小肠结肠炎耶尔森氏菌.ppt

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia.enterocolitica)

　　xx省疾病预防控制中心 xxx

　　耶尔森氏菌(Yersinia)

　　根据耶尔森氏菌在生物化学上的多样性和DNA的相关性，可以将这个群体的成员分为4种： 小肠结肠炎耶尔森菌，中间耶尔森氏菌, 弗氏耶尔森菌和 克氏耶尔森菌。后来耶尔森氏菌属增加到11个种，其中有3种对人类有潜在的致病性：鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)和假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis) 。小肠结肠炎耶尔森菌是最重要的食源性致病菌。

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌分布很广，可存在于

　　生的蔬菜

　　乳和乳制品

　　肉

　　豆制品

　　沙拉

　　牡蛎

　　虾类

　　同时，小肠结肠炎耶尔森氏菌也存在于环境中。

　　河流

　　湖泊

　　土壤

　　植被

　　许多动物粪便中也能分离出该菌

　　灵长类

　　家畜

　　山羊

　　猫

　　狗

　　灰鼠

　　灰鼠

　　狗

　　水貂

　　在港湾周围，许多鸟类包括水禽和海鸥可能是带菌者。

　　猪的带菌率较高,日本报告检出率为4%，加拿大为3.6%，丹麦为10-17%。在猪中,该菌最易在扁桃腺中发现。

　　耶尔森氏菌作为一种食源性疾病，在世界范围内已爆发多起，食品和饮水受到污染，往往是爆发胃肠炎的重要原因。

　　七十年代在加拿大魁北克地区暴发过两起，有138名儿童感染，源于摄入生牛奶。1976年在美国纽约爆发过一起，有217名学生感染，在这起发病过程中涉及的是巴氏消毒巧克力奶。

　　1980年发生于华盛顿的一起有87人感染，污染源是用未经氯处理的泉水做的豆腐。

　　由本菌引起的胃肠炎或中毒爆发，在欧洲以冬春季节较多，夏季较少，而日本则以夏季发病率较高。在我国福建省南部地区，该菌是冬春季腹泻的重要病原菌。

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌是30年代引起注意的急性胃肠炎型食物中毒的病原菌，为人畜共患病。潜伏期约摄食后3-7天，也有报导11天才发病。病程一般为1-3天，但有些病例持续5-14天或更长。

　　主要临床症状

　　以发热、腹痛腹泻(水样便或血便)为主，病程3至4天，常呈自限性。

　　发热

　　腹痛、腹泻

　　有的患者的主要症状为急性腹痛，这些患者以青少年为主。急性期后一至3周出现自身免疫性疾病，结节性红斑，关节炎。

　　急性腹痛

　　关节炎

　　少数患者可表现为脑膜炎，肺炎，败血症即血液系统感染，尽管较少见，但死亡率较高。

　　本菌的易染人群为婴幼儿，常引起发热、腹痛和带血的腹泻。

　　形态结构(一)

　　电镜照片

　　革兰氏阴性杆菌或球杆菌，大小为1-3.5×0.5-1.3μm.大多以单个散在的形式分布，偶尔成短链状或堆状

　　形态结构(二)

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌不形成芽胞，无荚膜，有周身鞭毛;但鞭毛只有在30℃以下的条件培养时才可形成，温度较高时即丧失，因此在30℃以下有动力，而35℃以上则无动力。

　　培养特性

　　兼性厌氧 营养要求不高 4~40℃均能生长，生长最适温度20至28 ℃ 。但在4度也能生长，将此菌培养24h后，可形成扁平、半透明的小菌落。

　　培养特性

　　本菌生长温度为30-37℃，但在22-29℃才能使本菌的某些特性出现。4℃时能保存和繁殖。本菌繁殖所需要的时间较长。在SS或麦康凯琼脂上于25℃经24小时培养，菌落细小，至48小时直径才增大至0.5-3.0mm。菌落圆整、光滑、湿润、扁平或稍隆起，透明或半透明;

　　在麦康凯琼脂上菌落淡黄色，如若微带红色，则菌落中心的红色常稍深。本菌在肉汤中生长呈均匀混浊，一般不形成菌膜。

　　菌落扁平、无色或者淡红色，直径1-2 mm

　　麦康凯平板上的小肠结肠炎耶尔森氏菌

　　血清学分型(1)

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株根据其耐热性和耐受高压灭菌的菌体抗原能被血清学分型。 Wanters将小肠结肠炎耶尔森氏菌和相关菌归纳为54个血清群，Aleksii和Bockemuh等人提议将小肠耶氏菌的血清群简化为18个群。 引起人类疾病的主要血清群是0:3,0:8,0:9和0:5,27。 我国以O3型为主，有毒菌株大多可以产生V和W抗原， 产生耐热肠毒素。某些菌株的O抗原与人的组织具有共同的抗原，可以引起自身免疫性疾病。

