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　　蛋白质分离技术-层析

　　一、概述

　　1、定义 层析(又名色谱) 一种利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异，使各组分在层析两相中以不同程度分配，借此将各组分分离。

　　分子极性 分子大小 分子形状 离子亲和力分子亲和力吸附能力

　　(Gp:) 凝胶层析

　　(Gp:) 离子交换层析

　　(Gp:) 亲和层析

　　2、物理化学性质间的差异

　　吸附层析

　　1903年 俄国植物学家 茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带; 1970s早期 高效液相色谱法(HPLC) 目前 气相层析仪和HPLC与色谱、质谱以及计算机联用。

　　3、层析的发展

　　层析法进行时有两个相，一个相称为固定相，另一相称为流动相。

　　支持物

　　含待分离物质

　　气 相 层 析

　　液 相 层 析

　　气-固 气-液

　　液-固 液-液

　　二.层析技术的分类

　　1. 按两相所处的状态分类

　　以气体作为流动相

　　以液体作为流动相

　　2.按层析的机制可分为

　　吸附层析 分配层析 凝胶层析 亲和层析 离子交换层析

　　定义 指混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质的吸附力而使混合物分离的方法。

　　原理 在不同条件下，吸附剂与被吸附物之间的作用 物理作用的范德华吸附：无选择性，吸附速度快，吸附的过程是可逆的 化学吸附：由原子价力的作用引起。有选择性，吸附速度较慢，不易解吸

　　(1)吸附层析

　　在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。

　　吸附层析

　　常用的吸附剂

　　硅胶

　　碱性:碳氢化合物 中性:醛,酮,醌,酯,内酯酸性:酸性色素,醛,酸

　　聚酰胺

　　氧化铝

　　活性炭

　　磷酸钙

　　粉末:吸附力大,流速慢 颗粒:吸附力中,流速易控 锦纶-活性炭:吸附力弱

　　锦纶66或锦纶6 酰胺基团 对酚,DNP-氨基酸, 醌,羧酸 氢键：羟基与羰基

　　唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石

　　(2)分配层析

　　——利用不同组分在流动相和固定相中的分配系数不同而进行分离的方法。

　　柱层析 进样量大且容易回收 薄层层析 小量样品，快速， 操作简便

　　3.按制备量分类

　　■ 层析法的演变过程：

　　圆形滤纸

　　长条滤纸

　　薄层层析 (TLC)

　　柱层析

　　容量变大

　　容量更大

　　加展开液

　　纸层析

　　薄层层析

　　三.层析的一般原理

　　1.分配系数 表示一种物质在两种特定相(流动相和固定相)中分配程度。

　　溶质在固定相中的浓度 Cs K= ———————————— = —— 溶质在流动相中的浓度 Cm

　　?特定的温度：常数 ?K大：被固定相吸附的牢固，随流动相 的移动速度较慢。

　　纯化生物物质的纯度 取决于混合物中各组分K 值的差异程度。 混合物中各组分若 K值相差较大, 则能较易地把混合物中的生物物质分离。反之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物质分离。

　　凝胶层析Gel Chromatography

　　凝胶过滤 (gel filtration)(Porath, Flodin, 1959) 分子筛层析(molecular sieve chromatography) (Hjertén, Mosbach, 1962) 排阻层析 (exclusion chromatography)(Pedersen, 1962) 指混合物随流动相经固定相的层析柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。

　　一、基本原理

　　固定相(凝胶)

　　——三维空间网状结构

　　A good gel for gel filtration contains about 95% water

　　■ 凝胶层析法：

　　(Gp:) 样品

　　(Gp:) 固 定 相

　　(Gp:) 流 动 相

　　(Gp:) 小分子 被延滯

　　(Gp:) 小分子

　　(Gp:) 大分子

　　(Gp:) 较快流出

　　分子筛效应： 分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。

　　凝胶层析过程的数理关系

　　1、柱床体积(VT) 2、洗脱体积(Ve) 即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱液的总体积。 3、外水体积(V0) 4、内水体积(Vi) 5、凝胶干体积(Vg)

