第五章 组合化学与高通量筛选技术简介.ppt

　　第五章 组合化学与高通量 筛选技术简介

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　　第一节 组合化学

　　第二节 高通量筛选

　　组合化学 (Combinatorial Chemistry)是基于新药创制研究过程中寻找和优化先导化合物必须快速合成并高效筛选大量分子的需要而产生的一种快速合成大量化合物的新方法。 先导化合物的成功率直接依赖(成正比)于可供筛选的化合物数量、结构多样性以及建立有效的生物活性筛选模型这两个因素。

　　第一节 组合化学

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　　组合化学是平行、系统、反复地共价连接不同结构的构建单元，得到大量合成化合物的一类策略与方法。 组合化学是使用一系列固定的“构建单元” 制备一系列化合物的组合过程。 组合化学是一种技术，可以一次性同步合成成百上千个结构各异但变化有序的化合物以供高通量筛选和药理检测组合化学的关键是在相同的反应条件下，使用相同的反应器皿合成大量的类似物。

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　　通过组合化学能够一次性合成出由化合物A1到 An和B1到Bn反应的每种组合的所有化合物

　　组合合成示意

　　组合化学

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　　化合物的合成包括化学合成和生物合成两种，其中化学合成方法又可分为固相合成与溶液合成。

　　组合化学

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　　通过组合化学方法合成的系列化合物称为组合库或化合物库(Combinatorial Compound Library)。 组合化学涵盖单个有机化合物的平行合成、复杂有机混合物的合成、大量噬菌体显示库和核苷酸库的合成以及所有相关的处理这些库并从中获得有用分子的技术。

　　组合化学

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　　组合化学概念及相关合成技术的引入，打破了通过传统方法逐一合成、逐一纯化、逐一筛选的模式，以合成和筛选化合物库的形式寻找和优化先导化合物，从而大大加快了发现药物先导化合物的速度。

　　组合化学

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　　组合化学库的合成是组合化学的核心。组合化学库的合成方法有： 多中心合成法(Multipin synthesis)、 茶叶袋法(Tea-bag method)、 并行合成法(parallel synthesis)、 裂分合成法(Split synthesis)、 光控合成法(Combinatorial libraries by light-directe 纤维素和交联聚苯乙烯聚乙烯为载体的组合合成法等。

　　组合化学库的合成方法

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　　固相合成方法是以不溶性固体材料为载体，以溶剂为介质，将反应物通过连接基团键合到固相载体上，在载体表面的液相中发生化学反应的一种合成方法。

　　固相合成方法

　　固相合成可以使用过量的反应试剂，这不仅可以加速反应，还能使反应物完全转化。由于在整个过程中反应产物始终附着在固相载体上，所以在每一步反应结束时，只需要简单的过滤和用溶剂冲洗载体就可将过量的试剂和副产物除去，使产物纯化，不需要复杂的分离和提纯步骤，因此固相合成能够实现反应的自动化。

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　　包括四个部分①固相载体②连接基③活性官能团的选择性保护和脱保护策略④化学反应及条件优化。 固相载体是固相反应的基础，而连接基则是连接固相载体和反应物之间的桥梁。正确地选择合适的固相载体和连接基是有效地进行固相合成反应的关键。

　　固相合成法

　　固相合成方法

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　　固相载体大多是由不同化合物聚合而成的树脂而制成。固相载体本身必须具备的下特性： ①优良的化学稳定性，在整个反应过程中，除与连接基结合外，载体的结构即不受到影响，也不参与化学反应 ②具有良好的机械强度，即耐研磨和抗挤压; ③特定的溶剂选择性，即对很多溶剂具有不溶性，而在反应溶剂中具有溶胀性，从而形成足够的空间，使液相中的反应试剂能相对自由地进入树脂孔径的内部，与连在树脂上的功能基团反应。