　　传播途径

　　日常生活中以粪口传播为主 该菌侵入机体后主要在肠粘膜繁殖，引起炎症和溃疡，病变可扩展到肠系膜淋巴结。

　　致病性

　　肠毒素 侵袭性 自凝性 VW抗原 毒性质粒

　　1、肠毒素

　　该菌能产生耐热性肠毒素，(分子量为10-50KD)，能耐热121℃30分钟，能在4℃保存7个月，pH1-11中稳定。但肠毒素的产生仅限于22-25℃。血清型03、08和09几乎经常产生肠毒素，在其他血清型中也有产生肠毒素的菌株。该肠毒素被摄入即可引起发病。

　　2、侵袭性

　　Hela细胞感染：血清型O1、O3、O4、O5B、O8、O9、O15、O18、O20、O21和O22都能侵入Hela细胞，鉴于Hela细胞感染阳性株多是人类致病的常见血清型，以及从人和动物死亡所见肠类的侵入模型，表明Hela细胞侵入性在小肠结肠炎耶尔森氏菌腹泻的发病机理上是很重要的。 Sereny试验：有人将11株小肠结肠炎耶尔森氏菌的菌悬液接种于豚鼠眼结膜，有6株引起严重的角膜结膜炎，即Sereny试验阳性。这6株均为O8血清型。

　　3、自凝性

　　1980年Laird等人提出了一种测定本菌毒力的简易方法，即将试验菌接种于两管含10%小牛血清的组织培养液内，分别置22℃和36+1℃培养，若22℃培养，菌液混浊，而37℃培养，细菌凝结，上层液体透明，即为有毒力的菌株，称为自凝阳性。在检查的180株菌中有25株阳性，这些阳性菌株均能引起腹泻。

　　凝集试验

　　在 培养液中于 22℃培养，小肠结肠炎耶尔森氏菌呈现浑浊生长 (左边试管) 在 36℃培养时细菌自身凝集，聚集在管底。(右边试管)

　　4、VW抗原

　　已知该菌的某些菌株具有与鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌在免疫学上相同的VW抗原。其在37℃生长时需要钙而在25℃生长时不需要钙的菌株即含VW抗原。Karmali等人将从病人粪便检出的O21血清型自凝阳性的菌株，在草酸镁琼脂上于35℃培养不生长，用于口服小鼠则产生腹泻。可见自凝阳性与缺钙培养基上35℃无生长能力是一致的，能使小鼠发生腹泻。

　　5、毒性质粒

　　耶氏菌病和小肠结肠炎耶尔森氏菌带有41-48Mdalton的质粒有关。这被认为是毒性质粒，即与毒力有关的质粒。有人将失去毒性质粒的O8、O3和O9型菌株用小鼠作喂饲试验，均不发病，但用带毒性质粒的O8和O3型菌株试验时，小鼠则均发生腹泻或死亡。且菌株自凝试验的结果与毒性质粒的存在与否相一致。

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌在刚果红脑心浸液琼脂上于35℃生长24h

　　不带质粒的小肠结肠炎耶尔森氏菌的菌落为较大、不规则、扁平、半透明 携带质粒的小肠结肠炎耶尔森氏菌的菌落为针尖大小、圆形、凸起、红色不透明

　　GB/T4789.8小肠结肠炎耶尔森氏菌 的修订

　　背景 主要参考资料 主要修改情况及依据说明

　　背景

　　国家标准GB/T4789.8食品卫生微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验是1984年我国首次发布实施的，1994年和2003年两次修订发布。 2005年国家疾病预防控制中心牵头组织开展食品卫生微生物学标准的修订工作，小肠结肠炎耶尔森氏菌的测定方法被列入修订。

　　主要参考资料(1)

　　1. SN 0174—92 出口食品小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法　　 2. FDA Bacteriological Analytical Manual , Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis(2001) 3. ISO10273 Microbiology of food and animal feeding stuffs—Horizontal method f or the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica(2003) 4. UDC 579.842.23 Nordic committee on food analysis Yersinia enterocolitica.detection in foods 5.吕志平 国内外技术法规和标准中食品微生物限量. 中国标准出版社 北京 2002

　　主要参考资料(2)

　　Aleksic, S., and J. Bockemuhl. 1984. Proposed revision of the Wauters et al. antigenic scheme for serotyping of Yersinia enterocolitica. J. Clin. Microbiol. 20:99-102. Aleksic, S., A. Steigerwalt, J. Bockemuhl, G. Huntley-Carter, and D.J. Brenner. 1987. Yersinia rohdei sp. nov. isolated from human and dog feces and surface water. Int. J. Syst. Bacteriol. 37:327-332. Archer, J R, R F Schell, D R Pennell and P D Wick. 1987. Identification of Yersinia spp. with the API 20E system. J Clin Microbiol. 25(12): 2398-2399. Aulisio, C.C.G., I.J. Mehlman, and A.C. Sanders. 1980. Alkali method for rapid recovery of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from foods. Appl. Environ. Microbiol. 39:135-140.

