微生物学综合实验.ppt

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　　标题： 微生物学综合实验

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　　标题： 综合性实验目录

　　正文： 实验一 环境因素对微生物生长发育的影响 实验二 从自然环境中分离和纯化噬菌体 实验三 细菌生长曲线的测定 实验四 用生长谱法测定微生物的营养要求 实验五 抗生素抗菌谱及抗生菌的抗药性测定 实验六 利用BIOLOG系统进行微生物的分类鉴定 实验七 产蛋白酶和淀粉酶芽孢杆菌的分离和酶活力检测 实验八 营养缺陷型的筛选和鉴定 实验九 微生物多糖——黄原胶的发酵和提取

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　　标题： 实验 一

　　副标题： 环境因素对微生物 生长发育的影响

　　实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 实验结果 注意事项 思考题

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　　正文： 了解抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理; 掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的实验方法。

　　标题： 实验目的

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　　正文： 微生物广泛地分布在自然界的各种环境中。环境中的物理因素、化学因素和生物因素对不同类型微生物的生长发育产生不同的影响，或生存、或抑制、或死亡。反之，由于微生物的生命活动对局部区域的小环境也会产生一定的影响，或产酸、或产碱、或产酶、或产生次生代谢产物，从而可以改变自然环境。由此，微生物与自然环境之间是相互影响、相互作用的矛盾统一体。通过人为设计的环境因素对微生物生长发育影响的试验，可以有助于理解环境条件与微生物生命活动之间的关系。

　　标题： 实验原理

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　　正文： 微生物和外界环境处于相互影响的状态中，射线、紫外线 可以杀死微生物，也可以引起遗传性状发生变异;氧气与 细菌生长发育的关系密切;不同类型，不同浓度的化学药 品对微生物可以起到营养、抑制或致死的作用;青霉菌、 放线菌和某些细菌产生的抗生素可以使微生物受到抑制和 致死作用。这些物理的、化学的、生物的因素就构成了微 生物的环境因素。当外界环境适宜时，微生物进行正常的 生长、繁殖，不适宜时，微生物的生长就会受到抑制、发 生变异、甚至死亡。

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　　正文： 菌种 ① 大肠杆菌(Escherichia coli) ② 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ③ 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 1398 ④ 产黄青霉(Penicillium chrysogenum) ⑤ 丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(Clostridium acetobutylicum ) ⑥ 圆褐固氮菌((Azotobaoter chroococcum ) ?

　　标题： 实验器材

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　　正文： 培养基 ① 牛肉膏蛋白胨固体培养基(见实验八) ② 豆芽汁固体培养基 试剂 0. 1 % HgCl2、碘酒、新洁尔灭((1:1000)、 5%石炭酸。 仪器或其他用具 无菌培养皿、接种环、无菌吸管、涂布棒、黑纸、圆滤纸片，紫外光灯等。 ?

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　　正文： 紫外线可以引起微生物细胞核的核酸分子发生光化学反应，形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶与尿嘧啶的水合物，致使核酸变性。不同的照射剂量、照射时间、照射距离可以导致菌体死亡或发生变异。因此紫外线可作为物理诱变剂来进行微生物菌种的诱变和选育工作。

　　物理因素的影响—紫外线

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　　正文： 1.菌种活化 将保存的金黄色葡萄球菌斜面菌种移接新鲜斜面，37℃培养18~20h，活化1~2代，使菌体恢复生理活性。 2.制备细菌悬液 取培养18~20h的金黄色葡萄球菌活化斜面菌种一支，用4ml无菌生理盐水将斜面菌苔轻轻刮下、振荡，制成均匀的细菌悬液。 3.制备供试平板 将牛肉膏蛋白胨培养基制成平板。

　　标题： 实验方法

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　　正文： 4. 涂菌与遮盖 用无菌吸管吸取0.1mL培养18h的金黄色葡萄球菌液(约3×108个/mL)于平板上，以无菌涂布棒将菌液涂布均匀。打开培养皿盖，用三角形黑纸遮住培养基的一部分。

　　紫外线照射平板

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　　正文： 5. 紫外灯照射 紫外灯预热10~15min后，把有黑纸遮盖的平板培养皿置于紫外光灯下，打开培养皿盖，紫外线照射30~40min，灯与皿的距离约为30~40cm。照射完毕，移去黑纸，盖上皿盖，用黑纸包皿，在37℃下培养24h后，比较加黑纸与未加黑纸处，金黄色葡萄球菌的生长情况。

　　(Gp:) 遮黑纸处有菌生长

　　(Gp:) 紫外线照射处无菌生长

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　　正文： 将装有葡萄糖牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的试管加热使培养基融化，50℃保温，分别接种丙酮丁醇梭状芽孢杆菌，圆褐固氮菌和大肠杆菌，轻轻摇动使细菌上下平均分布，凝固后于30℃培养2~3d，观察各菌在深层培养基内的生长情况，判断细菌对氧气的需要情况。

　　物理因素的影响—氧气

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　　正文： 一些化学药剂对微生物生长有抑制或致死作用，因此可选择适宜的化学药剂，配制成适宜的浓度进行消毒或灭菌。

　　化学因素的影响

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　　正文： 1. 在无菌培养皿底部用记号笔注明: “1”、“2”、“3”、“4”，在皿盖注明实验名称、时间、实验者。 2.用无菌操作在培养皿内加入培养18h的金黄色葡萄球菌菌悬液1ml，再加入融化并冷却到45~55℃的牛肉膏蛋白胨固体培养基15~20mL，摇匀。 3.将浸泡在氯化汞、碘酒、新洁尔灭、石炭酸四种溶液中的圆滤纸片，分别放于标有“1”、“2”、“3”、“4”位置的培养基上。 4. 37℃温箱中培养24h，观察抑菌圈的大小，以判断各种药剂对金黄色葡萄球菌抑制性能的强弱。

　　标题： 实验方法

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　　正文： 青霉素是人类发现的第一个抗生素，青霉素对不同类型的微生物具有不同的抑制效果。对青霉素敏感的菌株，在有青霉素存在时，受到抑制，表现为不生长，反之，则表现为生长。

　　生物因素的影响

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　　正文： 1. 将豆芽汁琼脂培养基制成平板，用接种环取少许产黄青霉孢子，在平板的一侧划一直线接种，于25～27℃培养64～72h。 2. 待形成产黄青霉菌落后，再用接种环分别挑取培养18h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌1398的斜面菌苔少许，从产黄青霉菌落边缘向外划平行线接种。 3. 37℃培养24h，观察结果，根据抑菌区域，判断青霉素对该菌的抑菌效能。

　　标题： 实验方法

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　　正文： 1. 以绘图或列表的方式，报告物理因素、化学因素影响的实验结果。 2. 以图示说明产黄青霉所产生的青霉素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌的影响。

　　实验报告

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　　正文： 1. 紫外线对人体皮肤细胞等均具有杀伤作用，尽量避免其直射，特别要避免裸眼灼伤事故的发生等。 2. 紫外线杀菌效果因菌而异，因介质不同其效果也不同，处理前可做各种条件试验来确定。

　　注意事项

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　　正文： 1. 进行紫外线对微生物生长影响的试验时，不开皿盖就用紫外线照射是否可以?为什么? 2. 化学药剂对微生物所形成的抑制圈内未长菌部分是否能说明微生物细胞已被杀死? 3. 根据氧气对微生物生长发育的影响可将微生物分为几种呼吸类型?