　　固相载体

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　　在固相合成中，连接基是不可或缺的组成部分，其作用是将底物连接到固相载体上。因此连接基一般都具有双官能团。连接基特点： ①较高的的化学反应性，即易于连接; ②化学键稳定性，确保后续反应的顺利进行; ③对裂解条件的高度敏感性，具有对裂解试剂的专一性,使最终产物顺利、完整地从固相载体上解离下来。

　　连接基

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　　早期的连接基是为多肽合成发展的，因此连接基以裂解释放羧基、氨基和酰氨基的产物为主，如苄醇类及苄基卤化物类连接基，它们通过和反应物的羧基形成酯而接到固相上，适用于连接氨基酸的羧基及其他羧酸类化合物。 连接基一般按裂解反应所用试剂或条件进行分类，有酸敏性 (acid-labile)、碱敏性(base-labile)和无痕迹 (traceless)连接基三大类。

　　连接基

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　　M 个底物A分别与载体相连后混合，等量分成N份，分别与P个单体B中的每一个进行反应，所得产物再混合，再把混合物分成P等份，分别与P个单体C中的每一个进行反应，如此逐步继续，直到反应结束。这样最后得到的是一些混合物组，称为子库。所得的化合物的总数为M×N×P…，即混合-均分法产生的产物数目是每一步反应所用合成砌块数目的连乘积。若每一步反应所用的砌块数目都相同，则产物总数就是砌块数目的步骤次方。

　　混合裂分组合化学库的合成方法

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　　一个3×3代表性的混合-均分法原理示意

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　　液相组合合成法是针对固相组合合成的弱点而发展的组合合成法。反应都在液相中进行。与固相组合合成相比，具有易于实现、减少了与载体连接和解离步骤等优点。

　　液相组合合成法

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　　平行液相组合法合成化学库已经成为寻找和优化药物 、农药先导化合物的重要策略。 组合平行合成过程包括了原料(反应底物)S与多个反应试剂( 一般称为合成砌块)R1、R2、R3、…、Rn的反应步骤，生成一个含有n个单个产物SR1、SR2、SR3、…、SRn的化合物库。化学库一般不再经过纯化或仅进行尽量少的纯化和产物鉴定后直接用于高通量的离体筛选。一旦确认了活性化合物，这些化合物就进入了传统的大量合成、纯化、结构确认和再筛选等步骤。

　　平行液相组合法

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　　液相合成法

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　　高通量分析 对组合合成化合物库的分析主要有三项任务 ①目标化合物的结构确认 ②目标化合物的纯度检测 ③目标化合物的产率分析 实现高通量分析的关键因素是速度和检测。

　　组合化学库的分析及纯化方法

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　　目前主要使用的分析系统有 ①快速梯度 HPLC系统 ②新型快速分离色谱柱 ③多通道LC-MS系统 ④定量分析系统 ⑤高通量定性定量分析系统 其中以质谱法为主，包括电子喷雾离子 MS、电子喷雾离子Fourier变换 MS、基体辅助的激光解吸/电离飞行时间MS等技术的应用。

　　组合化学库的分析及纯化方法

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　　纯化是制约整个过程的瓶颈，解决的方法只有靠能实现自动化的液相层析分离技术，这样的系统包括低压闪电式分离系统和高压液相层析系统。 多通道平行纯化系统，将多根色谱柱以并联方式或者一个接一个地串联方式使用，可以大大增加纯化制备化合物的数量 高通量纯化系统的另一个发展方向是纯化过程的智能化

　　高通量纯化

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　　目前主要使用的纯化系统有 ①平行闪电式纯化系统 ②平行制备型HPLC系统 ③质谱导引自动纯化系统

　　高通量纯化

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　　固相筛选 固相筛选方法是没有将化合物从固相载体解离下来，而直接进行生物活性测定。它依据分子水平的筛选模式，将所合成的固载化组合库分子直接与活性蛋白质染色或标记，再将活性树脂珠挑选出来，用荧光、比色等技术鉴定生成的复合物。

