基因分析的基本策略.ppt

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　　正文： 从上世纪70年代以来，与DNA、RNA操作相关的各种分子生物学技术不断发展，到目前已经形成了一个庞大而复杂的技术体系。基因操作已成为医学研究的重要手段。简单地说，基因操作就是所有涉及到DNA、RNA操作的技术。 本章主要讨论如何对基因进行定性、定量分析;在随后的2章里分别介绍基因功能研究的技术和基因工程的有关内容。

　　第六章 基因分析的基本策略

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　　正文： 1、需要进行基因的DNA序列分析:序列测定 2、基因的染色体上定位：原位杂交技术 3、研究基因在基因组中的拷贝数：Southern Blot 4、研究基因表达水平：Northern Blot、逆转录实时PCR技术 5、研究基因表达产物的水平：Western Blot、流式细胞仪( FACS )

　　对一个已知或未知基因的内容进行研究步骤：

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　　第一节 利用DNA定性、定量分析可从不同角度 对基因和基因组进行研究

　　一、DNA序列测定可以揭示基因和基因组一级结构变化

　　DNA测序技术： 1、双脱氧链终止法(Sanger法) 2、化学裂解法 3、PCR测序技术 4、全自动DNA测序仪 这些技术的发明,都依赖于高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术

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　　正文： Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸(2ˊ,3ˊ-ddNTP)作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核糖的3ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷酸链的延伸终止。如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP，则多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将分别终止于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸链进行高分辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。

　　双脱氧测序方法原理

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　　正文： 基本步骤： 1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素(32P、35S)， 2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、不完全的化学修饰; 3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断开DNA链; 4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开 5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况，直接读出DNA序列。

　　化学裂解法(Maxam-Gilbert) 1977

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　　反应体系 碱基修饰 碱基修饰 主链断裂 断裂点 试剂 反应 试剂 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G/A C+T 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 C/T C 肼(加盐) 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C

　　在化学修饰反应中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰，随后进行断裂反应也是定量。

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　　5`-GATCACTACTG-3`

　　5`*-

　　GATCACTACTG-3`

　　5`*G

　　5`* GATCACTACTG

　　5`*G

　　5`*GA

　　5`*GATCA

　　5`*GATCACTA

　　5`*GATCACTACTG

　　5`*GAT

　　5`*GATC

　　5`*GATCAC

　　5`*GATCACT

　　5`*GATCACTAC

　　5`*GATCACTACT

　　5`*GATC

　　5`*GATCAC

　　5`*GATCACTAC

　　G

　　G+A

　　C+T

　　C

　　G A/G C/T C

　　5`*G

　　5`*GA

　　5`*GAT

　　5`*GATC

　　5`*GATCAC

　　5`*GATCACTAC

　　5`*GATCA

　　5`*GATCACT

　　5`*GATCACTA

　　5`*GATCACTAC

　　5`*GATCACTACT

　　5`* GATCACTACTG

　　硫酸二甲酯

　　甲酸

　　肼

　　肼(加盐)

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　　DNA自动测序仪

　　上述两种方法都不适应大规模DNA测定需要。存在操作步骤繁琐、效率低、速度慢的缺点，特别是读结果的读片过程。 1987年发明了一种准确快速的DNA测序方法，即激光测序法和配套的自动测序仪。(用荧光染料结合引物)。随后又发明了终止标记系统法。

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　　正文： 1、揭示基因和基因组一级结构变化在医学研究中具有重要意义。 2、通过DNA序列分析，可以鉴定基因和基因组变异。 3、通过DNA序列分析，可以鉴定分析人工重组的基因。 4、通过DNA序列测定对定点突变进行确认。

　　DNA序列测定的意义

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　　分析基因拷贝数变化

　　一、Southern blot 检测基因拷贝数变化

　　Southern blot 印迹杂交是指DNA与DNA的杂交，将电泳分离的待测DNA片段转印并结合到一定的固定支持物上，然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。 1975年英国爱丁堡大学的Southern建立了该方法， Southern印迹杂交由此得名。

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　　Southern blot步骤

　　(1)待测核酸样品的制备：提取基因组DNA，并用适当的限制性内切酶消化水解基因组DNA，成大小不一的DNA片段。 (2)待测DNA样品的电泳分离。 (3)凝胶中核酸的变性：DNA在制备与电泳过程中DNA片段始终保持双链结构。电泳结束后DNA变性并转移到适当的固定支持物上才能进行Southern blot。 变性通常用碱变性法。

