第六章 微生物的生长繁殖及其控制.ppt

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　　微生物的生长繁殖 及其控制

　　第六章

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　　生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加

　　生长

　　指生物个体数目的增加

　　繁殖

　　在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，因此实际上常群体生长作为衡量微生物生长的指标。

　　群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程

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　　正文： 个体生长 个体繁殖 群体生长 群体生长 个体生长+个体繁殖 由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况

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　　第一节 微生物纯培养的获得

　　平板划线分离法

　　稀释倒平板法

　　单孢子或单细胞分离法

　　利用选择性培养基分离法

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　　1.平板划线分离法

　　用接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线 ，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

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　　2.稀释倒平板法

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　　3.单孢子或单细胞分离法

　　采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养 。

　　在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。

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　　4.选择性培养基分离法

　　各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。

　　微生物纯培养分离方法的比较

　　(Gp:) 分离方法

　　(Gp:) 应用范围

　　(Gp:) 平皿划线法

　　(Gp:) 方法简便，多用于分离细菌

　　(Gp:) 稀释倒平皿法

　　(Gp:) 即可定性，又可定量，用途广泛

　　(Gp:) 单细胞挑取法

　　(Gp:) 局限于高度专业化的科学研究

　　(Gp:) 利用选择培养基法

　　(Gp:) 适用于分离某些生理类型较特殊的

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　　第二节 微生物生长的测定

　　评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果;

　　客观地反映微生物生长的规律;

　　评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响;

　　微生物生长

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　　微生物生长测量方法

　　个体计数法

　　重 量 法

　　生理指标法

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　　1.个体计数法

　　a.直接法

　　利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

　　缺点： 不能区分死菌与活菌; 不适于对运动细菌的计数; 需要相对高的细菌浓度; 个体小的细菌在显微镜下难以观察;

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　　b.简接法

　　原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。

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　　2.重量法

　　通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算 微生物群体的生物量;

　　测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法

　　以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量;

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　　3.生理指标测定法

　　样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显， 因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量 热计等设备来测定相应的指标。

　　常用于对微生物的快速鉴定与检测

　　微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。

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　　第三节 微生物的生长规律

　　一、细菌群体生长规律

　　在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间时细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。

　　生长曲线

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　　生长曲线可分：

　　延滞期

　　对数期

　　衰亡期

　　稳定期

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　　1.延滞期

　　将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。

　　迟缓期的特点：分裂迟缓、代谢活跃

　　①通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短; ②利用对数生长期的细胞作为“种子”; ③尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大; ④适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响。

　　在工业发酵和科研中通常采取一定的措施缩短延滞期：

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　　2.对数期

　　指数期的特点 细菌数量呈对数增加 生长速度常数R最大 细胞进行平衡生长 酶系活跃，代谢旺盛 影响指数期微生物增代时间的因素 菌种 营养成分 营养物的浓度 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度

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　　标题： 细菌研究中常用的三个参数

　　正文： (1)繁殖代数(n) 指数生长方式： 1 2 4 8… …2n 设接种时细胞数为x1, 时间为t1, 到时间t2后，繁殖n代，细胞数为x2，它们之间的相互关系为： x2 = x1*2n 以对数表示：㏒ x2 = ㏒ x1 + n㏒2 ㏒ x2 - ㏒ x1 ∴ n = = 3.322(㏒ x2 - ㏒ x1 ) ㏒2

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　　正文： (2)生长速度常数(R) n ㏒ x2 - ㏒ x1 R = = t2 – t1 log2( t2 – t1 ) (3)代时(G) 1 t2 – t1 G = = R 3.322(㏒ x2 - ㏒ x1)

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　　正文： 特点： 1 生长速率常数R等于0 2 菌体产量达到了最高值 3 合成次生代谢产物 4 细胞内出现储藏物质，芽孢菌内开始 产生芽孢 产生原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽 营养物的比例失调，如碳氮比不合适 有害代谢废物的积累(酸、醇、毒素等) 物化条件(pH、氧化还原势等)不合适

　　通过补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等 获得更多的代谢产物

　　标题： 3.稳定期

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　　标题： 4.衰亡期

　　正文： 特点： 1 R为负值 2 细胞的形态发生变化，出现不规则的衰退形 3 释放次生代谢产物，芽孢等 4 菌体开始自溶 产生原因： 生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡

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　　二、同步培养

　　1.概念

　　同步培养(synchronous culture)：是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。

　　同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式

　　同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。

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　　同步培养方法

　　机械方法

　　环境条件控制技术

　　离心方法

　　过滤分离法

　　硝酸纤维素滤膜法

　　温度

　　培养基成份控制

　　光照和黑暗交替培养

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　　硝酸纤维素滤膜法

　　离心法

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　　三、连续培养

　　连续培养(continous culture of microorganisms)是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。

