内毒素和1，3-β-D-葡聚糖检测的临床应用.ppt

　　内毒素和1，3-β-D-葡聚糖检测的临床应用

　　主要内容

　　内毒素的来源及结构 内毒素的生物学活性 内毒素检测的临床应用 内毒素的检测方法及参考范围 检测样本的采集及影响因素

　　内毒素概述

　　内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的脂多糖(LPS)，这些成分只在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或活菌以发泡形式将其释出。

　　(Gp:) 外层

　　(Gp:) 菌体多糖(O抗原)，与细菌侵袭力有关。

　　(Gp:) 中层

　　(Gp:) 同一种属之间是相同的。

　　(Gp:) 内层

　　(Gp:) 特殊的糖磷脂，起毒性作用，而无种属特异性。

　　特异性多糖

　　核心多糖

　　类脂A

　　内毒素的结构

　　(Gp:) 发热反应

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 激活血管活性物质的释放

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 激活凝血和纤溶系统

　　(Gp:) 3

　　内毒素的生物学活性

　　(Gp:) 直接或间接损害肝脏

　　(Gp:) 5

　　(Gp:) 激活白三烯、前列腺素及单核巨噬系统

　　(Gp:) 6

　　内毒素的生物学活性

　　(Gp:) 激活补体

　　(Gp:) 4

　　内毒素的有益作用

　　(Gp:) 增加机体非特异性免疫力

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 防御放射性损伤，促进粒细胞生成

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 增加网状内皮系统功能

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 抗肿瘤，免疫佐剂作用

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 内源性

　　(Gp:) 内毒素血症

　　(Gp:) 外源性

　　内毒素血症产生原因

　　(Gp:) 肠道内毒素的吸收

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 败血症时血中细菌的释放

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 3

　　有效的抗菌治疗后，细菌崩解

　　输入了含有细菌的药物、血液或者体液等。

　　内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状，以及休克、血压下降、组织灌流不足、缺氧及酸中毒等。

　　内毒素血症的临床症状

　　最严重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，DIC等。病死率极高。

　　肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、烧伤85%、急性胰腺炎90%、败血症70%、急性肝炎37-64%、暴发性肝炎58-100%、丙肝61.54%、胆石症伴急性梗阻性化脓性感染85%、多器官功能衰竭100%。

　　各类疾病内毒素血症的发生率

　　内毒素检测的临床应用

　　(Gp:) 在肝胆疾病中的应用

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 在呼吸系统感染中的应用

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 在胰腺疾病中的应用

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 在溃疡性结肠炎中的应用

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 在全身性细菌感染中的应用

　　(Gp:) 5

　　(Gp:) 在不明原因发热中的应用

　　(Gp:) 6

　　内毒素检测在医院中的应用

　　(Gp:) 在医院灭菌制剂检验中应用

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 对注射器、输液器等医疗器械的内毒素检测

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 在透析站和血站中的应用

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 在临床医学研究中的应用

　　(Gp:) 4

　　鲎试验是1968年由Levin和Bang建立。其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断试品中细菌内毒素含量的一种方法。

　　内毒素的检测方法

　　(Gp:) 背面观 就像是古代武士的心甲

　　(Gp:) 腹面观腹部基本呈六角形，还可以看到它发达的附肢

　　内毒素的检测原理

　　革兰阴性菌脂多糖(内毒素)检测原理：革兰阴性菌脂多糖(内毒素)激活酶反应主剂中的相应因子后形成凝固蛋白， 根据其引起的浊度变化对革兰氏阴性菌脂多糖(内毒素)浓度进行定量测定。

　　内毒素的检测原理

　　G

　　G

　　内毒素的检测方法

　　鲎试剂(Limulus amebocyte lysate LAL)

　　(Gp:) 凝胶法——0.03EU/ml范围内半定量

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 浊度法——0.006-300EU/ml,检测范围大

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 比色法——0.006-15EU/ml范围内定量

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) ELISA——0.1pg/ml

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 流式细胞术——测内毒素的量而不是活性

　　(Gp:) 5

　　(Gp:) 化学发光测定法

　　(Gp:) 6

　　内毒素检测的参考值

　　检测值﹤10pg/ml,阴性。 检测值介于10～20pg/ml之间，临床观察期，建议动态采血检测。 检测值﹥20pg/ml，阳性，建议再次采血以确诊。

　　肝炎 败血症 肿瘤 内毒素浓度 50-320 20-1000 20-700

　　检测样本的采集及影响因素

　　检测样本：血液 采集要求：采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采血管。常规病人早上用药治疗前空腹采血/取样(血透患者透析前采血)。 样本保存：样本采集后应在3000转/分进行离心，若不能及时检测，应将血浆转移至无热原转移管内，在-30℃冰箱中冷冻保存，一周内使用。 特殊标本处理 ：对一般黄疸、溶血、乳糜血标本，稀释2~5倍后进行检测 ;对于严重的黄疸、溶血、乳糜血标本，应重新采血。

