片段上，保护结合部位不被DNase破坏，这样，蛋白质在DNA片段上留下了“足迹”，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。

　　凝胶电泳迁移率改变分析 (EMSA)与DNaseⅠ足迹法均为研究体外DNA与蛋白质相互作用的方法，但不能直接对体内的DNA与蛋白质相互作用进行研究。而CHIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。

　　同时，由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，胶电泳迁移率改变分析(EMSA)获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。

　　染色质免疫沉淀分析(ChiP)是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。

　　CHIP原理

　　在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

　　操作步骤

　　其操作步骤可大致分为固定、沉淀和检测三步 第一步：固定，即在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质-DNA复合物，然后用化学( 微球菌酶) 或者机械( 超声波)的手段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。

　　第二步：免疫沉淀，即利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段。

　　第三步：目的片段的纯化与检测，即经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况.

　　条件选择

　　1、超声波破碎条件的选择 2、抗体量的选择 3、PCR反应条件的选择

　　应用

　　1、组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”2、转录调控分析3、药物开发研究4、有丝分裂研究5、DNA损失与凋亡分析

　　扩展应用

　　CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围: 1、CHIP 与基因芯片相结合所建立的CHIP-on-CHIP 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选; 2 、 CHIP 与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点; 3 、 RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用.

　　DNA和蛋白质相互作用数据库 DPInteract - DNA-Proteins interactions db

　　荧光共振能量转移技术 fluorescence resonance energy transfer, FRET

　　随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，荧光共振能量转移技术已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。

　　技术原理

　　荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。

　　FRET技术得以在生物体内广泛应用，与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的应用和改造是密不可分的。

　　GFP由11个β片层组成桶状构成疏水中心，由α螺旋包含着的发光基团位于其中。这个发光基团(chromophore)是由3个氨基酸(Ser65、Tyr66、Gly67)经过环化、氧化后形成的咪唑环，在钙离子激发下产生绿色荧光。野生型GFP吸收紫外光和蓝光，发射绿光。通过更换GFP生色团氨基酸、插入内含子、改变碱基组成等基因工程操作，实现对GFP的改造，如增强其荧光强度和热稳定性、促进生色团的折叠、改善荧光特性等。

　　青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein, CFP)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)为目前蛋白-蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET对。CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱相重叠。将供体蛋白CFG和受体蛋白YFG分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋白之间的距离在5-10nm的范围内，则供体CFP发出的荧光可被YFP吸收，并激发YFP发出黄色荧光，此时通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少。

　　如Tsien & Miyawaki采用FRET技术检测细胞内Ca2+的浓度变化。他们将CFP和YFP分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一个细胞内。当细胞内具有高的Ca2+浓度时，钙调蛋白和钙调蛋白结合肽结合，可诱发FRET，使受体蛋白YFP发出黄色荧光，因此细胞呈黄色。当细胞内Ca2+浓度低时，FRET几乎不发生，因此检测时CFP被激发，发出绿色荧光，细胞呈绿色。

　　FRET技术的应用

　　1、蛋白质分子的共定位 2、蛋白分子聚合体 3、转录机制 4、转换途径 5、分子运动 6、蛋白折叠等生物学问题

　　关于细胞凋亡的研究 细胞凋亡过程大致可以分为三个不同的阶段：起始期-细胞通过不同途径接受多种与凋亡有关的信号;整合期-多种信号在此整合，细胞做出生存或死亡的决定;执行期-一旦做出死亡的决定，即将进入一个不可逆转的程序。天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease,Caspase)在细胞凋亡的执行期发挥关键作用，近年来对其研究成为细胞凋亡领域的一个热点。

　　而FRET技术的出现对此的研究提供了更为有利的条件：Reiko Onuki等人利用FRET技术研究了Caspase8与Bid蛋白之间的相互作用，Caspase8活化后作用Bid蛋白，使其裂解成两个片段，然后羧基片段转移到线粒体使其释放细胞色素C诱发细胞凋亡细胞凋亡。

　　研究者将Bid蛋白两端分别与CFP与YFP融合，精心设计使其在没有被裂解前刚好可以发生FRET,当Bid蛋白被裂解后FRET效应自然消失。所以是一种很好的检测Caspase8酶活性方法，而且当Bid蛋白与CFP与YFP融合之后仍能行使正常的功能，当融合物在细胞内被裂解后，连接CFP的片段转移到线粒体，通过CFP荧光可以很清楚的观测到其在细胞内的定位。另外Markus Rehm与Kiwamu Takemoto等人利用FRET技术设计了可以反映Caspase3酶活性变化的融合报告蛋白，通过此报告蛋白证实了在细胞凋亡过程中Caspase3酶活性变化是一个非常迅速的过程。

　　蛋白质之间相互作用研究的重要性

　　蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。 几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。

　　研究蛋白质相互作用的常用方法

　　酵母双杂交(yeast two hybridization) 亲和层析 免疫共沉淀 蛋白质交联 基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法 噬菌体显示系统筛选

　　酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。

　　第一节 酵母双杂交系统简介

　　它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。 该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。

　　一、酵母双杂交系统的建立和基本原理

　　经典文献出处

　　Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 1989, 340(6230):245-246

　　(一)酵母双杂交系统的建立

　　1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。 该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：

　　转录激活因子

　　DNA结合结构域(BD) (DNA binding domain)

　　转录激活结构域(AD) (activation domain)

　　这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。

　　Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。 两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的1～147位多肽构成，能识别位于Gal4基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。 此外，在其N-端还具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768～881位多肽构成。 当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。

　　酵母转录因子(Gal 4)

　　与BD-fusion ---诱饵(bait) 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白(prey or target protein)

　　报告基因(reporter gene) ---Lac Z(编码β-半乳糖苷酶)

　　(二)酵母双杂交系统的原理

　　(Gp:) AD

　　(Gp:) Y

　　(Gp:) AD

　　(Gp:) Y

　　(Gp:) X

　　(Gp:) DNA-BD

　　(Gp:) GAL4 UAS

　　(Gp:) Promoter

　　(Gp:) lacZ(or HIS) reporter gene

　　(Gp:) transcription

　　(Gp:) GAL4 UAS

　　(Gp:) Promoter

　　(Gp:) lacZ(or HIS) reporter gene

　　(Gp:) GAL4 UAS

　　(Gp:) Promoter

　　(Gp:) lacZ(or HIS) reporter gene

　　(Gp:) X

　　(Gp:) DNA-BD

　　谢谢