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　　正文： (4) Southern 转膜：将凝胶中的DNA进行碱变性并将PH恢复中性后，即可将凝胶中DNA转移到固定支持物上。 固定支持物：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜、化学活化膜和滤纸等。 转移方法：毛吸管虹吸印迹法、电转印迹法、真空转移法。 (5)已知序列的DNA探针的制备

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　　正文： (6) Southern杂交：在将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能够结合DNA的膜同样可以和探针DNA结合，在进行杂交实验前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。 (7)杂交结果的检测：采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交时，在杂交洗膜后，将滤膜和X线片装入暗盒，感光后，经冲洗，在X线片上可见黑色条带。

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　　正文： 1、对某种生物体基因组拷贝数研究，需要完整提取出基因组，并需要适当的限制性内切酶酶切; 2、通常要研究的基因序列是已知的。

　　Southern blot 检测基因拷贝数注意事项

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　　二、采用PCR技术也可以分析基因拷贝数

　　原理： 细胞内DNA复制是一个复杂过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，PCR原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对简单。 PCR反应体系： 耐热的Taq DNA聚合酶、化学合成的寡聚核苷酸引物、4种dNTP、以及合适的缓冲液体系。 PCR反应的基本过程：变性、退火、延伸

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　　PCR技术对扩增的模板浓度虽然很低，扩增产量以一个恒定的指数率上升，但经过25至30个循环，产量会达到一个平台期，同时PCR过程中，还会出现“试管效应”，因些对不同样本量的比较无法直接用PCR技术来鉴定。 近年来，随着PCR技术的不断改进，如差异显示PCR和实时PCR的发明，可以用于基因拷贝数的分析。

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　　正文： 是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾(polyA)结构，因此可用含oligo(dT)的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。 根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物;同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。 将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。

　　(1)差异显示PCR用于基因拷贝数分析

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　　正文： 尽管应用?差异显示PCR方法已经取得了不少成果，而且该方法还在不断改进之中，但它仍然存在几个难以解决的问题：但它仍然存在几个难以解决的问题：(1)重复率低，至少有20%的差异条带不能被准确重复;(2)假阳性率可以高达90%;(3)获得的差异表达序列极少包含编码信息。

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　　(2)、代表性差异分析技术

　　该技术是将差减杂交与PCR有机结合形成的一种方法.主要步骤: 1、将对照组(driver)和待测组(tester)mRNA逆转录成cDNA片段群,接上接头进行第一次PCR扩增; 2、将两组PCR产物片段群用限制性内切酶酶切,形成平均长度256bp的长度. 3、将接头消化,在tester组末端接上新的接头,tester组和driver组按1:100比例混合.过量的driver可与tester中互补的部分形成双链. 4\复性,按新接头序列设计引物进行第2轮PCR，只有tester和tester杂合体才能和引物配对,大量拉增.

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　　正文： 实时PCR根据PCR反应动力学特点设计的分析方法。在PCR反应的初始阶段，反应体系中的模板的产物深度较低，而引物是过量的，产物和模板复性不会形成与引物竞争，此时产物含量呈指数增加。当PCR产物积累后，产物的复性可以竞争引物与模板的结合，产物增加减慢，最后进入平台期。所以对样品中的cDNA进行定量分析的最佳时期是反应早期。有人试图依靠循环次数减少来分析样品中的cDNA含量，但因样品的差异使之很不可靠。在一定的循环中，mRNA丰度低的样品产量少，可能尚不能检测，丰度高的样品可能已进入平台期，故难以较。

　　(3)实时PCR用于基因拷贝数分析

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　　正文： 实时PCR原理是：在PCR反应体系中加入一种双色荧光标记的寡核苷酸探针，并根据探针上荧光信号的变化计算模板DNA含量。如：TaqMan系统 在寡核苷酸探针的5`端标记一个报告荧光染料，3`端标记一个猝灭染料。当光源照射到探针时，被激活的报告荧光染料将能量转移给附近的猝灭染料而不发光。当PCR产物扩增时，聚合酶遇到结合在模板上的荧光探针时，利用聚合酶所具有的5`-3`外切酶作用，将两种染料分离，因此根据报告荧光所发射的荧光强度与被切探针成正比，由此可以计算出PCR产物的含量。

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　　正文： 实时PCR技术特别适合于低拷贝基因的定量。 实时PCR需要包括热循环仪、计算机、光学仪器用于荧光激发和收集器、数据处理和分析软件。