　　思考题

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　　标题： 实验 二

　　副标题： 从自然环境中分离和纯化噬菌体

　　实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 实验结果 注意事项 思考题

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　　正文： 学习从自然环境中分离、纯化噬菌体的基本原理。 学习用双层琼脂平板法分离纯化大肠杆菌噬菌体。 观察噬菌斑。

　　实验目的

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　　正文： 由于噬菌体DNA(或RNA)侵入细菌细胞后进行复制、转录和一系列基因的表达并装配成噬菌体颗粒后，通过裂解宿主细胞或通过”挤出(exclude)”宿主细胞(宿主细胞不被杀死，如M13噬菌体)而释放出来。所以，(a)在液体培养基内可使混浊的菌悬液变为澄清或比较清，此现象可指示有噬菌体的存在;也可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而可分离到特异的噬菌体;(b)在有宿主细菌生长的固体琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌或限制被感染细菌的生长从而形成透明的或混浊的空斑，称噬菌斑(图XII-1)，一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这一现象可将分离到的噬菌体进行纯化与测定噬菌体效价。

　　实验原理

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　　正文： 1. 菌种 大肠杆菌 2. 培养基 500ml三角烧瓶内装三倍浓缩的普通牛肉膏蛋白胨液体培养基100ml，试管液体培养基，上层琼脂培养基(含琼脂0.7%，试管分装，每管4ml)，底层琼脂平板(含培养基10ml，琼脂2%)。 3. 仪器或其他用具 灭菌玻璃涂棒，灭菌吸管，无菌滤器(孔径0.22μm)，恒温水浴箱，真空泵等。 4.阴沟污水。

　　实验器材

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　　正文： 1.制备菌悬液 取经活化的大肠杆菌斜面一支，从中挑取1环菌体接种至牛肉膏蛋白胨培养液中，培养至对数期，使菌悬液在650nm的OD值为0.8左右，备用。 2.增殖噬菌体样品 取上述敏感菌培养液6ml于盛有50ml三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶内, 于37℃振荡培养4~6h后加入污水样品100ml，继续置37℃振荡培养12~24h以增殖噬菌体。

　　实验方法——噬菌体的分离

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　　正文： 3. 制备裂解液 将以上混合培养液2500r/min离心30min。 将无菌滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，常规操作连接真空抽滤装置。将离心上清液倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液经37℃培养过夜，以作无菌检查。 4. 确证实验 经过无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证实噬菌体的存在。 ① 于牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加一滴大肠杆菌悬液，再用灭菌玻璃涂棒将菌液涂成均匀的一薄层。 ② 待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面,置37℃培养过夜。如果在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑，便证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。

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　　正文： 1. 噬菌体样品的稀释 将已证明有噬菌体的滤液用牛肉膏蛋白胨培养液依次稀释为10-1、10-2、10-3、10-4和10-5共5个稀释度。 2. 倒底层琼脂平板 取9cm无菌培养皿6只，每皿倒入约10ml牛肉膏蛋白胨琼脂培养基作底层，并依次标明10 -1 、10 -2 、10 -3 、10 -4和10 -5稀释度。 3. 制备上层混合液 制备噬菌体和敏感菌的混合液，即在标明10 -1 、10 -22、10 -3、10 -4和10 -5共5支无菌试管内各加入0.2ml培养至对数期的大肠杆菌悬液，然后在上述各对应试管中分别加入相应稀释度的噬菌体液0.1ml后混均，37℃保温5min待噬菌体吸附与侵入的寄主细胞。

　　实验方法——噬菌体的纯化

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　　正文： 4. 倒上半层固体琼脂平板 在上述各噬菌体和敏感菌的混合试管中各加入3~3.5ml约50℃左右的上层牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基，立即搓试管使培养基与菌悬液充分混匀，并对号倒在含有底层琼脂平板的表面，迅速铺平，待凝。 5. 培养 待上层琼脂凝固后，将平板倒置于37℃温箱中培养18~24h，即可观察到形成的大肠杆菌噬菌斑。 6. 噬菌斑的纯化 在噬菌斑分布较分散的平板上，用接种针(或环)挑取典型的噬菌斑，接种至含有大肠杆菌的肉汤培养液中，放37℃下培养18~24h，以增殖噬菌体。然后重复上述分离纯化步骤，直至在平板表面的菌苔中出现形态和大小完全一致的噬菌斑时，才可认为获得了较纯化的大肠杆菌噬菌体。

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　　正文： 7. 噬菌体效价增殖 刚分离纯化的噬菌体的效价往往不高，为获得效价较高的噬菌体液，常可用液体法或固体平板法加以增殖。液体增殖法是在原来含有噬菌体的样品液中，通过不断定时的加入对数期敏感菌液，经培养以增殖与提高悬液中噬菌体的效价;固体平板增殖法与上述纯化噬菌体的双层琼脂平板法相似，只是在制备噬菌体和敏感菌的混合管时，两者同时加大浓度，以期获得高效价的噬菌体液。 8. 去除菌体 在上述增殖的噬菌体液中常含有不少的敏感菌，它会影响噬菌体的保存期，故必须及时去除干净。常用的方法有细菌滤器法除去菌体细胞;也可用离心法去除菌体细胞，再在噬菌体的增值液中加数滴氯仿杀死残留菌体，已获得便于保存的纯化的高效价噬菌体。

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　　正文： 1. 描述各种分离平板上所得到的噬菌斑的大小、形态等特征。 2. 记录各平板上所出现的噬菌斑数。

　　实验报告

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　　正文： 1. 液体抽滤完毕，应打开安全瓶的放气阀增压后再停真空泵，否则将产生滤液回流，污染真空泵。 2. 噬菌体分离和纯化过程中所制备的底层和上层琼脂培 养基均须在水平位置待凝。 3. 在用双层琼脂平板法进行噬菌体的分离、纯化或效价 测定时，上层敏感菌液与噬菌体样品的混匀与吸附时间不宜太长，一旦加入上层半固体琼脂后，要立即搓匀浇注平板上层并迅速铺平。