　　连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物

　　连续培养类型

　　恒浊连续培养

　　恒化连续培养

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　　(一)恒化连续培养

　　在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断”进行。

　　生长速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质

　　恒化器连续培养通常用于微生物学的研究，筛选不同的变种。

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　　(二)恒浊连续培养

　　通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。

　　用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业

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　　(三)连续发酵与单批发酵相比

　　优点：缩短发酵周期，提高设备利用率; 便于自动控制; 降低动力消耗及体力劳动强度; 产品质量较稳定;

　　缺点：杂菌污染和菌种退化

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　　第四节 环境因素对微生物的影响

　　影响因素：

　　氧

　　温 度

　　PH 值

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　　(一) 温 度

　　根据微生物生长的最适温度不同，可以将微生物分为嗜冷、兼性嗜冷、嗜温、嗜热和超嗜热等五种不同的类型。它们都有各自的最低、最适和最高生长温度范围。

　　(Gp:) 微生物类型 生长温度/℃ 最低 最适 最高

　　(Gp:) 嗜冷微生物 0以下 15 20 兼性嗜冷微生物 0 20-30 35; 嗜温微生物 15-20 20-45 45以上 嗜热微生物 45 55-65 80 超嗜热或嗜高温微生物 65 80-90 100以上

　　最适生长温度：某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度

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　　(二) PH

　　(Gp:) 微生物

　　(Gp:) 最低PH

　　(Gp:) 最适PH

　　(Gp:) 最高PH

　　(Gp:) 细菌

　　(Gp:) 3-5

　　(Gp:) 6.5-7.5

　　(Gp:) 8-10

　　(Gp:) 酵母菌

　　(Gp:) 2-3

　　(Gp:) 4.5-5.5

　　(Gp:) 7-8

　　(Gp:) 霉菌

　　(Gp:) 1-3

　　(Gp:) 4.5-5.5

　　(Gp:) 7-8

　　微生物生长过程中机体内发生的绝大多数的反应是酶促反应，而酶促反应都有一个最适pH范围，在此范围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微生物生长速率最大，因此微生物生长也有一个最适生长的pH范围。

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　　(三) 氧

　　根据氧与微生物生长的关系可将微生物分为

　　好氧

　　微好氧

　　耐氧型

　　兼性厌氧

　　专性厌氧

　　(Gp:) 微生物类型

　　(Gp:) 最适生长的O2体积分数

　　(Gp:) 好氧 微好氧 氧的忍耐型 兼性厌氧 专性厌氧

　　(Gp:) 等于或大于20% 2%一lO% 2%以下 有氧或无氧 不需要氧、有氧时死亡

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　　自由基是一种强氧化剂，它与生物大分子互相作用，可导致产生生物分子自由基，从而对机体产生损伤或突变作用，直至死亡。氧之所以对专性厌氧微生物以外的其他四种类型微生物不产生致死作用，是因为它们具有超氧物歧化酶，可催化起氧化基化合物分解，最终分解成水。

　　氧对于好氧微生物生长虽然可以通过好氧呼吸产生更多的能量，满足机体的生长需要，但另一方面，氧对一切生物都会使其产生有毒害作用的代谢产物，如超氧基化合物与H2O2，这两种代谢产物互相作用还会产生毒性很强的自由基OH.。

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　　第五节 微生物生长繁殖的控制

　　一、基本概念

　　防腐(antisepsis)：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施

　　消毒(disinfection)：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施

　　灭菌(sterilization)：指利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有微生物的一种措施

　　化疗(chemotherapy)：利用具有选择毒性的化学物质如磺胺、抗生素等对生物体内部被微生物感染的组织成病受细胞进行治疗，以杀死组织内的病原微生物或病变细胞，但对机体本身无毒害作用的治疗措施。

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　　二、控制微生物的化学物质

　　1.抗微生物剂

　　抗微生物剂(antimicrobial agcnt)是一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质

　　根据它们抗微生物的特性可分为：

　　抑菌剂

　　杀菌剂

　　溶菌剂

　　用机理是这类物质结合到核糖体上抑制蛋白质合成，导致生长停止，由于它们同核糖体结合不紧，它们在浓度降低时又会游离出来，核糖体合成蛋白质的能力恢复，使生长恢复

　　它们是紧紧地结合到细胞的作用靶上，即使在浓度降低时也不能游离出来，因此生长不能恢复

　　能抑制细胞壁合成或损伤细胞质膜

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　　抗微生物剂通常又将它们分为

　　消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。

　　防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组 织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。

