第十五章 遗传性疾病的分子诊断.ppt

　　第十五章 遗传性疾病的分子诊断

　　KEY POINTS

　　1. There are many different techniques that can be used to diagnose the globin gene mutations, including gap-PCR, ARMS-PCR, and RE analysis of amplified product. 2. Hemophilia is a congenital disease of the coagulation disorders which constitute recessive disorders linked to chromosome X. The study was carried out by the SSCP, RFLP, Southern blot, VNTR, and STR. 3. Two multiplex PCRs were constructed in which 9 exons can be amplified simultaneously, and 98% of all deletions could be identified. 4. Phenylketonuria is an inborn error of metabolism resulting from a deficiency of phenylalanine hydroxylase. There are many techniques that can be used to mutation screening, such as PCR-STR, PCR-SSCP, PCR-RFLP, PCR-DGGE, and so on.

　　KEY POINTS

　　5. Cystic fibrosis (CF) is caused by mutations in the CFTR gene. Five tests are most frequently used: restriction enzyme analysis, the heteroduplex assay, ARMS, reverse hybridization and OLA. 6. Huntington’s disease (HD) involves a polymorphic (CAG)repeat sequence located in exon 1 of the IT15 gene at 4p16.3. HD can be accurately confirmed or excluded by PCR-based assay. 7. Fragile X disease result from trinucleotide (CGG) repeat expansions At present, fragile X disease of diagnostic procedures are based on Southern blotting and on PCR amplification. 8. Two major technologies are in use for PND and PGD: PCR for monogenic diseases and FISH for chromosomal aberrations.

　　教学目的与要求

　　了解遗传性疾病分子诊断的方法学评价及产前(包括胚胎植入前)遗传缺陷分子诊断的适应症。 熟悉遗传性疾病的分子机制及分子诊断的标准化。 掌握遗传性疾病及产前(包括胚胎植入前)遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。 重点遗传性疾病及产前(包括胚胎植入前)遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。 难点遗传性疾病的分子机制。

　　本章目录

　　第一节 遗传性疾病分子诊断的策略 第二节 遗传病的分子诊断 第三节 产前(包括胚胎植入前)遗传缺陷的分子诊断

　　第一节 遗传性疾病分子诊断的策略

　　一、直接诊断策略 二、基因多态性连锁分析 三、基因突变的定量(dosage)诊断

　　一、直接诊断策略

　　遗传性疾病分子诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变，如基因的缺失、插入、倍增或者是点突变等遗传缺陷。

　　(一)点突变的诊断

　　对基因背景清楚或部分清楚的点突变，可以采取直接检测基因点突变的方法 ，如： 等位基因特异性寡核苷酸杂交(allele specific oligonucleotide, ASO) PCR-ELISA 等位基因特异性扩增(allele specific amplification, ASA PCR-RFLP 基因芯片技术等进行诊断

　　对于一些基因背景未知的点突变，可以采用 单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism, SSCP) 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 异源双链分析(heteroduplex analysis, HA) DNA序列测定 蛋白截短测试(protein truncation test, PTT)

　　(二)片段性突变的检测

　　片段性突变是指DNA分子中较大范围的碱基发生突变，如碱基的缺失、插入、扩增和重组。 对于少数核苷酸缺失或插入，可以采用检测点突变的方法，而对于大的片段突变，则使用Southern印迹技术和多重PCR技术。

　　二、基因多态性连锁分析

　　目前大多数遗传性疾病的致病基因尚未被定位和阐明，因此无法进行直接诊断，还有一些基因长度数百到数千碱基，突变种类多且分布广泛，这种情况下突变检测便十分复杂和困难，此时要用间接诊断策略进行诊断，即采用多态性连锁分析的方法，寻找具有基因缺陷的染色体、相关基因的等位基因型和单倍体型等，并判定被检者是否有这条存在基因缺陷的染色体、相关基因的等位基因型和单倍体型等。