　　组合化学库的生物活性筛选方法

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　　①化合物库可以重复利用，连接在载体上没有表现出活性的化合物很容易与受体分离，从而能够对其他的受体再进行活性测试; ②快速，仅数小时即可筛选1×107～1×108个树脂球。每一个树脂球上或负载一个化合物，或负载多个化合物。

　　优点

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　　①因为固相载体、连接基团对化合物存在作用，使其立体构象、电性分布、氢键作用发生变化，从而影响它与受体作用; ②与受体相结合的化合物可能并非是库中最高活性的化合物，因此需要反复测试; ③化合物与载体的连接基也有可能影响化合物与受体的结合。

　　缺点

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　　液相筛选方法是将化合物从固相载体上解离下来后(或者是液相组合合成得到的化合物库)，以自由的形式进行生物活性测试。由于没有固相载体的限制，活性结果更符合实际情况。

　　液相筛选

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　　世界各大农药公司几乎都建立了组合化学研究室，如拜尔公司、杜邦公司等。 组合化学在新农药创制中的应用主要集中在先导化合物的发现和优化两个方面。 组合化学方法和高通量筛选相辅相成、缺一不可。

　　组合化学方法在新农药创制中的应用

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　　合成砌块的制备

　　酰胺类杀真菌剂

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　　异构体对脱水酶的活性比较

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　　优化化合物

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　　第二节 高通量筛选

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　　高通量筛选

　　1.含义 高通量筛选(high thoughput screenig, HTS ) ，是批量运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的筛选模型上完成数以千计、甚至万计样品的活性测试。 一般而言，日筛选能力应在1万次以上方可称为高通量筛选。

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　　high throughput screening system bottom

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　　特点：微量化，快速，高效。 高通量筛选和组合化学、自动化操作系统等技术的有机结合，可以缩短新农药创制的研发周期，降低研发成本，提高开发的成功率。

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　　传统农药筛选技术主要是依据活体生物对化合物的反应做为评价指标。 优点：药剂对生物活体是否有活性可直接观察到,不易漏筛。 缺点：不可能同时或者在短期内进行大量化合物的筛选。

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　　高通量筛选技术是在传统筛选技术的基础上，应用生物化学，分子生物学，细胞生物学，计算机，自动化控制等高新技术， 使筛选样品微量化。样品用量在几微升到几百微升或者微克至毫克级之间，样品加样，活性检测乃至数据处理高度自动化，筛选具有快速，灵敏，特异性高等特点。

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　　筛选有利于同时或短时间内完成大量化合物的筛选。年筛选量可达10 万甚至100 万个化合物。 随着筛选量的增大，发现和得到新药物的机率也将随之增加，所以这一技术在现代新医药，新农药的创制研究中备受青睐。

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　　高通量筛选体系的建立

　　化合物高通量筛选工作的正常开展需要多种高新技术的有机结合。包括高容量的化合物样品库，自动化的操作系统，高特异性的离体或活体筛选模型，高灵敏度的检测系统，以及高效率的数据处理和管理系统等。

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　　High throughput screening robots

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　　High Throughput Screening

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　　High throughput screening

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　　1.高容量的化合物库

　　即包含有大量化合物以供筛选的样品库。 化合物样品库尽可能提供数量大， 结构各异的化合物。 样品库的建立可通过多种途径----例如采用常规化学合成方法长期积累后可建立一定容量的样品库( 从自然界分离提取的天然产物也可构成化合物样品库，组合化学使不同系列高容量化合物库的合成成为可能)

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　　组合化学目前已被许多农药大公司及科研院所应用于新农药的合成。 如捷利康公司设计的机器人合成仪设有40-60 个通道可以自动进行2-3 步化学反应。同时合成2000个化合物。每个化合物50-500mg，反应温度可控制在-20-150℃。反应产物经分离、波谱分析后、再采用数据库搜索、进行结构鉴定。全过程自动完成。

