完善血友病的基因诊断体系.ppt

　　1张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 1

　　完善血友病的基因诊断体系

　　xx医院临床输血科

　　xxx

　　2张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 2

　　FVIII (Xq28)

　　FIX (Xq27)

　　q

　　p

　　染色体 X

　　血友病A、B

　　3张

　　标题： 血友病

　　其他占位符： 替代治疗 疾病传播，费用昂贵 基因治疗没有突破 携带者及产前检查杜绝患儿出生、根治疾病

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 3

　　4张

　　标题： 血友病A为例说明基因诊断的临床应用

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 4

　　5张

　　标题： 血友病携带者和产前诊断流程

　　其他占位符：

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 5

　　PCR扩增

　　外周血DNA抽提(携带者)

　　直接核酸测序

　　间接联锁分析

　　明确诊断

　　长链PCR检测内含子1,22倒位

　　血友病A ①、 ② 、③

　　羊水DNA抽提(胎儿)

　　①

　　③

　　②

　　6张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 6

　　FVIII (Xq28)

　　FIX (Xq27)

　　q

　　p

　　X染色体

　　血友病A、B

　　7张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 7

　　内含子22倒位

　　8张

　　标题： 结果(1)

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 8

　　内含子22 倒位检测结果

　　9张

　　标题： 内含子1倒位机制

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 9

　　10张

　　标题： 内含子1倒位检测方法

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 10

　　(Gp:) 2Kb

　　(Gp:) 1.5Kb

　　(Gp:) 2Kb

　　(Gp:) 1.5Kb

　　11张

　　标题： 间接基因诊断

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 11

　　血友病A

　　12张

　　其他占位符： 第一代标志 (参照国外) F8基因内的BclⅠRFLP F8基因内两个STR位点 F8基因外的St14 VNTR

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 12

　　13张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 13

　　家系15 Bcl I RFLP位点多态性连锁分析

　　14张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 14

　　家系13 st14位点VNTR多态的基因连锁分析

　　15张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 15

　　内含子13中STR多态位点用于家系12基因连锁分析

　　147/

　　147/147

　　145/147

　　149/

　　147/149

　　147/149

　　145/147

　　147/

　　16张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 16

　　国外：4个位点 2个STR (CA13、CA22)，2个SNPs (BcI I、Hind Ⅲ) 诊断率约为80%(Hemophilia. Chapman & Hall, London , 63-74) 中国人：用上述4个位点 信息量仅为27%(Clin Chem Lab Med 2001;39(12):1204-1208 )

　　间接诊断——血友病A新位点的探索

　　17张

　　标题： 第二代标志(自主开发)

　　其他占位符： 6个与F8 紧密连锁的STR位点： DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073和DXS1108 距F8 1.5Mb内 1个F8 内的STR位点(F8Civs13) 性别位点为牙釉蛋白基因(Amelogenin gene) 终产物 X染色体102bp，Y染色体 108bp

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 17

　　18张

　　标题： 遗传连锁分析的多态性位点的相对位置

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 18

　　(Gp:) F8

　　(Gp:) F8Civs13

　　(Gp:) DXS1073

　　(Gp:) G6PD

　　(Gp:) DXS9901

　　(Gp:) DXS15

　　(Gp:) DXS1108

　　(Gp:) ST14

　　(Gp:) CA22

　　19张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 19

　　所用STR位点在正常人群中检测的结果

　　(Gp:) STR位点

　　(Gp:) 片段长度 (bp)

　　(Gp:) 不同等位基因的数目

　　(Gp:) 等位基因频率(%)

　　(Gp:) 期望杂合度(%)

　　(Gp:) 观察杂合度(%)

　　(Gp:) DXS 15

　　(Gp:) 145~ 164

　　(Gp:) 10

　　(Gp:) 0.59~37.87

　　(Gp:) 74.97

　　(Gp:) 88.24 (45/51)

　　(Gp:) DXS 9901

　　(Gp:) 186~ 214

　　(Gp:) 12

　　(Gp:) 0.59~37.87

　　(Gp:) 79.77

　　(Gp:) 82.35 (42/51)

　　(Gp:) G6PD

　　(Gp:) 168~ 188

　　(Gp:) 6

　　(Gp:) 0.59~52.07

　　(Gp:) 56.06

　　(Gp:) 21.57 (11/51)