　　注意事项

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　　正文： 1. 能否用伤寒杆菌(肠道菌)悬液作为宿主细胞分离大肠杆菌(肠道菌)的噬菌体，为什么? 2. 若要分离纯化脓性细菌的噬菌体，取什么样品材料最容易得到? 3. 试比较分离纯化噬菌体与分离纯化细菌、放线菌等在基本原理和具体方法上的异同。 4. 新分离到的噬菌体滤液要证实确有噬菌体的存在，除本实验用的平板法观察噬菌斑的存在以外，还可以用什么方法?如何证明? 5. 加大肠杆菌增殖的污水裂解液为什么要过滤除菌，不过滤的污水将会出现什么实验结果，为什么? 6. 某生产抗生素的工厂在发酵生产卡那霉素时发现生产不正常，主要表现为:发酵液变稀，菌丝自溶，氨态氮上升,你认为可能原因是什么?如何证实你的判断是否正确?

　　思考题

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　　标题： 实验 三

　　副标题： 细菌生长曲线的测定

　　实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 实验结果 注意事项 思考题

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　　正文： 1. 了解细菌生长曲线的基本特征，测定大肠杆菌在不同培养条件下的生长曲线。 2. 掌握利用细菌悬液的混浊度间接测定细菌生长的方法。

　　标题： 实验目的

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　　正文： 生长曲线就是把一定量的单细胞微生物接种到恒定容积的液体培养基中，在合适的条件下进行培养，在此过程中，其细胞数目将随培养时间的延长而发生规律性的变化，如以细胞数目的对数值(或OD值)为纵坐标，以培养时间为横坐标作一条曲线，即为微生物的生长曲线，它反映了微生物群体的生长规律。依据其生长速率的不同，可把生长曲线分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。

　　标题： 实验原理

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　　正文： 测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数法、平板菌落计数法、称重法、比浊法等。 本实验采用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定，由于细菌悬浮液的浓度与混浊液成正比，因此，可利用分光光度计测定菌悬浮的光密度来推知菌液的浓度，并将所测得的光密度值(OD值)与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的实生长曲线。

　　标题： 实验原理

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　　正文： 1. 菌种 培养18~20h的大肠杆菌(Escherichia coli)培养液。 2. 培养基 (1)牛肉膏蛋白胨液体培养基 (2)葡萄糖铵盐合成培养基 3. 仪器或其他用具 723型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。

　　标题： 实验器材

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　　正文： 葡萄糖 2.0g K2HPO4 7.0g KH2PO4 2.0g 柠檬酸钠·2H2O 0.5g MgSO4 ·7H2O 0.1g (NH4)2 SO4 2.0g 水 1 000ml pH 7.2

　　标题： 葡萄糖铵盐合成培养基

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　　正文： 1. 菌种的培养 取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑 取1环，接入牛肉膏蛋白胨培养液中，静止培养18~24h 左右。此菌液用作“种子”培养液。 2. 分装培养基 将牛肉膏蛋白胨液体培养基和葡萄糖铵盐 液体培养基分装11支试管，每管内5ml。用记号笔标明 培养时间，即0、1.5,、3、 4、 6、8、10、 12、14、16 和20 h。

　　标题： 实验方法

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　　正文： 3. 接种 用1 ml无菌吸管，每次准确地吸取0.2ml大肠杆菌培养液分别接种到已编号的11支牛肉膏蛋白胨液体培养基和11支葡萄糖铵盐液体培养基试管中，接种后振荡，使菌体混匀。 4. 培养 将已接种的试管置摇床37℃振荡培养，振荡频率250 r /min(温度和频率可随需要调节)。分别在0、1.5,、3、 4、 6、 8、10、 12、14、16和20 h将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。

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　　正文： 5. 比浊侧定 分别以未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基和葡萄糖铵盐液体培养基作空白对照，选用600 nm波长进行光电比浊测定。从最稀浓度的菌悬液开始依次测定，对细胞密度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基和葡萄糖铵盐液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1～ 0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)，记录OD值时，注意乘上所稀释的倍数。

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　　标题： 实验报告

　　将测定的OD600值填入下表：

　　(Gp:) 光密度值OD

　　(Gp:) 天然培养基

　　(Gp:) 合成然培养基

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 培养时间(h)

　　(Gp:) 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 18 20

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　　正文： 2. 绘制大肠杆菌的生长曲线： 以上述表格中的时间为横坐标，大肠杆菌的OD值为纵坐标，在坐标纸上作图。所绘制成的曲线即为大肠杆菌在本实验条件下的生长曲线。

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　　正文： 在生长曲线测定中，一定要用空白对照管的培养液随时校正仪器的零点。

　　标题： 注意事项

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　　正文： 1.如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么优缺点? 2.细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短? 若细胞密度为103/ml，培养4.5 h后，其密度高达2 ×108/ ml，请计算出其代时。 3.次生代谢产物的大量积累在哪个时期? 根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多?

　　标题： 思考题

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　　标题： 实验 四

　　副标题： 用生长谱法测定微生物的营养要求

　　实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 实验结果 注意事项 思考题

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　　正文： 学习并掌握生长谱法测定微生物营养需要的基本 原理和方法。

　　标题： 实验目的

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　　正文： 微生物的生长繁殖需要适宜的营养环境，碳源、氮源、无机盐、微量元素、生长因子等都是微生物生长所必需，缺少其中一种，微生物便不能正常生长、繁殖。在实验室条件下，人们常用人工配制的培养基来培养微生物，这些培养基中含有微生物生长所需的各种营养成分。如果人工配制一种缺乏某种营养物质(例如碳源)的琼脂培养基，接入菌种混合均匀后倒平板，再将所缺乏的营养物质(各种碳源)点植于平板上，在适宜的条件下培养后，如果接种的这种微生物能够利用某种碳源，就会在点植的该种碳源物质周围生长繁殖，呈现出由许多小菌落组成圆形区域(菌落圈)，而该微生物不能利用的碳源周围就不会有微生物的生长，最终在平板上呈现一定的生长图形。

　　标题： 实验原理

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　　正文： 由于不同类型微生物利用不同营养物质的能力不同，它们在点植有不同营养物质的平板上的生长图形就会有差别，具有不同的生长谱，故称此法为生长谱法。该法可以定性、定量地测定微生物对各种营养物质的需求，在微生物育种、营养缺陷型鉴定以及饮食制品质量检测等诸多方面具有重要用途。