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　　2. 自动化的操作系统操作系统

　　包括简易手动设备，要求操作者起动和调节的组件设备，以及当提供测试运转程序选项后完全自动化执行筛选操作的系统设备。 由计算机及其操作软件，自动化加样设备，温控设备，移动微量滴定板的自动进样系统等部分组成。

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　　筛选实验通常是在由条形码标识的96 孔或者384 孔及其他规格的微量滴定板上进行。使待测化合物与筛选靶标在微量滴定板孔中相互作用，利用计算机控制操作技术，可实现筛选工作的自动化。

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　　例如样品的加样：主要通过多功能的机器人工作站(机械手臂)将待测化合物或其他试剂分别加入微量滴定板的孔中。 机器人工作站一次至少可调节40 个微量滴定板，可配送的样品容积在0.5-200μL之间。

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　　发送的液体试剂是通过装配有96或384个微量注射器的泵来完成。 微量注射器的排列方式正好与微量滴定板上的孔相对应。 样品的稀释、混合、温度控制、洗脱、转移、产物的活性检测以及测定数据的收集、储存等，也都可以自动完成。

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　　绝大多数高通量筛选仪采取多孔板形式, 其中96 孔板是标准形式。 拜耳公司目前已有用于液闪评价和发光酶报告基因评价的384 孔板; PE 公司和BD 公司共同研制的共聚焦式高通量荧光筛选系统(FMA T 8100) 也可以通过定量检测384孔板上的荧光强度来分析样品与不同先导物处理后的相互作用。 (864 孔板、1536 孔板)。

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　　一般来讲, 96 孔板中每孔反应体系的总容积约100～300 μL , 384 孔板每孔反应体系容积可降至30～ 75 μL , 再微型化至864 孔板、1536 孔板, 其反应容积进一步减小, 即使反应信号强度足够, 但操作精度是否可行, 尚须有相应的纳米技术予以保证。但是从技术发展趋势上看, 超高通量筛选的实现只是时间问题。

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　　High Throughput Screening Archive

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　　3. 高特异性的离体或活体筛选模型

　　筛选模型是指根据一定原理设计， 用于发现化合物生物活性的实验方法。其基本模式是化合物样品与测试对象(也即筛选靶标)特异性地结合或反应，然后通过一定的检测手段检测出样品是否具有生物活性。

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　　活体筛选：是以活的生物体(如害虫、病原菌、植物等)为筛选靶标，通过生物体的反应(死亡、生长受抑制等)判断样品的生物活性; 离体筛选：则是以酶、受体、单细胞、细胞器或组织器官等为靶标，待测样品与其作用后，通过一定的指标，判断样品是否具有生物活性。

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　　4. 高灵敏度的检测系统

　　对于离体的高通量筛选试验，由于是在微量条件下完成，而且筛选规模大，因此需要快速且灵敏度高的检测系统。 通过检测仪器直接测定各种不同规格微量滴定板中的反应混合物、不同的筛选模型有时可能需要不同的检测仪器。

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　　高通量筛选的检测仪器种类有：紫外、可见分光光度仪、荧光分光光度仪、化学发光检测计数器、放射性同位素检测仪(如液闪计数器)等。 为了适应高通量以及超高通量筛选的需要，不同类型的灵敏，快速的检测仪将会不断出现，功能会不断完善。

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　　5. 高效率的数据处理及管理系统

　　高通量筛选是对数以万计的化合物样品进行筛选，短时间内可产生大量数据，对这些数据的采集、储存、分析、 处理等，离不开高效率的数据处理及管理系统。

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　　这一系统通过光电阅读器及事先标识的条形码， 可跟踪每一块微量滴定板及其每一孔内的化合物，并将数据写入内部数据包。 数据包内已事先输入可检索的化学结构和其他信息(化合物理化性质、参考文献、筛选历史及群集信息等)。 这些信息与测试结果相结合，及时发现有活性的化合物，或者进行化合物的结构优化。