　　(Gp:) DXS 1073

　　(Gp:) 120~ 138

　　(Gp:) 9

　　(Gp:) 0.59~49.11

　　(Gp:) 59.92

　　(Gp:) 62.75 (32/51)

　　(Gp:) DXS 1108

　　(Gp:) 76~96

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 0.59~73.37

　　(Gp:) 39.97

　　(Gp:) 35.29 (18/51)

　　(Gp:) F8Civs13

　　(Gp:) 152~ 168

　　(Gp:) 6

　　(Gp:) 0.59~69.82

　　(Gp:) 47.61

　　(Gp:) 52.94 (27/51)

　　20张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 20

　　21张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 21

　　22张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 22

　　第三代标志(自主开发)

　　对象：69名正常女性、31个HA家系(120名成员) 方法：人类基因组数据库中选择了位于F8基因两端0.5CM内的3个STR位点(5_226、5_147及3_486)，F8基因内的1个STR位点(INTRON25)及距离F8基因2CM内的DXS8069位点，以多重荧光PCR法检测5个微卫星位点的多态性

　　23张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 23

　　F8

　　CA22

　　DXS1073

　　G6PD

　　DXS9901

　　DXS15

　　DXS1108

　　ST14

　　F8Civs13

　　F8

　　Intron25

　　DXS1073

　　5-226

　　F8Civs13

　　3-486

　　5-147

　　DXS8069

　　24张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 24

　　联合5个STR位点可对所有要求做携带者及产前诊断的血友病A家系提供遗传连锁分析结果且与F8基因直接检测结果相符

　　结果与讨论

　　25张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 25

　　7重荧光PCR技术 降低重组发生率 未见漏诊和误诊 诊断率和准确率100%

　　(Gp:) F8

　　(Gp:) Intron25

　　(Gp:) DXS1073

　　(Gp:) 5-226

　　(Gp:) F8Civs13

　　(Gp:) 3-486

　　(Gp:) 5-147

　　(Gp:) DXS8069

　　26张

　　副标题： 特殊血友病A家系的基因诊断

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 26

　　27张

　　正文： 先证者自幼皮肤、头颅撞伤后及拔牙及手术后有出血难止，曾发生过颅内出血 BT、PT正常 APTT延长，FVIII:C 2% 输注全血或抗血友病球蛋白治疗有效 先证者已故

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 27

　　家系1

　　28张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 28

　　家系2

　　FⅧ:C 2%

　　29张

　　标题： 直接基因测序

　　其他占位符： 结果： 携带者外周血DNA直接测序未检测出突变 原因： 据文献报道FVIII直接基因测序有1%-10%的患者查不到基因突变 ( Hum Mutat. 2002 Oct;20(4):267-74) 存在大的缺失? 内含子突变?

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 29

　　30张

　　标题： 携带者诊断结果

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 30

　　携带者及待检者F8内含子22,1倒位均为阴性

　　(Gp:) 2Kb

　　(Gp:) 1.5Kb

　　(Gp:) 2Kb

　　(Gp:) 1.5Kb

　　31张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 31

　　32张

　　标题： 间接诊断结果BclI酶切图

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 32

　　III-1表姐： -/- II-2舅妈： -/- II-3母亲： +/- II-4父亲： +/+ III-2待检者：+/+

　　M

　　33张

　　标题： BclI酶切图测序图

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 33

　　BclI酶切识别位点 T/GATCA 图a 待检者测序图， 含BclI酶切位点 图b 表姐测序图，不 含BclI酶切位点

　　a

　　b

　　34张

　　标题： 间接诊断结果ca13 基因扫描

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 34

　　III-1 表姐：144/144 III-2待检者：142/142 II-3母亲：142/144 II-2舅妈：140/144 II-4父亲：142/-

　　35张

　　标题： 间接诊断结果ca22基因扫描

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 35

　　III-1 表姐：79/79 III-2待检者：79/83 II-3母亲：83/79 II-2舅妈：79/79 II-4父亲：79/-

　　36张

　　标题： 血友病A携带者间接诊断结果分析

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 36

　　表姐

　　舅妈

　　父亲

　　母亲

　　待检者

　　综合A13、CA22及Bcl I 信息，待检者与其表姐有不同的X染色体

　　舅舅

　　37张

　　标题： 女性血友病A的基因及产前诊断

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 37

　　38张

　　标题： 标本来源

　　其他占位符： 先证者(II-1)，女，21岁，汉族，自幼有踝关节及膝关节有自发出血，临床诊断为血友病A，冷沉淀及浓缩FVIII输注有效，因怀孕要求作基因诊断及产前诊断

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 38

　　?