　　标题： 实验原理

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　　正文： 菌种 大肠杆菌 培养基 合成培养基。 溶液或试剂 木糖，葡萄糖，半乳糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，无菌生理盐水等。 仪器或其他用具 无菌平皿，无菌牙签，吸管。

　　标题： 实验器材

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　　正文： (NH4)3 SO4 1.0g KCl 0.2g MgSO4 ·7H2O 0.2g 豆芽汁 10ml 琼脂 20.0g 蒸馏水 1 000ml pH 7.0 加12ml 0.04%的溴甲酚紫(pH5.2~6.8，颜色由 黄变紫，作指示剂)，121℃灭菌20min。

　　合成培养基

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　　正文： 1. 将培养24h的大肠杆菌斜面用无菌生理盐水洗下，制成菌悬液。 2. 将合成培养基溶化并冷却至50℃左右，加入上述菌悬液并混匀，倒平板。 3. 在两个已凝固的平板皿底用记号笔分别划分三个区域，并标明要点植的各种糖。 4. 用6根无菌牙签分别挑取6种糖对号点植。 5. 待糖粒溶化后再将平板倒置于37℃ 温室保温18~24h，观察各种糖周围有无菌落圈。

　　标题： 实验方法

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　　(Gp:) 生长谱法测定大肠杆菌营养要求示意图

　　(Gp:) A

　　(Gp:) C

　　(Gp:) B

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　　正文： 绘图表示大肠杆菌在平板上的生长状况，根据实验结果，大肠杆菌能利用的碳源是什么?

　　标题： 实验报告

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　　正文： 1. 注意点植时糖要集中，取糖量为小米粒大小即可，糖过多时，溶化后糖溶液扩散区域过大会导致不同的糖相互混合。 2. 注意点植糖后不要匆忙将平板倒置，否则尚未溶化的糖粒会掉到皿盖上。

　　标题： 注意事项

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　　正文： 1. 在生长谱法测定微生物碳源要求的实验中，发现某一不能被该微生物利用的碳源周围也长出菌落圈，试分析各种可能的原因，并设法解决这个问题。 2. 在某微生物学实验室的一个学生不慎将两种较贵重的氨基酸样品的标签弄混，这两种氨基酸样品均为白色粉末，在外观上很难区分，他一时难以找到进行纸层析分析所需的标准氨基酸对照样品，实验室也不具备氨基酸分析仪，但此实验室有许多不同类型的氨基酸营养缺陷型菌株，在这种情况下，能采取什么简单的微生物学实验将此两种氨基酸样品区分开?

　　标题： 思考题

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　　标题： 实验 五

　　副标题： 抗生素抗菌谱及抗生菌的抗药性测定

　　实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 实验结果 注意事项 思考题

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　　正文： 学习抗生素抗菌谱的测定方法 了解常见抗生素的抗菌谱。

　　标题： 实验目的

　　抗生素抗菌谱的测定示意图

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　　正文： 每种抗生素都有一定的抗菌范围。每种抗生素特有的抗菌范围，即能杀灭或抑制的微生物种类，医学上称为抗菌谱。每种抗生素都有自己特定的抗菌谱，在使用抗生素之前，必须了解该药物的抗菌谱，这样才能做到对症下药，有的放矢。同时要了解病人感染的病菌种类，再根据抗生素的抗菌谱来选择对病菌最有效的抗生素，所以了解每种抗生素的抗菌谱对于临床选择抗生素，合理使用及提高疗效都具有重要意义。

　　标题： 实验原理

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　　正文： 菌株 金黄色葡萄球菌(Staphylocuccus aureus )、大肠杆菌(E. coli )斜面菌种(野生株及不同抗药程度的抗链霉素菌株3株)。 牛肉膏蛋白栋培养基斜面。 供试抗生素 氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、链霉素和四环素。 仪器或其他用具 恒温培养箱、镊子、圆滤纸片(直径为8.5 mm)或牛津杯、培养皿(直径12cm) .

　　标题： 实验器材

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　　正文： 1.供试菌的培养与制备 将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接种在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面上，置37℃下培养18--24h，取出后用5mL无菌水洗下，使成菌悬液备用。 2. 配制所需浓度的抗生素 将抗生素分别配制成以下浓度: 氨苄青霉素100ug/ml(溶于水)，氯霉素200ug/ml(溶于乙醇)，卡那霉素100 ug/ml(溶于水)，链霉素100ug/ml(溶于水)，四环素100ug/ml(溶于乙醇)，配制好的溶液经0.45um的滤膜无菌过滤后备用。

　　标题： 实验方法

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　　正文： 3. 抗生素抗菌谱的测定 采用液体扩散法，分别吸取供试菌悬液O . 5m1，加在牛肉膏、蛋白胨琼脂平板上，用无菌涂布器涂布均匀，待平板表面液体渗干后，在皿底用记号笔分成6等份，每一等份标明一种抗生素, 设一无菌水作对照，用滤纸片法或杯碟法测定。具体方法是：用无菌镊子将滤纸片浸人上述抗生素溶液中，取出，并在瓶内壁除去多余的药液，以无菌操作将纸片对号转放到接好供试菌的平板的小区内，或将牛津杯置于供试菌的平板上，加入一定量的抗生素溶液，置37℃培养18--24h,测定抑菌圈的直径，用抑菌圈的大小来表示抗生素的抗菌谱。

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　　正文： 4. 抗生菌的抗药性测定 ⑴制备链霉素药物平板 取4套无菌培养皿，血底标记编号，从链霉素溶液(100ug/ml)中，分别吸出0.2，0.4，0.6和0. 8mL，加至以上培养皿中，倒人冷却至50℃的融化牛肉膏蛋白胨培养基中，迅速混匀，制成药物平板，待凝后在每个平皿的皿底划分成4份，并注明1--4号，备用。 ⑵抗药性测定在以上1~3号空格上分别接上不同抗药程度的抗链霉素菌株3株，在4号接入野生型菌株作对照，37℃培养24h后观察菌生长情况，并记录。以“+”表示生长，以“一”表示不生长。

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　　正文： 1.将抗生素的抗菌结果填人下表中:

　　标题： 实验报告

　　(Gp:) 抗菌素名称

　　(Gp:) 氨苄青霉素 链霉素 卡那霉素 氯霉素 四环素 对照(无菌水)

　　(Gp:) 金黄色葡萄球菌

　　(Gp:) 大肠杆菌

　　(Gp:) 作用机制

　　(Gp:) 抗菌谱(抑菌圈直径/mm)

　　2.根据以上结果说明供试抗生素的抗菌谱。 3.记录不同大肠杆菌的抗药性测定结果 。

　　65张

　　正文： 1. 供试菌液涂布于平板后，待菌液稍干再加入滤纸片或牛津杯。 2. 制备药物平板时，注意把药物与培养基充分混匀。

　　标题： 注意事项

　　66张

　　正文： 1.抗生素对微生物的作用机制有几种?举例说明之。 2.如供试菌为酵母菌、放线菌或霉菌，应如何测定抗生素的抗菌谱?

