第十三章 核素示踪在物质代谢研究中的应用.ppt

　　第十三章 核素示踪在物质代谢研究中的应用

　　了解示踪剂在体内经历的过程，解释机体内发生的生理、生化代谢规律。

　　第一节、物质吸收的示踪研究

　　目的：了解物质吸收量(或吸收率)、吸收时的化学形态和吸收时的解剖部位。

　　一、物质吸收百分率的示踪研究

　　整体示踪技术，常用于胃肠道功能的研究 1.整体计数法测定吸收率 2.测定未被吸收残留量 3.尿排出量的测定 4.测定血浆中示踪剂含量

　　1.整体计数法测定吸收率

　　适用于在体内更新速率慢的物质的研究 用发射?射线的核素标记物作为示踪剂，经口服或灌胃引入体内----待粪便中基本无放射性时----用?计数器或全身测量装置测定机体内的放射性含量------除于投入的总放射性=吸收率 小动物------普通的?计数器或灰化标本测量 大动物、人-----全身测量装置(限制)

　　2.测定未被吸收残留量

　　一次口服或灌胃定量的示踪剂-----在一定时间内收集动物的粪便------测定粪便的残留放射性-----计算吸收率。 吸收百分率 =(摄入总量-残留量)/摄入总X100% 适用于吸收后再从消化道排出量极少的示踪剂。

　　3.尿排出量的测定

　　示踪剂吸收后由尿排出-----收集一定时间内的尿液------测定放射性的总量-----反映吸收率。 此法受示踪剂在体内的代谢、积聚及肾功能的影响

　　4.测定血浆中示踪剂含量

　　示踪剂---胃肠道---吸收----血液中---测定血中的放射性-------可以直接反映吸收的量。 口服------血中放射性量=吸收量-清除量 静脉注射------血中放射性量最大---逐步下降(与清除速率有关)

　　以血中示踪剂浓度----时间作图 得到浓度时相曲线下面积(Area Under Curve,AUC)

　　图13-1 血浆示踪剂放射性浓度-时相曲线和曲线下面积(AUC) [a:口服与静脉注射相比较(绝对生物利用度) b:两种口服方案或剂型相比较(相对生物利用度)]

　　当血浆清除速率常数和分布容积相同时，口服AUC等于或小于静脉注射的AUC。 绝对生物利用度(Absolute Bioavailability) =口服AUC/静注AUC (吸收率的估计值) 相对生物利用度(Relative Bioavailability) =口服AUC1/口服AUC2 *双标记同一示踪物质------以不同途径或不同的口服方案引入同一体内------双标记测定-------得到两条曲线并计算两个AUC-----可以校正误差。

　　二、物质吸收部位的研究

　　不同物质在消化道中的吸收部位有可能不同------用放射性示踪剂----区分内外源性物质。 另外，也可以研究示踪剂在皮肤等的吸收。

　　分类

　　1.离体肠段实验：反转肠段---肠袋---放置 于示踪剂中----一定时间---测定袋中的示踪剂的放射性量。 用途：无逆浓度梯度吸收，吸收方向及影响吸收的代谢阻断剂及类似物的研究。

　　2. 观察不同肠段腔内示踪剂含量的变化 观察收集测定不同肠段的内容物----确定不同肠段的吸收率。

　　3.口服示踪剂后观察消化道壁内示踪剂含量变化 常用于研究吸收后在肠壁内停留时间较长的物质的吸收效率。

　　4.测量消化道不同部位血液中示踪剂的含量 方法一.手术将要研究的消化道与其它消化道分离，保留血供，将示踪剂引入-----测血浓度或AUC。 方法二.手术切除欲研究的部位，引入示踪剂----观察切除前后的血液中示踪剂的变化AUC-------反映研究部位的吸收效率。

　　三、物质吸收时化学形式的研究

　　物质尤其是食物在消化道中要经过复杂的化学过程才能被吸收-------核素示踪技术可以帮助我们了解这种过程. 单标记示踪研究 双标记示踪研究

　　单标记示踪研究

　　待研究物质的不同部位标记上核素------制备成不同的标记物A、B、C 等，口服后测定血液中或淋巴液中的放射性-----追踪不同标记物的去向----确定带测物的吸收形式。