　　影响结果的因素

　　产生假阳性的原因有：操作环境及操作过程中污染，应用某些抗生素类如?-酰胺内酯类、喹喏酮类等患者。

　　MB-80微生物快速动态检测系统

　　(1-3)-?-D-葡聚糖

　　侵袭性真菌感染的定义

　　定义: 指致病性真菌侵犯皮 下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性较大。

　　条件致病性真菌 念珠菌属 曲霉属 其他

　　侵袭性真菌感染的特点

　　1. 不产生内毒 素和外毒素 致病机理不明

　　4. 早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高

　　2. 致病力一般 较弱，机体免 疫低下时发生

　　3. 感染菌种变化， 白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增长趋势上升明显

　　侵袭性真菌感染(IFI)现状

　　IFI发生率不断增加; IFI感染病死率很高; IFI诊断困难及漏诊情况严重。

　　1.内源性诱因

　　2.外源性诱因

　　影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、 肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等

　　广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂;

　　插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植;

　　免疫缺陷综合症

　　侵袭性真菌感染的诱因

　　国内侵袭性真菌感染不容忽视

　　刘正印等，中华医学杂志2003,83(5):399-402

　　感染人数

　　国内侵袭性真菌感染不容忽视

　　临床药物治疗杂志 2007年第5卷第1期

　　感染率(%)

　　中国感染与化疗杂志2008 年7 月20 日第 8 卷第4 期

　　尸检研究发现，75%的侵袭性真菌感染病例在生前漏诊

　　诊断困难的主要原因： --- 临床表现不典型，易被基础疾病所掩盖 --- 确诊常需侵入性手段获得组织标本，侵入性操作常因患者 的病情所限难以实施 --- 真菌检测项目开展相对不足或滞后

　　IFI诊断困难及漏诊情况严重

　　主要可引发侵袭性真菌感染的疾病

　　肺炎 肺纤维症

　　脑出血 脑梗塞 硬膜下血瘤术后 胸部大动脉瘤术后

　　糖尿病

　　再生障碍性贫血 MODS DIC

　　胃癌，肝癌，肝内胆管癌，肺癌，多发性骨髓瘤，白血病，恶性淋巴瘤

　　肺结核 腹腔内脓肿 AIDS

　　呼吸系统 疾病

　　感染及 寄生虫病

　　循环系统 疾病

　　内分泌 疾病

　　血液及造血 器官疾病

　　肿瘤类

　　侵袭性真菌感染( invasive fungal infection, IFI)的发病率逐年上升,其中又以侵袭性肺部真菌感染( invasive pulmonary fungal infection, IPF I) 最常见,大约占50%～60%。未经及时治疗的肺部真菌感染患者的病死率可高达30% ～80% 。

　　侵袭性肺部真菌感染

　　临床表现：缺乏特异性,多表现为发热、咳嗽、咳痰、咯血、胸闷、呼吸困难等。

　　现 状：两高两低一快 检测方法相对滞后,早期诊断和治疗仍存在困难,副作用小的 新型抗真菌药物价格昂贵,导致病死率高。

　　高院内感染率和病死率 低临床和实验室诊断率 患者病情恶化快

　　侵袭性肺部真菌感染

　　死亡率(%)

　　诊断延迟 时间 (h)

　　ICU诊断延迟时间与死亡率的关系

　　11

　　33

　　30

　　35

　　(Gp:) 10

　　(Gp:) 15

　　(Gp:) 20

　　(Gp:) 25

　　(Gp:) 30

　　(Gp:) 35

　　(Gp:) 12 h

　　(Gp:) 12-24 h

　　(Gp:) 24-48 h

　　(Gp:) 48 h

　　Morrell M et al. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:3640–3645.

　　美国四大医疗中心做的一项回顾性研究

　　死亡率(%)

　　诊断延迟时间(d)

　　Garey KW et al. Clin Infect Dis 2006, 43:25–31 .

　　(Gp:) b1,6 葡聚糖

　　(Gp:)

　　(Gp:) 磷脂双分子层

　　(Gp:) 几丁质

　　(Gp:) 麦角固醇

　　(Gp:) b1,3葡聚糖 合成酶

　　(Gp:) mannoproteins

　　β1,3

　　真菌细胞膜、壁结构

　　羊毛固醇C-14去甲基化酶 14位还原和7-8位异构酶 角鲨烯环氧化酶

　　1-3-β-D-葡聚糖本质及特点

　　(Gp:) 真菌细胞壁成分，占50%以上

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 其他微生物、动物及人的细胞不含该成分

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 用于侵袭性真菌感染的早期诊断

　　(Gp:) 3

　　(1-3)-β-D-葡聚糖特性

　　(Gp:) 1.