　　柱床体积VT

　　凝胶干体积Vg 内水体积Vi

　　存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中流动相的体积。

　　颗粒内部所含水相的体积它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量相减求得。

　　凝胶体积以及颗粒内外间隙体积的总和。 VT = 1/4 ?D2h

　　外水体积V0

　　VT = Vg + V0 + Vi

　　数理关系

　　Ve -Vo Kd = ———— Vi

　　6、分配系数( Kd )：

　　特点： (1)与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关 (2)与柱的长短粗细无关

　　每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数(Kd)

　　Ve=Vo+KdVi

　　(2)Ve = Vo + Vi Kd = 1 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1,最后流出.

　　(1)Ve = Vo Kd = 0 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外 全部分布于流动相里, 最先流出。

　　(3) 0

　　(Gp:) Kd=0 0

　　(Gp:) 洗脱体积

　　?三.凝胶层析的优点 1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定。 2. 操作条件较温和。 3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的分离纯化。

　　四、凝胶层析的缺点 1.要求样品和洗脱液的粘度很低。 2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。 3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用。

　　五、凝胶的结构与性能

　　1.葡聚糖凝胶 1959年Porath和Flodin合成 (商品名为Sephadex) (1)结构： 基本骨架：葡聚糖(dextran) 交联剂：3-氯代-1 ,2-环氧氯丙 烷使葡聚糖之间通过醚键交联 聚合而成的三维空间网状结构。

　　(2)特点：

　　交联度： 交联剂越多 交联度越大 网孔结构越紧密 交联剂越少 交联度越小 网孔结构越疏松

　　化学性质： 稳定,不溶于水、盐、弱酸、碱和一般有机溶剂, 耐热耐碱不耐强酸

　　(2)特点：

　　Sephadex的分级范围 G10 <700 G15 <1,500 G25 1,000 ~ 5,000 G-50 1,500~30,000 G-75 3,000~70,000 G100 4,000 ~150,000 G150 5,000 ~400,000 G200 5,000 ~800,000

　　吸水性 G类的型号 表示每克干凝胶吸水量(ml)x10 如G-50 每克干凝胶吸水量为5ml。

　　大孔凝胶 工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限 可分离MW40万以上的物质 可用来分离核酸及病毒。

　　2.琼脂糖凝胶(商品名为Sepharose)

　　3.聚丙烯酰胺凝胶

　　■ 各 种 层 析 胶 体 ：

　　Pharmacia

　　Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel

　　glucose agarose glucose + acrylamide cellulose

　　(Gp:) Bio-Rad

　　(Gp:) BioGel P BioGel A

　　(Gp:) acrylamide agarose

　　六.其它条件选择

　　1.柱的选择 柱短而粗,则易使样品稀释,柱长而窄,则柱的管壁效应较大,会造成拖尾现象。

　　2.样品的选择： 量适当, 粘度小。 3.洗脱液的选择： 每种样品分离所用的缓冲洗脱液应根据使样品稳定的原则使用。

　　七、应用

　　1.分离纯化 2.脱盐 3.测分子量

　　Elution volume (ml)

　　Albumin

　　NaCl

　　Desalting in a simple column

　　测分子量

　　Ve

　　log Mr

　　实验： 凝胶层析法分离蛋白质

　　血红蛋白 64,480 二硝基苯-鱼精蛋白 2,000-12,000 Sephadex G-50 孔径 1,500-30,000

　　一、原理：

　　Kd=0

　　Kd=1

　　1、装柱 ※先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积; ※凝胶不能有气泡和分层现象; ※装柱结束后要保持凝胶表面平整。

　　二、操作注意点：

　　2、加样 ※使液面和凝胶表面相切，关闭出口; ※加样时尽量不要破坏凝胶面; ※让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱。

　　血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的洗脱体积? 柱的外水体积和内水体积

　　三、结果要求：

　　亲 和 层 析Affinity Chromatography?