　　标题： 思考题

　　67张

　　标题： 实验 六

　　副标题： 利用BIOLOG系统进行微生物的分类鉴定

　　实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 实验结果 注意事项 思考题

　　68张

　　正文： 通过实验学习利用计算机微生物分类鉴定系统进行分类鉴定的基本原理和一般操作方法。 了解一般细菌、芽孢杆菌、霉菌和酵母在分类鉴定时，菌种培养和菌悬液制备方法的差异。 学习并掌握人工读取和读数仪读取微孔培养板的结果。 学习使用BIOLOG MicroLog软件，掌握数据库使用方法。

　　标题： 实验目的

　　69张

　　正文： 传统的微生物分类鉴定对需鉴定的菌株通过个体、群体形态的观察、染色反应、生理生化特征、血清学反应等进行实验考察。其实验结果用《伯杰氏鉴定细菌学手册》(Holt J.Get al Bergey’s Manaal of Determinitive Bacteriology,9th,1994)检索，以确定待测菌株的分类地位和菌株的学名。传统的分类方法操作复杂、费时费力。 20世纪90年代美国BIOLOG公司研制开发出BIOLOG系统，用于微生物(细菌、放线菌、霉菌、酵母菌)的快速鉴定。结合16SrRNA序列分析和G+Cmol%，可以将未知菌鉴定到种的分类水平。目前在仪器条件具备的实验室已采用用计算机微生物分类鉴定系统，待测菌株能在相对短的时间内，得到分类鉴定结果。

　　标题： 实验原理

　　70张

　　正文： BIOLOG分类鉴定系统的微孔板有96孔，横排为：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12;纵排为：A、B、C、D、E、F、G、H。96孔中都含有四唑类氧化还原染色剂，其中A1孔内为水，作为对照。其他95孔是95种不同的碳源物质。 待测细菌利用碳源进行代谢时会将四唑类氧化还原染色剂从无色还原成紫色，从而在微生物鉴定板上形成该微生物特征性的反应模式或“指纹”，通过人工读取或者纤维光学读取设备——读数仪来读取颜色变化，并将该反应模式或“指纹”与数据进行比对，就可以在瞬间得到鉴定结果，对于真核微生物——酵母菌和霉菌还需要通过读数仪读取碳源物质被同化后的变化(即浊度的变化)，以进行最终的分类鉴定。

　　标题： 实验原理

　　71张

　　正文： 1. 菌种 非芽孢细菌(如Pseudomonas putida 恶臭假单细胞)1株; 芽孢杆菌(如Bacillus subtilis 枯草芽孢杆菌)1株; 酵母菌(如Saccharomyces cerevisiae 啤酒酵母菌)1株; 霉菌(如Aspergillus niger 黑曲霉)1株。 2. 培养基 BIOLOG专用培养基 3. 试剂 BIOLOG 专用菌悬液稀释液、脱血纤维羊血、麦芽糖、麦芽汁提取物、琼脂粉、蒸馏水等。 4. 仪器 BIOLOG 微生物分类鉴定系统及数据库、浊度仪、 读数仪、恒温培养箱、光学显微镜、 pH 计、八道移液器、试管等。 ?

　　标题： 实验器材

　　72张

　　正文： 1. 待测微生物的纯培养 使用 Biolog 推荐的培养基和培养条件 , 对待测微生物进行纯化培养。 2. 以待测微生物的革兰氏染色反应结果选择实验模式 确认待测微生物的革兰氏染色反应是阴性还是阳性、显微观察待鉴定细菌是球菌还是杆 菌, 以判断微孔板的使用种类。即阳性菌采用 GP、阴性菌采用 GM; 真菌无革兰氏染色反应 , 则酵母菌采用 YT, 霉菌采用 FF 。

　　标题： 实验方法

　　73张

　　正文： 3. 制备特定浓度的菌悬液 氧浓度决定待测微生物培养后的细胞浓度 , 在 BIOLOG 系统中 , 氧浓度是必须控制的关键参数。因此, 接种物的准备必须严格按照 BIOLOG 系统的要求进行。如果是 GP 球菌和忏菌, 则在菌悬液中加入3滴巯基乙酸钠和 lmL 10Ommol/L 的水杨酸钠。使菌悬液浓度与标准悬液浓度具有同样的浊度。 4. 接种并对点样后的微孔板进行培养 使用八道移液器, 将菌悬液接种于微孔板的96孔中;一般 细菌150μL, 芽孢菌 150μL,酵母菌100μL, 霉菌100μL 。 接种过程不能超过20min 。

　　74张

　　正文： 5. 读取结果 读取结果之前要对读数仪进行初始化。 可事先输入微孔板的信息， 以缩短读取结果时间, 这对人工读取 和读数仪读取结果都适用。由于工作表中无培养时间, 所以人工读取和读数仪读取结果时首先要选择培养时间, 然后选择 Select Read, 从已打开的工作表读取结果, 之后可以 Read Next 按次序读取结果。 如果认为自动读取的结果与实际不符, 可以人工调整域值以得到认为是正确的结果。对霉菌域值的调整会导致颜色和浊度的阴阳性都发生变化。实验时应加以注意。 GN、GP 数据库是动态数据库, 微生物总是最先利用最适碳源并最先产生颜色变化，颜色变化也最明显; 对次最适的碳源菌体利用较慢, 相应产生的颜色变化也较慢, 颜色变 也没有最适碳源明显。动态数据库则充分考虑了微生物这种特性, 使结果更准确和一致。 酵母菌和霉菌是终点数据库; 软件同时检测颜色和浊度的变化。

　　75张

　　正文： 6. 结果解释 软件将对96孔板显示出的实验结果按照与数据库的匹配程度列出10个鉴定结果 , 并ID框中进行显示, 如果第1个结果都不能很好匹配, 则在 ID框中就会显示 "No ID" 。 评估鉴定结果的准确性: %PROB 提供使用者可以与其他鉴定系统比较的参数; SIM示 ID与数据库中的种之间的匹配程度;DIST 显示 ID 与数据库中的种间的不匹配程度。 种的比较：“+” 表示样品和数据库的匹配程度≥ 80%;“一”表示样品和数据库的匹配程度≤ 20% 。 欲查看 10 个结果之外的结果 , 按 Other 显示框。 双击 Other 显示数据库, 在数据库中选中欲比较的种, 就可以显示出各种指标; 用右键点击显示动态数据库和终点数据库。

