第一节 克隆载体.ppt

　　第一节 克隆载体

　　1. 质粒载体(plasimid vectors) 2. 噬菌体载体(phage vectors) 3. 柯斯质粒载体(cosmid vectors) 4. 人工染色体载体(B/Y/HAC)

　　噬菌体简介

　　组成：蛋白质、核酸. 结构：蛋白质外壳、尾巴 尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。

　　是比细菌还小得多的微生物，噬菌体侵犯细菌，可以认为它是细菌里的“寄生虫”。

　　Bacteriophage(phage)

　　噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞; 2.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。

　　大肠杆菌的λ-噬菌体

　　(一) λ-噬菌体的生物学特性

　　1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成

　　2、 λ-DNA的物理图谱

　　(1)功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需基因

　　48.5kb

　　(2)线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链(粘性末端，cohesive-end site)，称λcos site ，粘性末端粘连接变成环状DNA。

　　λcos位点是噬菌体包装必需序列。

　　λ噬菌体基因大致分为3个区：

　　功能区：裂解相关S和R，复制相关O和P

　　非必须区： 非必须，基因重组int(intagrate)及xis(excision)

　　结构区：A～ J19个基因，编码头、 尾部蛋白质

　　3、感染周期(溶菌循环)

　　λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体

　　头部包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，A蛋白切割cos位点。

　　包装

　　E

　　4、溶源状态的建立

　　噬菌体感染大肠杆菌后，DNA直接整合到宿主细胞染色体DNA上，并不裂解细胞，这种情况称为溶源状态。

　　DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。

　　整合主要由cI和int基因的产物所激活，这两个基因的开放 与关闭取决于宿主细胞本身的性质。 cI基因：编码阻遏蛋白，是感染了λ噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失的λ噬菌体无法 使寄主细胞发生溶源化效应。

　　噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNA上，成为原噬菌体。 适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。

　　超感染免疫性

　　λ噬菌体DNA的整合与删除：

　　溶源性细菌，由于含有原噬菌体，故不能再 次被同种噬菌体感染。溶源性细菌所具有的这种 抗御同种噬菌体再感染的特性叫做超感染免疫性。

　　噬菌体的溶源和裂解

　　入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖。 侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。

　　λ-DNA载体的构建

　　λ噬菌体的缺陷： 基因组太大(48.5kb); 酶切点太多，它有5个BamH1位点(G↓GATCC)，6个BgⅠ位点(A↓GATCT)，5个EcoRⅠ位点(G↓AATTC)。 野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于λ噬菌体的75-105%，那么只能接纳48.5kb×5%=2.425kb的DNA。 重组的λDNA分子难于直接导入宿主细胞—利用体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNA。

　　切去部分非必须的区域; 抹去多余的限制性内切酶切割位点; 插入可供选择的标记基因; 建立体外包装系统。

　　构建λ噬菌体克隆载体的基本策略：

　　插入型载体、取代型载体

　　根据切除的多少，将λ-DNA分为两大类载体：

　　1、缩短长度 野生型:上限51kb λ-DNA：48.5kb，外源基因2.5kb λ-DNA上有40-50%的DNA是复制，裂解所不必需的，切除便提高装载量。

　　插入型载体(insertion vector)

　　经改造后只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,长度为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入片段最大为14kb.

　　必须携带标记基因

　　取代型载体(substitution vector)

　　具有成对的克隆位点,空载的载体DNA只26kb，不能被包装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因.

　　插入型载体只能承受较小分子量(一般在10kb以内)的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。

　　应用：

　　替换型载体可承受较大分子量的外源 DNA片段的插入，所以适用于克隆高等 真核生物的染色体DNA。

　　删除重复的酶切位点:野生型λDNA链上有 5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重 组操作，必须删除至1-2个. 为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还 需要增加一些单一的酶切位点.

　　2、酶切位点的删除或增加

　　采用定点突变技术或甲基化酶处理必需区内的酶识别序列使其失活。

　　3、灭活某些与裂解周期有关的基因

　　将无义突变引入噬菌体裂解周期所需的基因， 如将头部包装蛋白基因的CAG突变成UAG。这些 噬菌体只能在具有特异校正基因编码产物的菌株内 繁殖。 当这种λDNA进入一般大肠杆菌菌株后，不能合 成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细 菌，可阻止有害重组体的生物污染及扩散。

　　基因工程实验中使用的受体是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。

　　4、加装选择标记

　　野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加 装选择标记是λ-DNA克隆载体构建的重要内容。

　　选择标记主要有两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记

　　(1)免疫功能失活标记 (cI筛选)

　　加装选择标记cI基因 cI基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。 含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶源状态，细菌生长缓慢，形成混浊斑;

　　当外源DNA插入到标记基因中， 基因灭活， λ-重组分子便进入 溶菌循环，形成透明斑。

　　(2)加装选择标记lacZ(蓝白斑筛选)

　　lacZ基因编码β-半乳 糖苷酶，能催化无色的 X-gal生成蓝色化合物。 当外源基因插入到lacZ 基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物; 而空载体λ-DNA则产 生蓝色透明斑。

　　5、建立?-噬菌体的体外包装系统

　　体外包装原理： λ噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。 头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部和头部蛋白所需的蛋白因子;

　　将这两种突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。

　　尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部和 尾部蛋白所需的蛋白因子。

　　(三)λ-DNA作为载体的优点

　　可在体外包装成噬菌体颗粒，高效转染大肠杆菌 λ-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒 的装载量重组λ-DNA分子的筛选较为方便 重组λ-DNA分子的提取比质粒容易.

　　λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，常用于 构建基因文库

　　缺点： (1)需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费用又高; (2)没有质粒的用途广泛。