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　　主要修改情况及依据说明

　　标准主要修改的内容 修改依据及说明

　　标准主要修改的内容

　　4℃冰箱冷增菌改为置26℃增菌48-72h。 生化鉴定增加了API 20E和Vitek GNI。

　　修改依据及说明

　　增菌温度及增菌时间的修改依据 生化鉴定增加API 20E和Vitek GNI的修改依据

　　增菌温度及增菌时间的修改依据(1)

　　原国标使用的增菌时间为检样25g(mL)+225mL改良磷酸盐缓冲液，置4℃冰箱进行冷增菌7d、 14d、21d. SN使用的的增菌时间为检样25g(mL)+225mL改良磷酸盐缓冲液，于25℃培养48±2h。 FDA使用的增菌时间为无菌称取25.0g样品于225mL蛋白胨山梨醇胆汁肉汤(PSBB)中，均质30秒，置10℃培养10天。

　　ISO使用的的增菌时间为(1)样品置于PSB中，于22℃～25℃振荡培养48～72h或不振荡培养5d。(2)样品置于ITC中于25℃培养48h。

　　增菌温度及增菌时间的修改依据(2)

　　原国标使用的增菌方法中的增菌温度低，增菌时间长。SN、FDA、ISO等组织使用的增菌温度均高于原国标。增菌时间也较短。通过我们的试验，发现使用改良磷酸盐缓冲液增菌，于26℃增菌48h-72h，可以达到原国标方法的预期效果。

　　生化鉴定增加API 20E和Vitek GNI的修改依据

　　原国标中未涉及， API 20E和Vitek GNI方法与比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用，如SN、FDA、ISO等组织。 我国许多单位也积累了较多的经验，考虑到此系统在国内的实际应用现状，拟定在生化鉴定方面“采纳API 20E和Vitek GNI为传统生化鉴定方法的选择性替代方法”。

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌检验

　　检验程序

　　样品的采集和处理

　　采集样品后立即开始检验，或者将样品于4℃保存，因为大多数细菌在4℃不能繁殖，但小肠结肠炎耶尔森氏菌可以生长。 虽然耶尔森氏菌也能够从冷冻食品中检验出来，但建议检验前不要冷冻样品。

　　增菌

　　以无菌操作取检样25g(mL)放入装有225mL改良磷酸盐缓冲液增菌液的无菌均质器内，均质1—2min,置26℃±1℃增菌48h-72h。

　　碱处理

　　将肉及其制品的增菌液0.5mL与碱处理液4.5mL混合15s。

　　分离培养

　　将增菌液和经过碱处理的增菌液分别接种CIN-I培养基和改良Y培养基,于26℃±1℃培 养48h，小肠结肠炎耶尔森氏菌在CIN-I培养基上为红色牛眼状菌落,在改良Y培养基上为无色透明、不粘稠的菌落。

　　CIN平板上的小肠结肠炎耶尔森氏菌

　　中心深红色 ，周围有清晰的无色透明带，直径1-2 mm

　　改良克氏双糖试验

　　分别挑取上述可疑菌落3—5个，接种改良克氏双糖斜面,于26℃±1℃培养24h ,将斜面和底部皆变黄者做进一步的生化鉴定。

　　尿素酶试验和动力观察

　　将改良克氏双糖上的可疑培养物接种到尿素培养基上, 于26±1℃培养后将阳性者接种两管半固体,分别放置26℃和37℃恒温培养箱中,培养24h检查,如在26℃有动力者可进行镜检和进一步的生化试验。

　　尿素琼脂

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌 = 粉红色 (尿素阳性)

　　大肠杆菌= 无色 (尿素阴性)

　　加了TTC的动力试验培养基

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌在26℃培养时有动力 (左边两管) ， 在37℃培养时无动力 (右边两管)

　　染色镜检

　　将上述可疑菌落做涂片染色,进行显微镜观察,呈革兰氏阴性球杆菌,有时呈椭圆或杆状,大小为(0.8μm ~3.0μm)×0.8μm

　　400× 400

　　生化鉴定

　　从营养琼脂平板上挑取菌落做生化试验，所有的生化反应皆在26℃±1℃培养。

　　胆汁七叶苷琼脂

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌 (除1A同种生物型) =七叶苷阴性(不变黑)

　　粪肠球菌= 七叶苷阳性(黑色)

　　赖氨酸精氨酸铁琼脂(LAIA)斜面

　　小肠结肠炎耶尔森氏菌 (左边) = K A ? ?

　　沙门氏菌(右边) = K K + ?

　　吡嗪酰胺酶试验

　　在斜面上加1 ml新鲜配制的1%的硫酸铁铵， 在15min内变粉红即为+, (右边两管=阳性, 左边两管 = 阴性).

　　商品化生化鉴定系统

　　可选择使用2种商品化的生化鉴定系统(API 20E或Vitek GNI)中任一种，代替常规的生化鉴定 API 20E ：从营养琼脂平板上挑取可疑菌 落，按照API20E操作手册进行并判读结果。 Vitek GNI全自动微生物生化分析仪： 琼脂平板上挑取可疑菌落，按照Vitek GNI操作手册进行并判定结果。 综合以上生化特性作出报告

　　谢谢大家