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　　总体而言，数据管理系统负责： ㈠对所筛选的化合物样品进行存储管理，对每一个新入库的化合物进行新颖性分析，排除结构雷同的化合物，避免不必要的筛选; ㈡根据多个模型的检测结果综合评价化合物的生物活性; ㈢ 对同一模型不同的呈现阳性反应的化合物结构进行分析，找出其构效关系，为新药设计提供参考; ㈣对与化合物筛选相关的业务往来通讯、档案管理以及各种样品标签的打印进行管理，使高通量筛选的各个环节程序化、标准化。

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　　高通量筛选发现新农药的基本过程

　　高通量筛选的特点是快速、高效、可在短时间内提供大量化合物可能的作用机制以及生物活性情况。 其筛选步骤与传统农药生物活性方法相似： 初筛---复筛---盆栽试验---田间小区试验

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　　高通量筛选技术的出现并不排斥传统农药筛选技术，高通量筛选主要用于大数量、微质量样本的快速初筛和复筛，筛选得到的活性化合物仍需通过传统筛选方法确定对活体生物是否有效、活性大小及作用方式等等。

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　　新农药创制研究中一些高通量筛选模型

　　(一)杀虫活性筛选 活体筛选：适用于个体较小， 对药剂敏感而且容易培养和操作的昆虫或指示性生物。 首先将一定量的待测药液和昆虫人工饲料(或者营养液)分别加入微量滴定板的孔中，混匀，然后将单头试虫(如鳞翅目低龄幼虫、孑孓、水蚤、线虫等)或者昆虫的卵(如家蝇卵)置于每一孔内，用透明盖封好，放置在温度、湿度、光照等适宜的控制条件下培养。

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　　一定时间(一至几天)后检查结果，观察试虫生长及其取食情况，以判断药剂生物活性。如果试虫能正常生长，说明药剂无效;如果试虫死亡或生长受阻，能动性下降，则表明药剂有效。 刚孵化的幼虫如果不久即死亡。说明药剂有效，否则无效。如果试虫太小，如孑孓、线虫等、可在显微镜下观察。

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　　离体筛选：用于筛选对昆虫神经受体有活性的化合物。 首先分离提取一定量的昆虫神经受体，如乙酰胆碱受体。

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　　靶标酶活性测定 用于筛选对昆虫靶标酶有活性的化合物。首先分离提取昆虫体内的重要靶标酶，如乙酰胆碱酯酶，Na+-K+-ATP 酶等。 在微量滴定板上分别加入一定量酶液，待测化合物，对照则不加、与酶反应的底物及其他成分、混合均匀、 在适宜条件下反应一定时间后，通过分光光度计测定吸光度值，求出酶活性大小。 在化合物作用下，如果酶活性降低，说明化合物有活性。

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　　乙酰胆碱酯酶(AChE) 抑制剂模型 在一定的温度和pH 条件下，乙酰胆碱脂酶催化乙酰胆碱水解，通过测剩下的乙酰胆碱量，可知乙酰胆碱脂酶活性。而测剩下的乙酰胆碱量是利用其在酸性条件下与羟胺、三氯化铁作用生成红棕色物质，其颜色深浅与剩余乙酰胆碱量成正比，颜色越深，AChE催化活性越弱，即说明样品抑制乙酰胆碱酯酶的能力就越高，在A 540测光吸收即可。

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　　1. MTT(溴化四氮唑)染色 首先培养昆虫细胞系，如棉铃虫细胞系，烟草夜蛾细胞系。取生长期细胞置于96 孔微量滴定板中培养一定时间，使细胞贴壁，然后加入待测化合物并继续培养(24 h)，结束培养前一定时间(4 h)向孔内加入MTT母液。

　　细胞生物测定

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　　MTT可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜(DMSO)溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

