运用液相色谱-串联质谱进行蛋白质定量[本文为测试文章，请勿充值和下载].ppt

　　质谱多反应监测技术是基于已知信息或假定信息，有针对性地进行质谱信号采集并获取数据的技术。作为小分子化合物的定量方法，MRM技术具有灵敏性、准确性高和特异性强等优点，已经广泛应用于药学领域。近年来，该技术逐渐被应用于蛋白质组学中目标差异蛋白质的定量，此外在蛋白质组学中的生物标志物、蛋白质翻译后修饰、定量蛋白质组和蛋白质相互作用等领域的研究中也将发挥重要作用。

　　随着蛋白质组学和多肽组学的不断发展，发现生物标本中的差异蛋白质即潜在生物标志物已不是问题，然而如何对这些差异多肽或蛋白质从大量的临床样本中进行高通量检测还存在一定的困难。目前常用的目标多肽定量方法是液相色谱法，但其检测的灵敏度和特异性有限;又由于血浆内源性多肽的成分非常复杂，很难利用液相色谱对如此复杂的样品中的多肽进行定量。而液相色谱-串联质谱法与液相色谱法相比具有特异性强、灵敏度高的特点，且样品制备方法简单，是蛋白质定量的首选方法。常用的目标蛋白质定量方法还有传统的ELISA和免疫印迹法，这些以抗原抗体反应为目的的蛋白质定量方法往往依赖于高特异性的抗体，对于那些难以制备抗体的蛋白质进行定量存在困难;且免疫印迹法分析样品通量低，无法与质谱MRM定量方法相比。此外，ELISA灵敏度高，但假阳性也高，并且免疫印迹法受到检测灵敏度的限制，对复杂样品中的低丰度蛋白质的检测存在一定的局限性。

　　LC-MS/MS定量分析方法不仅应用于小分子化合物的分析中，也可应用于蛋白质的定量检测。但是对于分子量太大的蛋白质需要先用蛋白酶(如胰蛋白酶)消化，然后通过对产物肽进行标记后采用LC-MS/MS对目标蛋白进行定量分析。膜蛋白定量时，由于其存在疏水区域，一般表现出低溶解性和高聚集性，因此胰蛋白酶的消化过程很重要。胰蛋白酶消化产生的肽来自于不同区域的目标膜蛋白，选择具有适当疏水性的肽通过LC-MS/MS进行定量。

　　为了实现定量的高选择性，通过三重四级杆质谱的MRM模式对所选择的肽进行定量。三重四级质谱采用三个室，其中第一和第三室(Q1和Q3)是质量过滤器，通过肽离子的目标质量来确定肽离子的通过种类。在第二室中，肽离子通过氮气碰撞破碎，使用两个质量滤池提供高选择性和高灵敏度。Q1和Q3质量过滤器的组合称为传送过程，并且每10秒进行1次转换，在一次分析中可以同时定量多达300种不同的肽离子(图16-1)。

　　对于肽的定量分析，稳定同位素标记肽是把相同的氨基酸序列作为目标肽的内标，准确的定量中内标肽是必不可少的(图16-2)。标记内标肽在相同的保留时间下被洗脱作为靶肽，由于质量不同，可以通过MS区别靶肽。此外，靶肽的绝对数量可以通过在色谱图中靶肽与内标的峰面积比值进行计算。蛋白质样品中的每个目标肽通过4种不同的MRM通道进行定量，其由相同的Q1和4个不同的Q3组成，内标肽的定量通过测量4个相应的MRM通道(多次MRM分析)来提高精密度。因此，MRM全部通道需要8个蛋白质，在一个单一的分析中最多使用300个MRM通道，可以使37种不同的蛋白质同时定量。所以蛋白定量时，至少需要有1个稳定同位素标记。合成标记肽的费用大(每5nmol为1000～1500美元)，因此对于多次MRM分析可能是一个问题。然而，每个蛋白质样品分析中只需要加入20～500fmol标记肽作为内标，与其他试剂如胰蛋白酶和LC溶剂的成本相比，标记肽的单个样品的成本是非常小的。从已经设定的肽库中选择要使用的肽是一种降低成本的方法，将肽库中的蛋白质进行注册，液体肽库(Sigma-Aldrich公司，美国)提供了100pmol肽，并且每个肽花费300美元进行注册。另一种研究方案是通过使用大肠埃希菌或体外无细胞蛋白质合成系统合成包含目标肽的稳定同位素标记肽，该方法测定蛋白的灵敏度取决于实验设备，例如LC和MS，高灵敏度仪器的成本也很高。

　　蛋白质定量包括整个大脑毛细血管的裂解产物、部分肝脏的等离子体膜、肾、血小板分数以及肝的部分微粒体。同样在血浆、血清和酵母中也进行蛋白定量分析。多种蛋白质样品如使用酶联免疫吸附测定和免疫印迹测定的蛋白质，都可以应用LC-MS/MS进行定量分析。在盐酸胍和尿素的溶解条件下，样品中的蛋白质首先被还原和烷基化，然后还原和烷基化的蛋白质用胰蛋白酶消化以产生胰蛋白酶肽。添加一个固定的稳定同位素标记的内标肽和多通道MRM分析的混合物，通过比较目标肽与内标色谱峰的比值来确定每个目标肽的绝对数量。

　　通过MRM分析来选择蛋白质定量中的目标肽，最重要的是保证高灵敏度和可靠性。相关的目标肽应该有一个独特的氨基酸序列并进行精密的MS分析。全部蛋白质组学研究表明，该选择方法已经能够识别目标肽。Picotti等已经开发出来基于以前的蛋白质组学实验肽的数据库，称为MRM图谱，并且他们曾报道1500个酵母蛋白的分析。全部蛋白质组学可以识别相对低表达的转运蛋白，在许多情况下，只有少数肽来识别每个蛋白质。在MRM分析中为了获得准确的定量，胰酶消化效率、肽的特异性、翻译后修饰和多态性都应该考虑，通过全部蛋白质组学的方法识别少量肽来选择完全适当的目标肽是不可能的。该研究已经开发出了基于氨基酸序列的选择标准，包括肽的长度、氨基酸含量和数据库注释信息。Kamiie等报道，在超过500counts/fmol的条件下，人类血清蛋白的85种肽中只有14种(16%)被检测到;而使用我们的检测标准，可以在31种肽中检测到23种(74%)。目前该标准仍在完善，并且在超过500counts/fmol的条件下实现了对人类转运蛋白中选定的27个肽进行转运蛋白检测。