　　76张

　　正文： 1. 报告实验所选用的菌种、BIOLOG 实验模式的选择、 BIOLOG 的鉴定结果。 2. 评估鉴定结果的准确性, 若鉴定结果不理想, 分析其可能原因。

　　标题： 实验报告

　　77张

　　正文： 1. 氧浓度决定待测微生物培养后的细胞浓度 , 在BIOLOG系统中 , 氧浓度是必须控制的关键参数，使菌悬液浓度与标准悬液浓度具有同样的浊度。 2. 将菌悬液接种于微孔板的96孔中，接种过程不能超过20min。 3. 读取结果之前要对读数仪进行初始化。

　　标题： 注意事项

　　78张

　　正文： 1. BIOLOG 分类鉴定系统能够 100% 的鉴定出微生物的属名和种名吗 ? 如果不能，还需要进行什么实验才能鉴定出菌株的种名 ? 2. 鉴定冻干菌种时，需要如何进行前处理 ? 3. 需要严格控制接种液的浊度吗? 4. 人工读数时, 如果有些微孔有些颜色, 但不明显, 如何判断? 5. 鉴定细菌时, 如果 4h 鉴定的结果与 16~24h 的结果不同, 该如何判断结果 ? ?

　　标题： 思考题

　　79张

　　标题： 实验 七

　　副标题： 产蛋白酶和淀粉酶芽孢杆菌的分离和酶活力检测

　　实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 实验结果 注意事项 思考题

　　80张

　　正文： 通过本实验学习从自然界中分离产酶微生物的方法。 培养学生自行设计实验流程，判断实验结果的能力。 对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练。

　　标题： 实验目的

　　81张

　　正文： 酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和、安全、无毒、环境污染少，人们很早就开始从动物脏器和植物体提取胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等酶，用于科学研和生产实践。而不同类型的微生物由于自身生长的需要，产生并向胞外分泌能水解大分子蛋白和淀粉的酶类，使不能透过微生物细胞的大分子物质经酶解后形成小分子糖、小肽和氨基酸，可为微生物提供碳素和氮素营养。由于微生物体积小，生长速度快，易于大规模生产，从微生物中制取酶已成为发酵工业中的一个新兴领域。目前能由工业生产的50多种酶制剂，大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。酶制剂中的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶在食品、洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、药用等领域具有广泛的应用价值。

　　标题： 实验原理

　　82张

　　正文： 在自然界的土壤中有可能分布着能产蛋白酶和淀粉酶的芽孢杆菌，通过土样稀释、加热土样悬液、杀死非芽孢细菌、平板分离可获得细菌的单菌落，经革兰氏染色、芽孢染色可判断分离菌株是否为芽孢杆菌，将单菌落点接含有酪素(酪蛋白)或淀粉的平板，凡是具有产蛋白酶能力的芽孢杆菌水解酪素生成酪氨酸，在酪素平板上菌落周围出现透明的水解圈，而具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围也会出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。由此可将产蛋白酶或产淀粉酶能力的菌株分离。分离后的菌株通过产酶培养基发酵产酶，按特定方法可检测出分离菌株的酶活力。

　　标题： 实验原理

　　83张

　　正文： 菌种 自行分离筛选产蛋白酶和淀粉酶的芽孢 杆菌 培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基 酪素培养基 产蛋白酶发酵培养基 淀粉培养基 产淀粉酶发酵培养基

　　标题： 实验器材

　　84张

　　正文： 试剂 ①用于蛋白酶活力检测的试剂 ②用于淀粉酶活力检测的试剂 ③革兰氏染色液 ④芽孢染色液 仪器或其他用具 三角烧瓶、烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶、载玻片、培养皿，稀释用无菌水或缓冲液、大试管、漏斗、滤纸、接种环、酒精灯、水浴锅、试管架、光学显微镜、往复式摇床、紫外分光光度计。

　　标题： 实验器材

　　85张

　　正文： 1. 采集土样，用10倍稀释法根据芽孢杆菌耐热的性能，选择适宜的稀 释度，加热处理稀释液以杀死无芽孢细菌，浓缩芽孢杆菌。 2. 用平板划线法分离单菌落。37℃培养24~48h，挑取表面干燥、粗糙、不透明、污白色或微带黄色的菌落。 3. 通过革兰氏染色、芽孢染色，判别所选菌落是否为芽孢杆菌。 4. 从已判断为芽孢杆菌的菌落处，分别点接酪素平板和淀粉平板，培养后，目测观察酪素平板的水解圈、卢戈氏碘液检测淀粉平板水解圈。 5. 挑取具有酪素水解能力和淀粉水解能力的菌落，接种相应的产酶培养基，振荡通气培养，设定发酵时间、取样时间，进行蛋白酶和淀粉酶酶活力检测。

　　标题： 实验方法

　　86张

　　正文： 6. 酶活力检测 ①蛋白酶活力检测(紫外分光光度测定法) 蛋白质或多肽在275nm波段处具有最大吸收值，利用蛋白酶同酪蛋白底物反应前后在三氛乙酸中可溶物的紫外吸收增值，可表示蛋白酶活力高低。

　　87张

　　正文： a. 取5mL用pH 8硼酸缓冲液制备的0.6%酪蛋白溶液于试管中，40℃预热2min后加1：20以pH 8硼酸缓冲液稀释的酶液(即取1mL蛋白酶摇瓶发酵液，加19mL缓冲液) 1mI， 40℃反应l0min后，加5mL 0.4mo1/L三氯乙酸以终止反应，沉淀残余底物。40℃保温20min，使沉淀完全，用漏斗加滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275nm的光密度。 b. 另以先加三氯乙酸使酶失活、后加酪蛋白的试管，按上述同样步骤测定光密度，作为空白对照。 c. 预先制作酪氨酸275nm吸收光密度标准曲线(由教师制备)。

　　蛋白酶活力检测—紫外分光光度测定法

　　88张

　　正文： d. 酶活力定义：以l min内由酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm的光密度与1μg酪氨酸相当时，其所需要的酶量为1个单位。 ? ? 式中，10 =反应时间l0min; O. D(酪)=1μg/mL的光密度;n=酶液稀释倍数。

　　(Gp:) 酶活力(U/mL)= ×n

　　(Gp:) O.D(酶)

　　(Gp:) 10×O.D(酪)