　　双标记示踪实验

　　在待研究的物质不同部位标记不同的放射性核素-----并追踪标记原子的去向------确定示踪剂的吸收形式，不同基团的吸收速率。

　　第二节、物质分布与转运的研究

　　生物体内的物质处于不断更新与动态平衡之中，各种物质在机体内都有各自的分布与转运规律。打破了这种分布规律，就会出现病理改变。因此，讨论物质的体内分布与转运规律，不仅有利于了解生理活动，同时对探讨某些疾病的发病机制也有重要的意义。 物质的转运---某物质是否能在器官中浓集，并保留一定时间 -----发挥作用----放射性核素示踪技术则是研究物质分布与转运的理想方法。

　　一、研究方法

　　物质分布与转运的研究方法相似，而物质转运的实验设计更强调动态观察： 三个步骤：示踪剂的引入;实验观察与实验结果的处理。 ---应该区分示踪物和带标记的产物 根据研究目的不同，物质分布与转运研究划分为4个水平：宏观水平(器官水平)，细胞水平，亚细胞水平和分子水平。

　　二、物质分布实验?

　　1.物质分布研究 --精确地确定标记物的分布 (1)示踪剂的引入--根据研究水平的不同，示踪剂的引入的方法也不同 (2)示踪剂 --①使用的标记化合物不一定要求严格的定位标记，因为此项研究目的在于观察物质的分布而不是物质的转化。要求示踪核素原子应标记牢固，不脱落或交换。②标记物的放射化学纯度要高，否则会产生错误的研究结果，尤其在中药研究用同位素交换法制备标记物时，更应注意。③示踪剂比活度依据研究水平而定，器官水平研究需要放射性比活度较低的示踪剂;亚细胞水平和分子水平的研究需用高比活度的示踪剂。

　　标本的处理。实验中要根据研究目的和测量方法进行样品的处理和标本制备。但应指出的是：用层析或电泳等方法分离示踪剂与代谢产物时，往往会导致示踪剂或代谢产物的丢失。因此，实验中需作丢失校正，常称为回收率校正。 对比研究中，若各组织的回收率基本相同，可不作回收率校正。

　　(4)数据处理。分布实验中数据处理的关键在于合理地选择参数。 示踪剂的量以Bq为单位，若样品的测量效率相同时，也可以用cpm为单位。无论是哪一级水平的分布研究，都将测得的dpm换算成放射性含量，如Bq/g组织，或 Bq/ml液体;Bq/106个细胞;Bq/mg蛋白质或DNA;Bq/mg核酸。 保证不同的组织标本间的可比性。

　　物质分布实验的应用

　　物质分布示踪研究广泛地应用于药理学和毒理学研究中 标记抗体，标记的互补RNA(DNA)及标记的受体配基。随之发展起来的放射免疫显像，DNA原位分子杂交，受体配基分析等技术，已成为肿瘤、遗传性疾病和内分泌系统疾病的诊断和病因研究中的不可缺少的研究手段。

　　三、物质在血浆与组织间的转运

　　物质转运的研究包括血液和组织间的转运---细胞内外的转运---亚细胞结构与细胞浆间的转运。 放射性核素示踪技术能够在转运双方原有物质浓度不变的情况下进行研究 1.动态平衡的证实 2.组织中物质来源的判断---这类实验称为同位素平衡实验(Isotope Balance Experiment)。利用这种实验证明了动脉壁中胆固醇来源于血液中的胆固醇。两者并处于不断地交换之中。 3.血浆运载蛋白的研究

　　四、生物膜两侧的物质转运

　　生物膜包括细胞膜和亚细胞颗粒成分与胞浆间的界面结构----生物膜两侧物质的转移不同于一般的半透明膜，除单纯扩散外，还有主动转移(即在“泵”的作用下，物质能逆梯度转移)和易化转运(即在膜结构中某些蛋白质的帮助下，扩散速度超过一般的物理扩散)

　　1.单纯扩散研究---将标记物加在生物膜的一侧，观察另一侧的放射性以判断物质扩散的速度 ---脂溶性物质的单扩散速度与其油水分布系数(脂溶性的强弱)和分子量的大小有关 . 2.主动转运和易化扩散的研究