　　Ni Peihua

　　一、原理

　　亲和层析是利用生物大分子所具有的专一亲和力而设计的纯化技术。 寻找配基 使配基固定化 制成亲和层析柱

　　基本过程

　　(Gp:) +

　　固相化

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) 洗脱

　　吸附

　　解吸

　　(Gp:) +

　　(Gp:) 样品

　　(Gp:) 固相化

　　(Gp:) 再生

　　酶： 基质类似物，抑制剂，辅酶 抗体： 抗原，病毒，细胞 细胞： 细胞表面特异蛋白，外源凝集素 核酸： 互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶， 结合 蛋白 激素或药物：受体，载体蛋白 外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞

　　常见具有专一性亲和力的生物分子对：

　　(一) 载体的选择

　　1、载体要求： (1)不溶性 (2)渗透性：疏松网状结构，有良好的液 体流动性 (3)化学和机械性能稳定 (4)具备大量能被活化的基因 (5)抗微生物和酶的侵蚀

　　2、常用载体 (1)纤维素 特点：价廉、来源充足 纤维性、非均一性限制大分子的掺入 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化

　　(2)葡聚糖凝胶 特点： 化学及物理性质稳定 多孔性比琼脂糖低

　　? (3)琼脂糖凝胶

　　浓度 商品 2% Sepharose 2B 4% Sepharose 4B 6% Sepharose 6B

　　凝胶浓度越低 结构越疏松即多孔性越高 机械强度越低

　　(4)聚丙烯酰胺凝胶

　　(5)多孔玻璃 特点：不受微生物的侵蚀 耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附

　　特点：物理化学性质稳定 抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强 可供化学反应的酰胺基较多

　　(二)配基的选择

　　1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力 2、必须具备能被修饰的功能基团

　　以酶和底物为例：

　　E+L EL KL =[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL] E0、L0：起始浓度 当L0》E0时 KL =[E0-EL][L0]/[EL] [EL]=[E0-EL][L0]/ KL Kd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/ KL

　　KL

　　KL：解离常数 E：酶 L：底物 EL：复合物

　　(三)固相化——将配体以共价键连接于固相基质上制成固相化吸附剂

　　载体的排斥效应 载体的空间障碍

　　二、亲和层析分离

　　1、装柱和平衡 2、上样、亲和吸附 3、洗脱

　　无效洗脱

　　吸附效率不高

　　有效吸附

　　洗脱方法 (1)非特异性洗脱：改变 洗脱液pH值 离子强度 梯度洗脱 (2)特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。 断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键 (3)专一性洗脱

　　已使用过和柱，经过再生处理，去除非特异吸附的杂质后，可重复使用。 再生步骤： 起始缓冲液重复平衡一次 用高离子强度和低离子强度溶液处 用弱酸或弱碱溶液处理

　　4、亲和柱的再生：

　　三、特点

　　1、只需一步纯化步骤 2、产物非常纯 3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质 4、还可去除已变性或部分降解物质

　　四、应用

　　1、分离和纯化 2、分辨化学或遗传学上修饰的酶 3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质结构研究 4、纯化人工合成的多肽和蛋白质 5、解释酶作用机理

　　实验分离豌豆凝集素

　　载体 Sephdax G50 配基 葡聚糖 洗脱液 1mol/L NaCl 特异性洗脱液 1mol/L NaCl 0.2mol/L葡萄糖

　　1mol/L NaCl

　　杂蛋白

　　1mol/L NaCl 0.2mol/L 葡萄糖

　　豌豆凝集素

　　活性检测 与兔红细胞发生凝集反应

　　离子交换层析ion exchange chromatography

　　一、原理

　　离子交换层析是用离子交换剂(具有离子交换性能的物质)作固定相，利用它与流动相中的某种离子进行可逆的交换性质来分离子型混合物的层析方法。

　　(Gp:) 低盐

　　(Gp:) 高盐

　　(Gp:) 分离结束

　　(Gp:) 带电荷

　　(Gp:) 不同蛋白在特定pH值下有不同带电性质

　　离子交换树脂如何分离蛋白质

　　洗脱

　　树脂

　　与树脂结合力

　　二、离子交换剂的类型

　　在惰性载体上引入带有电荷的活性基团 (一)按活性功能基团带电荷性质不同 阳离子交换剂 —— 带负电荷，与阳离子交换 阴离子交换剂 ——带正电荷，与阴离子交换 ?? 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。