　　三、基因突变的定量诊断

　　常用基因定量的检测方法大致分三类 细胞分裂中期染色体检测 固相杂交 PCR 扩增 (详见下表)

　　第二节 遗传病的分子诊断

　　一、血红蛋白病 二、血友病 三、肌营养不良症 四、苯丙酮尿症 五、囊性纤维化 六、亨廷顿病 七、脆性X综合征

　　一、血红蛋白病

　　血红蛋白病(hemoglobinopathy,Hb)是由于编码血红蛋白的基因异常而发生的一类遗传性贫血病。 分类： 一类是异常血红蛋白病，其Hb发生了结构上的异常，导致贫血病。例如镰刀状细胞贫血; 另一类是地中海贫血，其构成Hb 的蛋白部分—珠蛋白的合成降低或消失，而其Hb 一般不发生结构上的变化，故亦称珠蛋白合成障碍性贫血。

　　1.镰刀状细胞贫血

　　分子机制 由于β珠蛋白基因中第6 位密码子的序列由原来的GAG 改变成GTG，结果β 珠蛋白肽链的第6 位氨基酸残基由原来的谷氨酸改变成缬氨酸，改变后的血红蛋白称为镰状血红蛋白(HbS) 。

　　分子诊断方法 限制性内切酶法(RE)、ASO、ARMS、跨越断裂点的PCR 技术(也称裂口PCR、gap-PCR)等，最常用的为RE 法。

　　2.地中海贫血

　　地中海贫血(thalassemia)是由于珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病。 按照合成速率降低的珠蛋白类型，可以把地中海贫血分为多种不同的类型：α 珠蛋白合成减缺的称为α地中海贫血，β 链合成减缺的称为β 地中海贫血，γ 链合成减缺的称为γ 地中海贫血，δ 链合成减缺的称为δ 地中海贫血，以此类推。

　　1.α地中海贫血

　　α地中海贫血的分子机制

　　在第16 号染色体上有2 个串联的α珠蛋白基因(α1、α2)，这两个基因(包括内含子和外显子)在核苷酸序列上有很大的同源性，即使其周围的序列也有90%以上的序列是一致的，这是一个不等位交换的理想模式。 因此细胞在减数分裂时，α 珠蛋白基因簇有可能错排，导致不等位交换的发生，从而使一条16 号染色体上只剩下一个α 珠蛋白基因，而在另一条染色体上出现了串联的3 个α 珠蛋白基因，由此分化出的红细胞合成α珠蛋白的能力下降。当仅有的一个α 珠蛋白基因再发生突变的话，就出现了该条染色体上α珠蛋白基因的完全缺失。

　　分子诊断方法 (1) PCR法 PCR 法已经成为鉴别缺失型α 地中海贫血的首选方法。根据诊断目的的不同可以选择不同的PCR引物，选择性扩增不同类型的α 地中海贫血基因。 (2) ARMS法 该法能快速鉴别诊断HbC S和HbQ S，简便可靠，适用于中国人非缺失型α 地中海贫血的基因诊断和产前诊断，方法简便、易于推广。 (3) ASA法 与ARMS 法相类似，通过PCR产物扩增带的有无即可判别突变是否存在，其缺点在于用于HbQ S点突变检测时，HbQ S突变点附近GC含量高，扩增难度较大。 (4) SSCP法 用于简便快速筛查非缺失型α2 地中海贫血突变，是依据单链DNA或RNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中以构象为基础的电泳行为来鉴定DNA序列改变的一项技术。该技术因操作简便和适用而被广泛应用，但是此法影响因素多、重复性差。 (5) 等位基因特异性扩增技术(ASPCR)法 此技术适用于小片段DNA 电泳分析，根据扩增得到的电泳带判断是否存在对应的点突变， 具有微量清晰、准确可靠的优点。