　　?

　　39张

　　标题： 基因检测结果

　　其他占位符： F8内含子22倒位 F8内含子1倒位 先证者 阳性(携带者) 阴性 胎儿 阴性 阴性 其他人 阴性 阴性 先证者F8基因所有外显子及其侧翼序列扩增测序 (-)

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 39

　　40张

　　标题： 遗传连锁分析

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 40

　　(Gp:) 319 218 150 282 340 172 374

　　(Gp:) 323 212 150 282 346 172 365

　　(Gp:) 319 218 150 282 340 172 374

　　(Gp:) 325 220 150 280 340 172 374

　　(Gp:) 325 220 150 280 340 172 374

　　(Gp:) 319 218 150 282 340 172 374

　　(Gp:) 325 220 150 280 340 172 374

　　(Gp:) 323 212 150 282 346 172 365

　　(Gp:) 325 220 150 280 340 172 374

　　(Gp:) HA患者

　　(Gp:) 正常男性

　　(Gp:) 胎儿

　　(Gp:) 正常女性

　　(Gp:) 先证者

　　(Gp:) 图2 家系多态性位点遗传连锁分析图

　　(Gp:) I

　　(Gp:) II

　　(Gp:) III

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 325 212 130 280 340 172 374

　　(Gp:) 325 212 130 280 340 172 374

　　41张

　　标题： 发病机制

　　正文： 先证者来自母系的X染色体大部分被灭活，而来自父系的X染色体保留活性 家系其他成员及胎儿为X染色体随机灭活

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 41

　　42张

　　标题： 发病机制

　　其他占位符： 先证者一条X染色体发生了F8基因内含子22倒位，而未检测到其它F8基因相关突变 遗传连锁分析发现该女性患者的两条X染色体分别遗传自其父母，排除其为单亲二倍体 先证者的X染色体灭活呈非随机性灭活，其遗传自父亲的X染色体大部分保留了活性

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 42

　　43张

　　标题： 女性血友病 A(2)

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 43

　　女性血友病： (FVIII:C 3.4%,FVIII:Ag 4.2% Leu1975Pro 和 3637-3638insA

　　父亲： (FVIII:C 6.9%, FVIII:Ag 7.4%), Leu1975Pro mutation

　　J Thrombosis and haemostasis 2006

　　44张

　　标题： 3637-3638insA突变是如何产生的?

　　其他占位符： 母亲外周血DNA的 F8 没有检测到基因突变 母亲不同组织DNA F8基因检测也没有检测到突变，不是体细胞的嵌和体 患者3637-3638insA自发突变( de novo)

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 44

　　45张

　　标题： 框移突变(3637-3638insA)

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 45

　　定量 RT-PCR显示： 患者的FVIII mRNA减少

　　结论： 女性血友病A患者是其F8基因中来自父亲的Leu1975Pro突变和自发突变 3637-3638insA，双重杂合突变导致的

　　46张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 46

　　一个血友病家系，父亲为血友病A，儿子为血友病B

　　同时存在HA和HB患者家系的基因诊断

　　HA

　　HB

　　47张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 47

　　FVIII (Xq28)

　　FIX (Xq27)

　　q

　　p

　　染色体 X

　　血友病A、B

　　+

　　48张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 48

　　Result of phynotype detection

　　49张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 49

　　基因诊断结果

　　F8INV 22： 父亲 (+)其他成员(-) F8INV 1 ： 所有成员(-) F9测序:儿子 mutation(32772A→T，Ser365Cys), 母亲 同位置杂合子 阿姨、外公(-) 父亲 (-)

　　50张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 50

　　Result of linkage analysis

　　(Gp:) 399 340 208 166 313 365

　　(Gp:) 399 340 208 166 313 365

　　(Gp:) 399 340 208 166 313 365

　　(Gp:) 399 340 208 166 313 365

　　(Gp:) 389 336 210 164 313 358

　　(Gp:) 395 350 212 180 313 358

　　(Gp:) 395 350 212 180 313 358

　　(Gp:) 395 350 212 180 313 358

　　(Gp:) Ⅰ

　　(Gp:) Ⅱ

　　(Gp:) Ⅲ

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 6

　　(Gp:) 7

　　(Gp:) 8

　　(Gp:) 9

　　(Gp:) 10

　　(Gp:) 7

　　?