　　(Gp:) 胶体

　　(Gp:) 胶体

　　1.离子交换树脂： (1)类型 聚苯乙烯树脂：

　　(二)按载体种类不同

　　苯乙烯

　　二乙烯苯

　　(Gp:) 聚苯乙烯

　　母体

　　交联剂

　　聚丙烯酸—阳离子交换树脂 甲基丙烯酸 二乙烯苯 特点：高交换量 pH<8 羧基不完全解离

　　(2)离子交换树脂的性质

　　①、一般离子交换剂的特性 多孔性：疏松、多孔网状，活性基团在网孔内 不溶性：不溶于稀酸、稀碱、有机溶剂 稳定性： 离子交换性：具相当数量的可交换或带电基团

　　②、交换量：指交换剂中可交换的离子数

　　Dowex 100 149?m Dowex 50 297?m Dowex 20 840?m

　　③ 、交联度： 合成树脂时所用的交联剂在原料总重量中所占的百分比 交联度越大 树脂的网孔越小 膨胀性小 交换量少 交联度越小 树脂的网孔越大 膨胀性大 交换量大 膨胀性增加易引起树脂的机械变形破损

　　阳离子交换树脂 强酸型 磺酸基 -SO3-H+ 中等酸型 磷酸根 -O-PO2H2 亚磷酸根 -O-POH2 弱酸型 羧基 -COOH 阴离子交换树脂 强碱 季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱 叔胺、仲胺、伯胺基团

　　(3)可引入的解离基团

　　(4)离子交换树脂对离子的亲和力

　　(Gp:) ■ 离子取代顺序：

　　(Gp:) ++

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) +

　　(Gp:) >

　　(Gp:) >

　　(Gp:) 电荷高者

　　(Gp:) 离子大者

　　(Gp:) 浓度大者

　　(Gp:) >

　　(4)离子交换树脂对离子的亲和力

　　①阳离子树脂 电价数：Na+

　　阴离子交换纤维素 —DEAE-纤维素 pH8.6以下分离中性或酸性物质,具二乙胺乙基阳离子交换纤维素 —CM-纤维素 一般pH>4条件下使用,具有羧甲基

　　2.离子交换纤维素

　　3.离子交换凝胶— 分离大分子物质 如：葡聚糖(Sephadex) 聚丙烯酰胺(PAG) 琼脂糖(Sepharose)

　　操作过程： 1.装柱; 2.离子交换; 3.洗脱

　　※带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。

　　三、操作注意点

　　(一)离子交换剂的选择 原则： 根据被分离物质的性质选择—同一性质离子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力差异大的型号交换剂

　　1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素

　　考虑因素：

　　根据分离过程的实验条件 强酸强碱—应用广泛 弱酸型—只能在碱性范围内使用 弱碱型—只能在酸性范围内使用

　　3.被分离物质所处的环境 4.被分离物质的物理化学性质 5.被分离物质的大概数量

　　原则： 不能发生化学反应，避免使样品变性

　　(二)缓冲液的选择

　　原则： 所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团 改变pH或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱

　　(三)洗脱剂

　　四、应用

　　分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的生物分子。

　　实验： 离子交换层析分离氨基酸

　　一、原理：

　　※Dowex50阳离子交换树脂

　　pH 4.2

　　pI 9.7 Mr 147

　　pI 2. 97 Mr 133

　　+

　　-

　　一、操作注意点：

　　1、装柱和加样同凝胶层析 2、洗脱液(NaOH和柠檬酸)别混淆 3、控制流速：20滴/min

　　指出2个洗脱峰分别出现在几号管? 分别是哪个氨基酸?

　　三、结果要求：