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　　2. 中性红吸收法染色 中性红 neutral red为吖嗪类染料，可以被活细胞吸收 ，积蓄在溶酶体中，而死细胞不能积蓄中性红，故不被染色。细胞先与受试物作用一段时间，再与染料在 96 孔板孵育，在固定剂固定、褪色剂提取染料后酶标仪 540 nm波长测定其吸光度。由剂量-反应曲线得到吸光度降低50%的受试物浓度 IC50作为毒理学评价指标。

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　　3. 台盼蓝(Trypan Blue)拒染法染色 通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。

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　　(二)杀菌活性筛选

　　(1) 活体筛选 ① 以各种真菌及细菌为筛选靶标直接筛选。 首先将一定浓度样品用移液器移至微量滴定板上， 再用另一移液器将均匀的供试菌菌丝体或孢子悬浮液接种到每一孔上， 混匀后用分光光度计测定混合液的初始光密度值Ⅰ。 然后置于适宜条件下振荡培养一定时间，再测定光密度值Ⅱ， 将光密度值Ⅱ 与光密度值Ⅰ 比较，即可评价药剂是否有活性。如果二者相等或光密度值Ⅱ降低，说明菌体不能生长，被测物有活性，否则无活性。

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　　② 以酿酒酵母菌为模型菌，筛选化合物的杀菌或抗菌活性 控制条件下，将酿酒酵母菌与待测化合物相互作用， 一定时间后观察化合物对酵母菌生长的抑制情况， 通过有效中浓度(EC50)判断化合物是否有活性

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　　(2) 离体筛选 测定NADH(还原辅酶Ⅰ)的变化，可筛选线粒体呼吸作用中电子传递链上复合体Ⅰ 和复合体Ⅲ 的抑制剂。 将菌体悬浮液与待测化合物分别加入微量滴定板孔中，混匀、控制条件下反应一定时间后，在340nm 下测定光密度值，计算NADH的含量。如果NADH含量降低，说明待测物抑制了电子传递过程，化合物有活性。

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　　(3) 全细胞测试 用于筛选真菌甾醇生物合成抑制剂。 甾醇途径的最终产物(麦角甾醇)对乙酰乙酰辅酶A 硫解酶的启动基因有反馈控制作用。 因此实验的前期工作是构建报告基因，将乙酰乙酰辅酶A硫解酶的启动基因融合到酿酒酵母全细胞中编码β-半乳糖苷酶的基因上，该启动子也能活化β-半乳糖苷酶基因。

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　　将待测化合物与经上述基因修饰的酿酒酵母全细胞及氯苯酚等在微量滴定板上混匀， 在控制条件下反应一定时间，最后通过分光光度计检测。

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　　如果甾醇途径受阻，甾醇生物合成被抑制，就没有甾醇结合到上述报告基因的受体结合蛋白上， β-半乳糖苷酶基因被启动，产生β-半乳糖苷酶， β-半乳糖苷酶与氯苯酚作用， 产生红色的氯苯酚红- β-吡喃半乳糖苷，显示化合物有活性。 如果化合物无活性，甾醇合成正常， β-半乳糖苷酶基因不会被启动，就不能产生β-半乳糖苷酶，只能显现桔黄色。

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　　除草活性筛选

　　(1) 活体筛选 ① 用代表性植物测试 将一定剂量的化合物及藻类(或浮萍)分别加入微量滴定板孔中混匀，在控制条件下振荡培养， 测定培养前后混合液的光密度值。 如果光密度值不变甚至减少，表明藻类不生长，化合物有除草活性。 也可通过生长抑制率求出EC50， 以判断化合物活性大小。 还可以培养藻类细胞，通过化合物对藻类细胞的抑制作用判断其活性大小。