　　2.β地中海贫血

　　分子机制 β珠蛋白基因位于11 号染色体上，β珠蛋白基因发生不等位交换的可能性较小，因此突变成为β地中海贫血的主要发病原因。β-基因的突变以点突变为主，即单核苷酸置换是β-基因的主要突变类型，它亦有碱基的插入和缺失。

　　分子诊断方法 目前常用的检测方法有：PCR反向点杂交(PCR-RDB)法、PCR—RFLP法、基因芯片法等

　　二、血友病

　　人体的凝血过程需要多种凝血因子参加。由于凝血因子基因的缺陷而使其中某一凝血因子蛋白表达降低或缺如即造成血友病(hemophilia)。85% 的血友病患者是由于血浆中缺乏凝血第8 因子(FⅧ)所致，约10%的患者是由于缺乏凝血第9 因子(FⅨ)，前者称为甲型血友病，后者称为乙型血友病 。

　　(一)甲型血友病及其分子诊断

　　甲型血友病是由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)即抗血友病球蛋白(antihemophilic globulin, AHG)缺乏所导致的凝血机制异常的遗传性疾病。

　　2.甲型血友病的分子机制

　　在FⅧ 基因区域内，有一种A基因存在三个拷贝，其功能不详，其中一个A基因位于FⅧ基因的第22 号内含子内(A1)，另外两个位于X染色体的末端(A2、A3)。A1 基因可以与其上游的两个A基因拷贝中的一个发生同源重组，引起FⅧ基因的1-22 外显子片段倒位，这种倒位导致FⅧ 功能完全丧失而发生严重的血友病 。

　　甲型血友病分子诊断

　　(1)基因倒位的检测 由于50%左右的甲型血友病是由于FⅧ 基因中的22 号内含子倒位引起的，所以检测该突变成为对患者进行基因诊断的首选方法。在检测基因倒位的方法中首选的是长距离PCR(LD-PCR)技术。

　　(2)非基因倒位的检测 点突变是非基因倒位引起甲型血友病的主要原因，因此对该类患者的家系分析和携带者的基因检测主要是通过点突变的检测技术进行。

　　1)PCR-RFLP法 2)VNTR法 3)STR法 4)PCR-SSCP法

　　(二)乙型血友病及其分子诊断

　　乙型血友病，又称Christmas 病或血浆凝血活酶成分(plasma thromboplastin component, PTC) 缺乏症，是凝血因子Ⅸ(FⅨ)缺陷所致的一种严重的遗传性出血性疾病。

　　分子机制 为编码FⅨ基因缺陷，导致FⅨ含量缺乏或结构异常，从而凝血功能障碍。临床表现与甲型血友病完全相似。

　　分子诊断 直接测序法、 基因芯片法和毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE); 间接检测方法有：RFLP法、SSCP法、DGGE法、双脱氧指纹图谱(dideoxy fingerprint, ddF)、变性高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)

　　三、肌营养不良症

　　肌营养不良症又称为假性肥大性肌营养不良。主要有杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)和贝氏肌营养不良症(Becker muscular dystrophy, BMD)，它们是一种常见的X连锁性隐性遗传病，因此患者都为男孩。

　　第三节 产前(包括胚胎植入前)遗传缺陷的分子诊断

　　一、染色体异常分子诊断 二、单基因病的产前(植入前)分子诊断

　　发病机制

　　主要为抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin gene)的突变导致肌细胞膜上的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)发生结构和功能的改变所致。 Dystrophin 是抗肌萎缩蛋白基因(DMD基因)的产物，当DMD 基因突变后Dystrophin 合成缺乏，该复合物无法有效形成，使细胞膜不稳定，最终造成肌细胞因通透性增加而变性或坏死，导致DMD 的发生。

　　2.杜氏和贝氏肌营养不良症的分子诊断

　　(1)多重PCR技术 (2)短串联重复序列(short tandem repeat, STR)连锁分析 (3)定量PCR技术 (4)RT-PCR技术

　　四、苯丙酮尿症

　　PKU是由挪威科学家Folling 发现的，当时被命名为“苯丙酮尿性智力发育不全” ，1937 年Penrose 和Quastel 将之命名为苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)。其主要是由于肝内苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)严重缺失所致的苯丙氨酸代谢异常，为常染色体隐性遗传病。