　　HgCl2、CuSO4、碘液、氯气、乙烯氧化物、甲醛剂、臭氧

　　有机汞、0.1%-1%硝酸银、碘液、70%乙醇、3%过氧化氢

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　　各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准：

　　石炭酸系数： 指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonella typhi(伤寒沙门氏菌)。

　　在临床上最早使用的消毒剂----石炭酸

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　　2.抗代谢物 (Antimetabolite)

　　有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰了代谢的正常进行，这些物质称为抗代谢物。

　　叶酸对抗物(磺胺)、 嘌呤对抗物(6-巯基嘌呤)、 苯丙氨酸对抗物(对氟苯丙氨酸)、 尿嘧啶对抗物(5-氟尿嘧啶) 胸腺嘧啶对抗物(5-溴胸腺嘧啶)

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　　磺胺药物是最早发现，也是最常见的化学疗剂，抗菌谱广，能治疗多种传染性疾病。

　　大多数革兰氏阳性细菌(如肺炎球菌、溶血性链球菌等) 某些革兰氏阴性细菌(如痢疾杆菌、脑膜炎球菌、流感杆菌等) 对放线菌也有一定的作用。

　　作用机理：磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物

　　磺胺的抑菌作用是因为很多细菌需要自己合成叶酸而生长。

　　磺胺对人体细胞无毒性，因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的 相关酶----二氢叶酸合成酶，不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行 合成叶酸，而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。

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　　3.抗生素

　　抗生素(Antibiotic) 是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物的生命活动，如杀死微生物或抑制其生长。

　　(1)概念

　　自本世纪40年代以来，已找到上万种新抗生素，合成了近10万种半合成抗生素，但其中在临床上常用的仅几十种。

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　　(2)作用机制

　　抑制细菌细胞壁合成

　　破坏细胞质膜

　　作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化

　　抑制蛋白质和核酸合成

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　　(3)细菌抗药性的产生

　　抗性菌株特点：

　　细胞质膜透性改变，使抗生素不进入细胞或进入细胞 后被细胞主动排出; 药物作用靶改变; 合成了修饰抗生素的酶; 抗性菌株发生遗传变异，导致合成新的多聚体，以取 代或部分取原来的多聚体;

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　　(4)应用抗生素注意

　　(1)第一次使用的药物剂量要足; (2)避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素; (3)不同的抗生素(或与其他药物)混合使用; (4)对现有抗生素进行改造; (5)筛选新的更有效的抗生素;

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　　三、控制微生物的物理因素

　　温度

　　辐射作用

　　过滤

　　渗透压

　　干燥

　　超声波

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　　1.高温灭菌

　　①高压蒸汽灭菌法

　　高压蒸汽灭菌的温度越高，微生物死亡越快。通常情况下温度为121.3℃。

　　衡量灭菌效果的指标

　　十倍致死时间 (decimal reduction time)：即在一定的温度条件下，微生物数量十倍减少所需要的时间。 热致死时间(thennaldeathtime)：即在一定温度下杀死所有某一浓度微生物所需要的时间

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　　②干热灭菌

　　烘箱内热空气灭菌 火焰灼烧

　　干热灭菌

　　温度：150-170℃ ; 时间：1-2h 对象：金属器械、玻璃器皿等

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　　将待消毒物品如注射器、金属用具、解剖用具等在水中煮沸15min或更长时间，以杀死细菌或其他微生物的营养体和少部分的芽孢或孢子。

　　③煮沸消毒 ?

　　如果在水中适当加1%碳酸钠或2%一5%的石炭酸则杀菌效果更好

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　　对于某些培养基，由于高压蒸汽灭菌会破坏某些营养成分，可用间隙灭菌法灭菌，即流通蒸汽(或蒸煮)反复灭菌几次，

　　④间隙灭菌法

　　例如第一次蒸煮后杀死微生物营养体，冷却，培养过夜，孢子萌发，又第二次蒸煮，杀死营养体。这样反复2—3次就可以完全杀死营养体和芽孢，也可保持某些营养物质不被破坏。

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　　高温对牛奶及其热敏感物质不适宜，因为高热破坏了食品的营养与风味。

　　⑤巴氏消毒法

　　具体方法

　　低温维持法：只要在63℃下维持30min

　　高温短时法：只要在72℃下维持15s

　　超高温法瞬时法:只要在135-150℃下维持2-6s

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　　2.辐射作用 (radiation Sterilization)

　　辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效力法。

　　电磁波:

　　微波:通过热产生杀死微生物的作用; 紫外线(UV):使DNA分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制DNA复制与转录等功能，杀死微生物; X射线和y射线:使其他物质氧化或产生自由基(OH·、H·)破坏和改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微生物。

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　　3.过滤作用

　　不耐热的液体培养基的灭菌