　　(Gp:) 2.

　　(Gp:) 3.

　　对热极为稳定，高压 121℃并不能使其灭活。 在念珠菌和曲霉菌细胞 壁中含量较多，对G 试验灵敏。

　　当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，(1-3)-β-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。

　　在浅部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。

　　“G”试验缘何而来?

　　1-3-β-D-葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。

　　(Gp:) (1-3)?-D-Glucan LAL-RM(反应物)

　　(Gp:) G因子

　　(Gp:) 活化G因子

　　(Gp:) 凝固酶原

　　(Gp:) 凝固酶

　　(Gp:) 凝固蛋白原

　　(Gp:) 凝固蛋白(凝胶)

　　(Gp:) 试验反应机理图：

　　内毒素与β-葡聚糖的检测比较

　　已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，但它们的反应曲线不一样。内毒素反应曲线为S型特征曲线，而β-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。

　　? 内毒素和β-葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线

　　(Gp:) 观察期不确定，费时费力，特征性不明显并对医师的专业水平要求高

　　(Gp:) 辅助方法：临床表现，免疫学，病理学，影像学检查等

　　(Gp:) 用于实验室检测，已成为这一领域研究的热点

　　(Gp:) 3.PCR技术：真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查和真菌核酸检测

　　(Gp:) 对儿童及接受造血干细胞移植患者、ICU患者不适用

　　(Gp:) 2.GM试验：曲霉属半乳甘露聚糖抗原检测。判断是否曲霉属真菌感染

　　(Gp:) 耗时短，灵敏度高，特异性强，定量检测可判断感染严重程度

　　(Gp:) 1.G试验：通过检测(1-3)-β-D-葡聚糖的含量，判断是否有真菌感染

　　(Gp:) 非传统 检查

　　(Gp:) 敏感性低，耗时长, 培养阳性率低。培养结果是定性的，有些标本采集困难

　　(Gp:) 直接培养真菌法

　　(Gp:) 传 统 检 查

　　(Gp:) 特 点

　　(Gp:) 方 法

　　侵袭性真菌感染的临床检测方法对比

　　科玛嘉念珠菌显色培养基的菌落颜色：

　　热带念珠菌----灰蓝色 白色念珠菌 ----绿色 克柔念珠菌----粉红色 光滑念珠菌----紫红色 其他念珠菌----白色

　　科玛嘉念珠菌显色培养基的菌落颜色： A/E--白色假丝酵母菌，B/C-克柔假丝酵母菌，F--光滑假丝酵母菌，D-热带假丝酵母菌

　　?-D-葡聚糖的评价

　　可检测多种致病真菌感染 念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，组织胞浆菌， 毛孢子菌等 不能检测隐球菌、接合菌(根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等) 敏感性、特异性：90%左右

　　对于念珠菌血症, G试验检测是首选检查 J. Clin. Microbiol. 2008.46:1009–1013.

　　BG值在IFI临床表现出现之前就已经高于正常值 Pazos等报道5例确诊IFI及3例临床诊断的IFI患者，发现BG值升高出现在发热、咳嗽、胸痛等症状和肺部HRCT检查发现以前 。 平均早于发热5 d 早于呼吸道症状平均10.7 d J Clin Microbiol，2005，43(1)：299—305

　　G试验检测评价

　　Odabasi等对确诊为粒细胞缺乏人群进行为期3周每周2次采血检测及临床观察 发现：BG值开始高于60 pg/ml的时间比最后确诊为IFI或临床诊断IFI平均提前了10 d Clin Infect Dis，2004，39(2)：199—205

　　G试验检测评价

　　?-D-葡聚糖参考值

　　检测值﹤10pg/ml,阴性。 检测值介于10～20pg/ml之间，临床观察期，建议动态采血检测。 检测值﹥20pg/ml，阳性(深部真菌感染)，建议再次采血以确诊。

　　关于G试验建议

　　G试验临床应用 1　明确诊断 　　(抗真菌药物治疗前) 　2　治疗效果监测 　　(抗真菌药物治疗后) 　3　连续2次采血进行G试验

　　标本采集及保存

　　临床细菌内毒素及(1-3)-?-D-Glucan检测的国内外发展

　　国外：血液(包括血浆、脑脊液、血清、腹水液、尿液、唾液、乳汁等)中内毒素以及(1-3)-?-D-Glucan微量定量检测已经成为现实，目前在美国、日本等国均已出现专用细菌内毒素及(1-3)-?-D-Glucan检测仪器及配套的检测试剂盒，而且获得FDA及厚生省批准文号，作为一种日常检测项目。 国内：MB-80 检测系统，为国内独家研制和生产的检测临床内毒素及(1-3)-?-D-Glucan的专用仪器，同时具有配套的检测试剂盒 EKT-5Mset and GKT-%M set　获得SDA批准文号,

　　谢谢