研究细菌接合方法的基本原理.ppt

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　　标题： (二)接合(conjugation)

　　正文： 定义：供体菌(“雄”)通过其性菌毛与受体菌(“雌”)相接触，前者传递不同长度的DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。 通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子(conjugant) 研究方法：1946年J.Lederberg等采用E.coli的两株营养缺陷型进行实验，奠定了方法学基础;也为以后的微生物遗传学提供了必要的条件。 存在范围： 细菌：G – 较为多见如E. coli、Salmonella、Shigella、Serratia、Vibrio 、Azotobacter 、Klebsiella和Pseudomonas等最为常见 放线菌：Streptomyces 、Nocardia 接合还可发生在不同属的菌种之间，如E. coli与Salmonella typhimurium之间或S. typhimurium与Shigella dysenteriae之间 E. coli的F因子：决定性别的质粒，属于附加体(episome)，可以通过接合作用获得，也可以通过丫啶类化合物、溴化乙锭或丝裂霉素C的处理而消除。

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　　接合——两个亲本细胞通过直接接触来转移遗传物质的基因重组方式。通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子(conjugant) 1946年用E.coli的两个营养缺陷型所作的实验：

　　(Gp:) Met+bio+thr+leu+

　　(Gp:) Met-bio-thr+leu+

　　(Gp:) Met+bio+thr-leu-

　　(Gp:) [Met.bio.thr.leu]

　　(Gp:) [-]

　　(Gp:) [-]

　　(Gp:) [-]

　　(Gp:) 混合培养

　　(Gp:) 离心洗涤后

　　标题： 1、接合及其发现

　　A

　　B

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　　标题： 研究细菌接合方法的基本原理

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　　(Gp:) A

　　(Gp:) B

　　(Gp:) [-]

　　(Gp:) [-]

　　(Gp:) 过滤器

　　标题： U型管实验：

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　　接合： 供体与受体细胞直接接触，借性菌毛传递DNA，在受体细胞中发生交换、整合，使之获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就称接合子。

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　　标题： F因子的存在方式

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　　根据F因子在E. coli中的有无，及与染色体的关系，可将E. coli分为四种类型：

　　① F– (“雌性”)菌株： 细胞中不含有F因子， 细胞表面不具有有性纤毛。 可以通过与F+、F’或Hfr菌株接合而接受供体菌的F因子、 F’因子或Hfr菌株的部分或全部遗传信息，相应地可以转变成F+菌株、 F’菌株或重组子。 据估计，从自然界分离到的2000株E. coli中约有30%是F–菌株。

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　　② F+(“雄性”)菌株： 细胞内含有(1~4个)游离的F因子， 细胞表面存在与F因子数目相当的性菌毛。 与F– 相接触时，可通过性菌毛将F因子转移到F– 细胞中，使之也变成F+菌株。 F因子以很高的频率传递，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般并不被转移。

　　(Gp:) F+× F– F++ F–

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　　③Hfr(高频重组，high frequency recombination)菌株： 含有与染色体特定位点整合的F因子。 因该菌株与F– 接合后的重组频率比F+ 菌株高几百倍而得名。 Hfr菌株与F–菌株接合时，Hfr染色体双链中的一条单链在F因子处发生断裂，F因子位于线状单链DNA的两端，整段单链线状染色体从5’端开始等速进入F–细胞，在没有外界干扰的情况下，全部转移过程的完成需要约120分钟。由于种种原因DNA转移过程常会发生中断，所以越是前端的基因进入F– 细胞的机会越大。F因子位于线状DNA的末端，进入受体细胞的机会最小，故这种接合引起转性的频率最低，但可以出现各种重组子。

　　(Gp:) Hfr× F– H fr + F– (在大多数情况下) Hfr× F– H fr + Hfr (在极少数情况下)

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　　④F’菌株： 细胞中含有游离的、带小段染色体基因的环状F因子，可与F– 菌株接合，使其成为F′菌株。 F′菌株的形成：由Hfr菌株中的F因子在不正常切离而脱离核染色体组时所形成，并因此造成细胞染色体发生缺失， F因子也缺失一段DNA. 由Hfr异常释放所生成的F’菌株，称为初生F’菌株; 由F– 接受外来F′因子所产生的F′叫作次生F′细胞; F因子转导F-mediated transduction: 利用F’菌株与F–接合可将供体染色体DNA传入F– 菌株，从而使F– 既获得供体菌的若干遗传特性，又可获得F因子。这种接合方式叫做F因子转导,又称性导sexduction. ——因为F因子可在细菌的染色体多位点整合，所以F因子转导可实现不同基因的转移和重组。

　　F′× F– F′ + F′

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　　标题： F因子转导(F-duction)：

　　正文： 通过F’菌株与与F–菌株间的接合，就可以使后者转变成F’菌株，为次生F’菌株。它是一个部分双倍体，具有一个不完整的F因子，缺少部分基因，仍可进行与F–菌株间的接合。 由F’因子来传递供体基因的方式，称为F因子转导、性导(sexduction)或F因子媒介的转导(F-mediated transduction)。

　　图 ：初生F’菌株和次生F’菌株的由来

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　　标题： 接合的一般过程：

　　正文： 接合时F+细胞与F– 细胞相遇，性菌毛与F– 细胞表面发生吸附而形成接合管; F+细胞内，F因子的一条DNA单链在特定的位点上发生断裂; 断裂后的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板，通过模板的滚动，一方面把解开的单链以5’为先导通过性菌毛推入F– 细胞中，另一方面，在供体细胞内以滚动的环状模板重新合成一条互补的环状单链，以取代传递到F– 细胞中的那条单链。这种DNA复制机制称为滚环模型(rolling circle model); 在F– 细胞中，以外来的供体DNA线状单链为模板合成一条互补单链，并随之恢复成环状双链F因子。 至此，原来的F– 菌株变成了F+ 菌株。原来的供体仍为F+ 菌株。

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　　标题： 接合中断试验与染色体图：

　　正文： Hfr菌株与F– 菌株接合与F+ 菌株相似，区别在于F因子被分隔在核染色体组两端，F因子的头先进入受体细胞，然后是核染色体组，只有核染色体组完全进入受体细胞之后，F因子的尾才能进入受体菌细胞，完成DNA的传递。 Hfr菌株与F– 菌株的接合随时都可能被中断，所以极少出现转性的结果，而是形成各种各样的重组子。 接合中断试验：由Wollman和Jacob首创(1955)，首先认识了原核微生物染色体的环状特性。 原理：接合试验的DNA转移过程存在着严格的顺序性，在接合进行中采用定时人为中断的方法，可以获得呈现不同数量 Hfr 性状的 F– 接合子，据此，可以选定几种有特定整合位点的 Hfr 菌株，使之与F–菌株进行接合，并在不同时间使其中断，最后，根据F–中出现Hfr菌株中各种形状的时间顺序(分钟)，可以绘出较为完整的环状染色体图(chromosome map)。 到1983年E. coli染色体上已定位1027个基因。

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　　标题： 接合中断试验

　　正文： Hfr中F因子的整合、断裂和转移

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