　　89张

　　正文： a.吸取1mL标准糊精溶液，置于盛有3mI标准稀碘液的试管中，作为比较颜色的标准管。 b.在25mm×200mm试管中，加入2%可溶性淀粉溶液20 mL，pH 6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液5mL，在60℃水浴中平衡温度4~5min，加入1 :10稀释酶液(即取1mL淀粉酶摇瓶发酵液，加入pH 6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液9mL) 0.5mL，充分混匀，定时(间隔l0min) 取1mL反应液加入预先盛有比色稀碘液的试管中，当颜色反应由紫色逐渐变成棕橙色，与标准比色管颜色相同时，即到达反应终点，记录反应总时间即为液化时间。

　　淀粉酶活力检测—Wohlgemuth Hagihara改良法

　　90张

　　正文： c. 酶活力定义: 以1mL酶液于60℃，pH 6. 0的条件下，在1h内液化可溶性淀粉的克数为1个酶活力单位。 酶活力单位(g/ml)=(60/t×20×2%×n) ×0.5=48n/t 式中 n — 酶液稀释倍数; 20 — 可溶性淀粉溶液的毫升数; 0.5 — 测定时所用酶量; 2%— 可溶性淀粉浓度; 60 — 反应时间为60min; t — 测定时记录的液化时间。 ?

　　91张

　　正文： 查阅相关文献，以论文形式报告本次实验结果。 前言 实验材料 实验方法 实验结果 讨论

　　实验报告

　　92张

　　正文： 可溶性淀粉溶液应当天配制当天使用，不能久贮。

　　注意事项

　　93张

　　正文： 1.你所设计的实验流程是否合理?实验中有无疏漏和失误? 2.实验中的酶活力检测是否出现负结果?如有，请分析原因。 3.对所筛选出的菌株如何进一步提高酶活力?请提出设想和方案。

　　思考题

　　94张

　　标题： 实验 八

　　副标题： 营养缺陷型的筛选和鉴定

　　实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 实验结果 注意事项 思考题

　　95张

　　正文： 学习营养缺陷型的筛选和鉴定方法。 了解营养缺陷型在生命科学研究中的应用。

　　标题： 实验目的

　　96张

　　正文： 营养缺陷型突变株是一种由于野生型菌株的某一基因发生突变，而使它丧失了合成某种物质能力的突变株。该突变株只有在基本培养基中补充它们所需要的营养物质后才能生长。 营养缺陷型菌株无论在生产实践和科学研究中都具有重要意义。在生产实践中，它既可直接用作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间代谢产物的生产菌株，也可作为杂交育种的亲本菌株;在科学实验中，它们既可作为氨基酸、维生素或碱基等物质生物测定的试验菌种，也是研究代谢途径和转化、转导、杂交、细胞融合及基因工程等遗传规律所必不可少的遗传标记菌种。 营养缺陷型的筛选包括细胞或分生孢子的诱变处理、营养缺陷型的浓缩、营养缺陷型的检出以及营养缺陷型的鉴定4个主要步骤。本实验采用紫外线来处理大肠杆菌以提高起突变率。

　　标题： 实验原理

　　97张

　　正文： 菌种 大肠杆菌( E. coli )斜面菌种。 培养基 细菌基本培养基 LB培养基(固体和液体) 溶液或试剂 PB缓冲液(pH 7.0)，氨苄青霉素、氨基酸、碱基混合物、维生素混合物。 仪器或其它 台式离心机、多用振荡器、磁力搅拌器、紫外灯(30W)、离心管、各种试管、培养皿、三角瓶、接种环、酒精灯、无菌牙签、涂布器。

　　标题： 实验器材

　　98张

　　正文： 1. 细菌悬液的制备 取一环E. coli斜面菌种划线接种在LB固体平板上，37℃培养12～16h挑取单菌落接入装有3mL LB液体培养基的试管中，37℃, 200r/min培养12～16h，取此培养液0.5mL接入含有50mLLB液体培养基的250mL三角瓶中，37℃，200r/min培养2～4h(培养至对数期)，将培养液离心(3000r/min，10 min)弃上清，菌体用PB离心洗涤两次(离心条件同前)，最后用PB悬浮细胞，菌落计数器计数，使细胞浓度控制在107～108/mL。

　　标题： 实验方法

　　99张

　　正文： 2. 诱变处理 取上述菌悬液2mL于小培养皿(直径6cm，内含搅拌子)中，将培养皿放置在磁力搅拌器上，在搅拌状态下接受紫外照射2～5min(紫外灯30W，距离30cm)，照射完毕立即离心，收集细胞，并避光保存。 3. 营养缺陷型的浓缩 将上述诱变处理过的细菌细胞接入含有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃ 200r/min培养2～4h，离心收集细胞，并用基本培养基洗涤两次，用4mL基本培养基悬浮细胞，取2mL细胞悬液接入50mL含有氨苄青霉素(终浓度20～60μg/mL)的基本培养基中，37℃ 200r/min培养3～4h，离心，取沉淀，用PB洗涤两次后用PB制成细胞悬液，并用PB适当稀释，取100～200μL稀释液涂LB 固体平板，37℃培养12～16h。

　　100张

　　正文： 4. 营养缺陷型的检出 将LB平板上形成的每个菌落用无菌牙签分别点种在基本培养基和LB固体培养基的相应位置上，37℃培养12～16h。将在LB培养基上生长而在基本培养基上不生长的菌落继续接种在基本培养基和LB固体培养基的对应位置上，如此传代5～6次，最后在LB上生长而在基本培养基相应位置上不生长的菌落即可确定为营养缺陷型菌株。 5. 营养缺陷型的鉴定 把挑出的缺陷型用PB悬浮制成菌悬液(106 ～108 /mL)，取100 ～200μL涂布在固体基本培养基的表面，待表面干燥后，在标定位置上放置少量氨基酸、碱基或维生素的结晶(或滤纸片)，37℃培养12～16h。缺陷型在所需的化合物周围出现混浊的生长圈。现一般把几种化合物编为一组，按下表进行测定：

　　101张

　　营养缺陷型检测分组表

　　(Gp:) 组别

　　(Gp:) 化合物代号

　　(Gp:) A

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 7

　　(Gp:) 8

　　(Gp:) 9

　　(Gp:) 10

　　(Gp:) 11

　　(Gp:) B

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 7

　　(Gp:) 12

　　(Gp:) 13

　　(Gp:) 14

　　(Gp:) 15

　　(Gp:) C

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 8

　　(Gp:) 12

　　(Gp:) 16

　　(Gp:) 17

　　(Gp:) 18

　　(Gp:) D

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 9

　　(Gp:) 13

　　(Gp:) 16

　　(Gp:) 19

　　(Gp:) 20

　　(Gp:) E

　　(Gp:) 5

　　(Gp:) 10

　　(Gp:) 14

　　(Gp:) 17

　　(Gp:) 19

　　(Gp:) 21

　　(Gp:) F

　　(Gp:) 6

　　(Gp:) 11

　　(Gp:) 15

　　(Gp:) 18

　　(Gp:) 20

　　(Gp:) 21

　　102张

　　正文： 按上表可在一个培养皿上测定出一个营养缺陷型菌株对21种化合物的需要情况。如若在放有C组化合物的周围出现生长圈，则这一缺陷型缺少化合物3。如若在C组和D组位置周围都出现生长，则这一缺陷型所需要的化合物是16。如若在C组和D组之间出现生长，说明这一缺陷型同时需要C. D.这两组化合物中的各一种，具体是哪两种，尚需进一步鉴定。 ?