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　　②全植株测试法 在微量滴定板孔中加入待测药液，然后加入小粒植物种子(如小米、鼠耳芥、剪股颖等) 以及植物生长发育所需的营养液或培养基用透明盖封好，置于适宜的温度、光照条件下培养一定时间， 观察种子萌芽及植物生长发育情况。 如果种子萌芽受阻，植物生长矮小，叶片发黄、枯萎等，说明药剂有除草活性。

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　　1. 高通量筛选是一种快速高效，适用于大规模筛选化合物的新型自动化筛选体系。 2. 微量化，快速，高效等特点。 3. 采用常规化学合成方法长期积累或者从自然界分离提取的天然产物也可构成化合物样品库。而组合化学的出现则使不同系列高容量化合物库的合成成为可能。

　　高通量筛选的优点

　　4.酶、受体、单细胞、细胞器或组织器官。 5.高通量筛选技术的出现并不排斥传统农药筛选技术，高通量筛选主要用于大数量、微质量样本的快速初筛和复筛，筛选得到的活性化合物仍需通过传统筛选方法确定对活体生物是否有效、活性大小及作用方式等等。

　　高通量筛选因其快速、高效的特点在新农药的发现过程中具有强大的优势。但值得注意的是： 1. 离体筛选只针对某一特定的靶标、脱离活体，与药剂对活体生物的实际效果仍有较大距离， 阳性率高和漏筛的情况都易发生。

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　　因此， 针对某一化合物必须认真设计不同的筛选方法，从不同角度、层次筛选化合物的杀虫、杀菌、除草、植物生长调节等生物活性，避免漏筛。

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　　2. 虽然流体分配技术及微板制作已经取得了很大的进步，在1536 孔板上进行筛选已成为现实，但发展和运行基于小体积、高密度微孔板的分析模式面临着许多技术上的难题。在开放体系中，随着表面积对体积比的增高，蒸发作用显著，而且毛细现象也影响了分析体积的准确性及分析时的浓度，加上目前流体分配技术的限制，有些分析在这种模式下可能根本不能完成。所以，要想发展超高通量筛选，就得突破目前这种微孔板的分析模式。

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　　3.微流芯片的发展可能会导致高通量筛选技术的新变化。微流芯片技术利用半导体工业中的影印石版和蚀刻技术，在玻璃或熔融石英底物上制作10-100mm 的微流通路，利用电动泵和水压来控制纳升级的液体流动，使样品的平行处理和减少试剂的消耗，以及同时完成分析检测和提高数据质量成为可能。

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　　放线菌生物活性物质的高通量筛选

　　筛选模型原理 1. 抗氧化模型。含有核黄素、蛋氨酸和四氮唑蓝的反应混合物进行光照时，将发生如下反应:甲赞蓝在560 nm 处有吸收峰，如果样品能抑制O2- 生成，将使甲赞蓝生成降低。 根据OD560即可知样品抑制率的高低。

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　　2. 一氧化氮合酶抑制剂实验模型 生物体内NOS (nitric oxide synthase) 催化产生NO的反应需NADPH 作为辅助因子，在产生NO 的同时伴随着NADPH →NADP+的转化，NADPH 受一定波长的激发可发出荧光，将酶促反应一定时间产生的NADP +再转化为NADPH，测定反应一定时间NADPH 的量即可反映NOS 的活性。

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　　问 题

　　1. 什么是组合化学，其意义何在? 2. 组合化学库有哪些合成方法? 3. 组合化学库的分析及纯化方法有哪些? 4. 组合化学库的生物活性筛选方法有哪些? 5.高通量筛选的含义是什么? 6.高通量筛选的特点是什么? 7.高容量的化合物库建立的途径是什么? 8.筛选模型的概念? 9.高通量筛选中离体筛选可以选用的靶标有哪些? 10.用于高通量筛选的检测仪器主要有哪些? 11.高通量筛选技术与农药筛选技术的关系。 12.高通量筛选中杀虫剂、杀菌剂和除草剂的筛选模型有哪些?

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