　　五、亚细胞水平的物质转运

　　常用的实验方法如下 : 1.电镜自显影动态观察 ? 2.分离亚细胞组分作放射性动态观察 ? 3.制备亚细胞结构间物质转运的模型

　　第三节 物质转化的示踪研究

　　研究物质转化的目的主要是揭示机体内重要生命物质的前身物、中间物和代谢产物的关系，以及完成这种物质转化的必要条件等。由放射性核素示踪技术本身的特点所决定，它已是完成这类实验研究的关键手段。

　　掺入实验(Incorporation Experiment)

　　可研究生物体系中化合物A和B的前身物与产物的关系。用放射性核素(或稳定核素)标记在化合物A的适当部位上，引入生物体系内，经过一定的时间，分离出化合物凡若在化合物B中出现较多的标记核素，这表明化合物A的标记原子或标记基团或整个标记分子已参入到化合物B中，即化合物A是化合物B的前身物

　　掺入实验的类型

　　整体(In Vivo) -----整体参入实验多采用动物实验，选用合适的标记物也可以进行人体实验。整体实验有利于观察某一物质在体内转化的全部情况。但由于体内代谢过程复杂;一般用实验不容易了解代谢转变过程的细节 . 离体(In Vitro) -----研究物质转化过程时，实验条件易控制，有利放在分子水平上阐明转化过程的具体步骤、转化条件及影响因素 ----，离体实验破坏了代谢系统的完整性(包括特定的亚细胞结构膜及有关的调节、催化、血管系统)，其结果与整体实验不能完全一致，必须用整体实验进行验证，方可作出可靠的结论。

　　3.掺参入实验的步骤

　　根据待测物的结构特点，选择适当的前身物，在一定的部位进行标记。按照预实验选定的最佳条件进行实验，最后分离的产物也应达到要求的放化纯度。这样获得的结果才可靠。 要求示踪剂具有高比活度和高放化纯度。

　　4.主要参数

　　参入百分率(Incoporation Percentage)，它表示相对的参入量，所以也称为相对参入量 .

　　相对比活度表示的是：标记前身物转化为标记产物的速率。或者是标记前身物的利用率，即所谓的参入率(Incorporation Rate)。参入率的高低又和多种因素有关，如实验对象、标记物加入时间、中间物和产物代谢库的大小、转换速率等 在离体实验中常使用过量标记前身物，整个实验过程中标记物的比活度基本上不会变化，可以直接用产物的活度来代表相对比活度。

　　如用淋巴细胞转化实验检查机体的免疫功能; 如用3H-TdR参入DNA作为细胞增殖指标，以反映处于周期的细胞数量和细胞的增殖能力。 生物医学常将这一指标用于研究肿瘤细胞增殖活动;

　　二、双标记参入实验

　　这类参入实验的一个典型例子是常见的体内转甲基过程。 在物质转化研究中，双标记参入实验当作追踪研究的手段用于阐明前身物的一个，或两个以上的基因，或同一基团的不同原子是否能直接转移到产物上，还是需要经过中间变化(部分脱落、分解后再合成)最后形成产物。

　　常采用两种核素分别标记前身物分子的不同部位，实验前要测定示踪剂中两种核素的放射性比活度(稳定核素，以原子百分超为单位;放射性核素以cpm为单位)，计算两者之间比值，分析实验结果时将其与产物中两者之比值相比较，若产物中两核素比值保持不变，即上述两个标记部位的原子直接转化到产物中。

　　已知蛋氨酸是甲基的直接供给体，核酸、肾上腺素和胆碱合成时需要的甲基都是由蛋氨酸供给的 ------用不同的核素如14C和2H，分别标记蛋氨酸的甲基，并按一定比例混合于饲料中，喂养大鼠。然后分离大鼠肌肉组织中的肌酸和胆碱，分别测定甲基上的14C和2H，计算2H/14C的比值。发现甲基上的2H/14C的比值几乎没有变化，表明体内的甲基作为一个整体基团参加代谢过程。 如在嘌呤合成代谢中，甘氨酸分子作为一个整体直接加入到嘌呤的骨架中，也是由14C和15N双标记的甘氨酸进行的参入实验证实的。

　　分析产物中两种核素的比值，与前身物相比较，变化较大时，便说明前身物分子的特定基团不是整体地参入到产物中。如用C-3标记14C和N-甲基基团标记3H的Nα-甲基色氨酸作前身物，进行实验，测定产物，发现产物中3H/14C的比值明显下降，表明前身物的N-甲基不是作为完整基因直接参入到产物中。