　　103张

　　正文： 1.绘制营养缺陷型挑选的流程简图。 2.试述营养缺陷型浓缩的机理是什么。 3. 查阅相关文献，以论文形式报告本次实验结果。 ? ?

　　标题： 实验报告

　　104张

　　正文： 1.紫外诱变后要避光培养。 2.操作的各个环节要无菌操作。 ?

　　标题： 注意事项

　　105张

　　正文： 1.营养缺陷型挑选时应注意哪些问题? 2.试设计一实验，如何获得Aspergillus niger的营养缺陷型。 3.试设计一实验，如何能获得E . coli的丙氨酸营养缺陷型( ala-)。 ?

　　标题： 思考题

　　106张

　　标题： 实验 九

　　副标题： 微生物多糖——黄原胶的发酵和提取

　　实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 实验结果 注意事项 思考题

　　107张

　　正文： 1. 了解微生物多糖在工业上的用途。 2. 学习微生物发酵法制取黄原胶。

　　标题： 实验目的

　　108张

　　正文： 多糖是由多个单糖分子经脱水缩合而形成的结构复杂、高分子量的糖类物质。广泛分布于自然界中。如植物合成的淀粉、纤维素、半纤维素、，菊糖、琼脂;作为甲壳动物外骨骼的几丁质(甲壳素)，动物和人体内的透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素以及血浆糖蛋白、黏液糖蛋白等。存在于动植物体内和人体的多糖有的为贮藏物质，有的具有生理功能。 多糖也出现在微生物中，G+和G—细菌细胞壁的主要成分——肽聚糖就是由细菌的细胞质合成运送至细胞膜外，构成细胞壁的多糖物质。有些细菌如芽孢杆菌，大肠杆菌在高C/N比的环境中生长，将外界的含C物质吸收到细胞内，以淀粉糖，肝糖的形式贮存起来，成为颗粒状内含物;有些细菌，如肠膜状明串珠菌可利用蔗糖，合成右旋糖酐——葡聚糖，经右旋糖酐酶酶解成不同分子量的右旋糖酐，在医药上用作血浆代用品;由纹膜醋杆菌合成的纤维素，则可以用于制取食用纤维素。

　　标题： 实验原理

　　109张

　　正文： 目前，利用微生物产生多糖的性能，实现大规模工业化生产形成可供市场需求的商品，当属由野油菜黄单胞菌(Xanthomona campestris)产生的胞外荚膜多糖，商品名称为黄原胶，这种多糖是由葡萄糖，甘露糖，葡萄糖醛酸，乙酸和丙酮酸构成的酸性杂多糖，其水溶液黏度高，剪切力强，成膜性能好，已广泛应用于食品，纺织，造纸，泡沫灭火剂制造，轻化工，石油开采等领域。 在适宜的培养基中，野油菜黄单胞菌利用胞外淀粉酶和蛋白酶，将培养基中的淀粉和蛋白质分解成菌体可吸收的小分子葡萄糖和氨基酸，供菌体生长，同时形成含有葡萄糖，甘露糖，葡萄糖醛酸，乙酸和丙酮酸组分的胞外荚膜多糖。利用荚膜多糖水溶、醇不溶的特性，用乙醇将其抽提，制成黄原胶。

　　标题： 实验原理

　　110张

　　正文： 1. 菌种 野油菜黄单胞菌(Xanthomona campestris) 2.培养基 斜面保藏培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂斜面 种子培养基 发酵产多糖培养基 3.仪器或其他用具 三角烧瓶(250ml)、烧杯(500ml)、培养皿、漏斗、玻璃棒、接种针、不锈钢药勺、尼龙布、天平、无菌吸管或塑料吸嘴、微量取样器、旋转式摇床、烘箱。 4.试剂 95%乙醇

　　标题： 实验器材

　　111张

　　正文： 1. 以无菌操作挑取斜面菌苔一环移接至种子培养基中(250ml三角瓶，装液30ml)，28℃，220r/min旋转摇床振荡培养20h。 2. 以无菌操作吸取1ml种子液移接至发酵培养基中(250ml三角瓶，装液50ml)，接种量为2%，28℃，220r/min旋转摇床振荡培养72h。 3. 发酵培养结束后，将发酵液移入500ml烧杯内，因发酵液粘稠，需用不锈钢药勺，仔细刮取(可加入少量95%乙醇于发酵三角烧瓶，将残留的多糖洗入烧杯内)，在烧杯内加入2倍体积95%乙醇，用玻璃棒搅动，多糖析出。经带有尼龙布的漏斗过滤后弃去乙醇。挤压尼龙布除去残留乙醇。再用95%乙醇洗涤多糖两次。

　　标题： 实验方法

　　112张

　　4. 将洗涤后的多糖置于培养皿中(不加盖)，于60℃ 烘箱内烘干，称重，计算多糖得率。

　　(Gp:) 多糖得率(%)= ×100

　　(Gp:) 多糖重量(g)

　　(Gp:) 发酵液体积(ml)

　　113张

　　正文： 1. 简述你所做实验的流程，并计算多糖得率。 2. 查阅文献概述其他产多糖微生物的类别及其多糖的化 学组成。 3. 查阅相关文献，以论文形式报告本次实验结果。 ? ?

　　标题： 实验报告

　　114张

　　正文： 在提取多糖的过程，小心仔细操作，尽量减少在流程中每一步的损耗量。

　　标题： 注意事项

　　115张

　　正文： 1. 通过本实验你对微生物在国民经济中的作用有何体会? 2. 与同学相比，你所获得的多糖得率有何差别?试分析原因何在? 3. 查阅文献，写出一篇黄原胶在工业上应用的综述文章。

　　标题： 思考题