　　?

　　+：FIX基因缺陷

　　+

　　+

　　_

　　_

　　51张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 51

　　外周血细胞、组织细胞 外公 体细胞、生殖细胞嵌合体

　　外公

　　阿姨

　　Peripheral blood

　　buccal cavity cells

　　Enqomphesis rate :14.1%

　　嵌合体检测

　　52张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 52

　　凝血因子V和VIII联合缺陷;常染色体隐性遗传性疾病;发病率为1/100万，男女均可发病 致病基因并非F5，F8基因，而是与蛋白转运相关受体的编码基因突变导致：LMAN1(70%)，MCFD2(30%) 分子发病机制研究

　　F5F8D家系基因诊断

　　53张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 53

　　54张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 54

　　F5F8D家系基因诊断(1)

　　先证者1：10岁女孩，口腔粘膜反复出血 患者母亲怀孕要求做产前诊断

　　55张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 55

　　F5F8D家系基因诊断(2)

　　先证者2：50岁女性，贫血，凝血功能不佳， 长期痔疮出血 先证者3：47岁女性，凝血功能不佳

　　56张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 56

　　F5F8D家系基因诊断(4)

　　先证者4：50岁男性，平时无明显的凝血功能异常现象，因痔疮出血难止于术前进行凝血功能筛查

　　57张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 57

　　F5F8D家系实验室检测结果

　　58张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 58

　　F5F8D家系基因检测结果

　　先证者1： LMAN1：Exon8 nt925-933insA 305frameshift 编码20个氨基酸后终止 LMAN1：Exon11 nt1387C>CT(X71661.1) 456Arg>Stop

　　母亲

　　父亲

　　产前诊断：胎儿为女性，且携带了来自父亲的突变

　　59张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 59

　　先证者2、3： MCFD2：Exon4 nt501T>C，导致第136位氨基酸错义突变，136 Ile>Thr

　　F5F8D家系基因检测结果

　　60张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 60

　　F5F8D家系基因检测结果

　　先证者4：LMAN1：Exon5 nt636C>T ，导致202R>Stop

　　先证者4之子(杂合子)：LMAN1：Exon5 nt636C>CT

　　61张

　　副标题： 间接诊断中的基因重组

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 61

　　62张

　　标题： HA家系情况

　　其他占位符： 先证者II-3为重型血友病A患者，F8C<1.0% II-5要求作携带者诊断

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 62

　　?

　　63张

　　标题： HA家系遗传连锁分析的结果

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 63

　　5

　　A 154 203 203 124 156 80 86

　　C 154 203 203 124 156 84 96

　　B 154 195 195 128 156 80 86

　　Ⅰ

　　Ⅱ

　　1

　　2

　　3

　　B 154 195 195 128 156 80 86

　　C 154 203 203

　　128 156 80 86

　　A 154 203 203 124 156 80 86

　　?

　　(Gp:) F8

　　(Gp:) F8

　　(Gp:) F8

　　(Gp:) F8

　　64张

　　标题： HA家系检测结果

　　其他占位符： 22倒位：均为阴性 1倒位：先证者(II-3)为阳性，女性(II-5)为携带者

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 64

　　(Gp:) 2Kb

　　(Gp:) 1.5Kb

　　(Gp:) 2Kb

　　(Gp:) 1.5Kb

　　65张

　　标题： HA家系诊断结果

　　其他占位符： 内含子1倒位是该家系HA发生的致病机制，II-5为内含子1倒位携带者 遗传连锁分析发现II-5在ST14，DXS15，DXS9901，G6PD与DXS1073，F8Civs13，CA22，DXS1108间发生染色体的同源重组

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 65

　　66张

　　标题： 结 论

　　其他占位符： 在应用间接诊断进行HA家系携带者及产前诊断时，不能仅使用单一的位点进行诊断，必须联合应用多个与F8相关的位点来进行遗传连锁分析，尤其是F8基因内的多态性位点

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 66

　　67张

　　标题： 2009血友病基因诊断

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 67

　　(Gp:) 瑞杰

　　68张

　　其他占位符： 1

　　其他占位符： 68

　　Thank you