　　三、产物标记部位分析

　　探讨前身物与产物间的关系更有意义，能够寻找出前身物与产物分子间特定部位规律性的联系。 乙酸是胆固醇的直接前身物就是利用此方法证明的。利用双标记的乙酸和大鼠肝组织切片一起温育，然后分离出产物胆固醇，经化学降解后分析胆固醇每个碳原子中同位素的浓度与性质，结果发现胆固醇的碳原子都来源于乙酸的甲基或羧基。 应指出：分析标记原子在产物分子中的分布，通常采用化学降解方法，为了使实验结果准确可靠，保持降解过程中放射性的平衡是非常重要的，即反应过程中所形成的碎片的放射性比活度之总和，应与前身物的比活度相近似(以每克分子计算放射性比活度)。 质谱仪(MS)和核磁共振仪(NMR)已成为测定标记化合物中标记原子的有力工具。

　　四、放射性核素标记技术用于蛋白质翻译后修饰的研究

　　体外培养细胞时，如果将放射性同位素标记到氨基酸或氨基酸前体并加入到培养基中，放射性同位素就将参入到新合成的蛋白质分子中。 如果用对特定修饰基团特异的放射性前体，就可以检测各种蛋白质的翻译后的修饰。一般常见的蛋白质翻译后修饰有磷酸化、O-糖基化、N-糖基化、十四烷基化、十六烷基化。蛋白质翻译后修饰在细胞的生长、增殖和分化的调控中发挥重要的作用。

　　最值得注意的是蛋白质的磷酸化测定

　　1.将1-10mCi 32P -正磷酸加入到无磷酸的培养体系中，与细胞培养2h到平衡; 2.测定胞内32P-ATP或胞外32P-正磷酸的比活性(表示平衡); 3.提取蛋白并用双向凝胶电泳或免疫沉淀后单向凝胶电泳分开目的蛋白; 4.测定蛋白质的浓度及其放射性并计算蛋白质磷酸化的数量。 蛋白的电泳谱带可以用放射自显影来进行定位和定量。也可以用高效液相色谱来完成相关工作。

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　　四、稀释实验

　　此类实验常用来分析物质转化的中间过程。如设想生物体系中有4个化合物，其代谢顺序A→B→C→D。加标记的前身物A，通过B，C可形成产物D，与之同时加入非标记的B，C时，产物D的比活度便降低。是由于非标记B，C稀释了由标记A形成的标记B和C，导致标记产物D的比活度降低的缘故。 若把稀释实验和中间物参入实验结合起来，则有助于阐明中间代谢产物出现的顺序。如已知的非标记B和C对标记物A形成的产物D有稀释作用，制备标记B和C进一步作实验，在研究系统中B出现在C之前，C是B的产物。那么，非标记C对标记的B和C形成的产物D有稀释作用;非标记B只对标记B参入D有稀释作用。

　　已证明乙酸和乙酸乙酸都是胆固醇的前身物，后者也能形成乙酸。为阐明乙酰乙酸在形成胆固醇之前是否先形成乙酸，便用14C-乙酰乙酸与肝组织一起温育，并加入非标记乙酸，结果形成的胆固醇的放射性比活度不因加入非标记乙酸而降低，即证明乙酰乙酸毋须先转换成乙酸再形成胆固醇。

　　五、比活度时相变化的分析研究

　　根据前身物、中间物和代谢产物比活度的变化来研究物质的转化。 因标记前身物引入机体后逐渐变为中间物，后者可转变为代谢产物，随着物质的转化，前身物的比活度逐渐降低，与之同时，中间物的比活度却逐渐增高。因中间物又不断地转化为代谢产物，其放射性达到一定的峰值后也逐渐下降，而代谢产物的放射性也有相似的变化，但只是出现的时间更晚些

　　用14C-甲酸参入肝脏中的嘌呤类化合物进行实验。在给予标记物后的一定时间内分离嘌呤类化合物如次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷酸。测定分析相应的放射性，结果发现：次黄嘌呤核苷酸的放射性比活度最高，次黄嘌呤核着次之，次黄嘌呤的放射性比活度最低。由此得知嘌呤类化合物在代谢过程中转化顺序为：次黄嘌呤核苷酸→次黄嘌呤核苷→次黄嘌呤。