　　(二)苯丙酮酸尿症的分子诊断

　　1.PCR-STR 连锁分析 2.PCR-SSCP法 3.PCR-RFLP 4.多重ASPCR法

　　五、囊性纤维化(cystic fibrosis, CF)

　　CF是由囊性纤维化穿膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)基因突变所致，为白种人中最常见一种家族常染色体隐性遗传性先天性致死性疾病，多累及儿童和青年，发病率以西、北欧及北美人群为高。CF常累及胃肠道和呼吸道，极易发生呼吸道感染而引起气道梗阻及呼吸功能不全，多数病人仅能成活数年到十余年。

　　CF分子机制

　　CFTR基因突变已达1000 余种，已知的CF突变在CFTR基因中的分布是非随机的，绝大多数集中于编码CFTR蛋白NBFs区的外显子9、10、11、12、19、20、21、22 ，跨膜区的外显子3、4、7、14a、14b、17b以及R区的第13 外显子，其中除ΔF508 及另外十余种较为常见的突变外，其余均为罕见突变或仅见于个别病例。

　　CF 分子诊断

　　早期CF的基因诊断基于RFLP连锁分析，采用的探针多为基因克隆过程中获得的基因侧翼DNA片段。在CF基因克隆和测序以后，PCR技术被用于直接基因诊断。同时，新的突变分析方法也相继问世。

　　六、亨廷顿病

　　亨廷顿病(Huntington's disease, HD)是一种有IT 15 基因上CAG 重复序列一场扩展所致常染色体显性遗传的以舞蹈运动为主要特征神经退行性的疾病。

　　HD 分子机制

　　HD即由CAG重复序列的异常扩展突变引起，CAG 重复范围在正常的染色体为9～35个拷贝，而在HD 患者的染色体上，重复长度大于拷贝，CAG 的拷贝数目与HD的发病年龄负相关，其基因突变率在人类单基因遗传性疾病中最低。

　　HD的分子诊断

　　针对不同个体运用三条引物进行PCR 扩增，扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影鉴定IT 15 基因(CAG)n串联重复序列拷贝数，此法能对超过95%HD 患者诊断和排除诊断。

　　七 脆性X综合征

　　脆性X综合征(fragile X syndrome, FraX)是仅次于Down’s 综合征的又一常见遗传性智力缺陷疾病。

　　脆性X综合症 分子机制

　　1.FMR-1 基因5′端(CGG)n 重复序列异常 2.FMR-1 基因5′端CpG岛的异常甲基化 3.FMR-1 基因缺失 4.FMR-1 基因点突变

　　脆性X综合征的分子诊断

　　1.Southern印迹杂交法 2.PCR法 3.微卫星序列分析法

　　第三节 产前(包括胚胎植入前)遗传缺陷的分子诊断

　　产前诊断(prenatal diagnosis, PND)就是在胎儿出生以前，通过对某些特异基因进行分析，以判断胎儿是否有某种遗传性疾病的手段。 植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)主要是指在显微操作下从体外受精(in vitro fertilization, IVF)发育至6～8 个细胞期的胚胎中，活检1～2 个卵裂球细胞或直接获取受精前后的极体，通过PCR或FISH，进行快速遗传学诊断，选择正常胚胎植入宫内，从而获得健康胎儿。

　　一、染色体异常分子诊断

　　1.荧光原位杂交 2.比较基因组杂交 3.间期染色体转化

　　二、单基因病的产前(植入前)分子诊断

　　1.PND和PGD可诊断的单基因病 2.PND 和PGD 诊断单基因病的分子诊断技术 (1)巢式PCR (2)全基因组扩增(WGA) (3)多重PCR (4)荧光PCR (5)突变分析法