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　　正文： 核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 原位杂交不需要从组织提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可完整保持组织与细胞形态，更能准确反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

　　三、原位杂交技术可以分析基因在染色体上位置

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　　正文： 根据检测对象不同可将原位杂交分为细胞内原位杂交和组织切片原位杂交。同时原位杂交既可检测DNA，也可检测RNA，所用探针不同而以。 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。放射性同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，非放射性探针可以用生物素、地高辛 、荧光素标记探针。

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　　正文： (一)、固定：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平;使探针易于进入细胞或组织。最常用的固定剂是多聚甲醛，其它的固定剂(如戊二醛)。 (二)、玻片和组织切片的处理：包括玻片处理、细胞组织切片的处理、降低背景、预杂交。 (三)杂交：调整探针的浓度(0.5～5.0ng/μl) 、探针长度(50～100个碱基)、杂交的温度和时间 (四)杂交后处理：包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。 (五)显示：根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。 (六)结果分析

　　(Gp:) 基本方法

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　　正文： 真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、dsRNA、微小RNA等。目前在上述RNA研究中，以mRNA研究最为热点。它的研究可以提示基因的结构、基因的活性、或基因的变异等。 mRNA研究常用的方法有Northern blot、原位杂交、实时PCR、RNA酶保护试验、cDNA芯片技术和RT-PCR。

　　第二节 利用RNA定性定量分析可从不 同角度揭示基因表达活性

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　　正文： Northern blot印迹杂交是指待测RNA样品经电泳分离后转移到固定支持物上，然后与标记的核酸探针进行固-液相杂交。原理同Southern blot。 但因Northern blot印迹杂交法检测的是RNA，在外界环境中极易被环境中的RNA酶所降解，因此制备RNA样品时，所需器皿均需要特殊处理。同时作为监测细胞内RNA含量不够准确，只能作为定性分析RNA方法。

　　(一)Northern blot定性分析RNA的常用方法

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　　正文： RT-PCR是一种以mRNA为模板的体外扩增cDNA的技术。其基本程序是：提取细胞总RNA，然后将其中的mRNA在体外逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，进行特定基因的PCR扩增。因为PCR扩增产物有平台效应，故RT-PCR也一般用于RNA的定性分析。 但如果将阳性参照基因作为内参照与待测RNA在一个反应体系中进行扩增，可以对RNA进行相对定量分析。参照基因： β -肌动蛋白(β-actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶、rRNA基因等。

　　(二)RT-PCR用于定性、定量分析RNA方法

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　　三、RNA酶保护试验—了解基因转录后的选择性剪接

　　RNA酶保护试验是利用Rnase A和Rnase T1能专一的降解单链RNA而双链RNA受到保护的特性，用体外转录合成的放射性核素标记的RNA探针与待检测mRNA进行液相杂交，使RNA探针和待测RNA间在互补序列处形成杂交体，然后用Rnase A和Rnase T1切割此RNA杂交体，受到保护的RNA通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，从而估计待检测mRNA情况。 RNA酶保护试验：可用于①mRNA定量、 ② mRNA末端定位、 ③ mRNA剪切部位④确定内含子在相应基因中的位置。

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　　标题： RNA酶保护试验：全新的mRNA定量分析方法

　　正文： 其基本原理是将标记的特异RNA探针(32P或生物素)与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA;未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶保护实验。

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　　正文： 监测大量基因表达的最好方法之一是cDNA微阵列技术，利用这种技术可以同时测定成千上万个基因的转录活性。 cDNA微阵列技术的基本原理与核酸分子杂交方法是一样的。都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性或定量分析基因的表达情况。利用cDNA微阵列能在同一时间内平行分析大量的基因转录产物，进行大量的信息筛选和检测分析。

　　三、 cDNA微阵列( cDNA芯片)可同时分析大量 基因的转录活性

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　　正文： 目前研究蛋白质的技术一般多采用免疫印记技术(Western blot)或免疫组化染色对蛋白质进行分析。目前在1、研究转基因的活性。2、研究克隆基因的表达。上必须选用蛋白质技术对基因的表达活性进行分析。

　　第三节 利用蛋白质的定性定量定位 分析揭示基因的表达活性

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　　正文： Western blot是一种免疫印记技术，其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。 基本过程：蛋白质样品制备和SDS-PAGE分离; 蛋白质的转膜; 标记的抗体与膜上蛋白质的抗原抗体杂交; 检测并分析标记物信号。

　　(一) Western blot可对细胞总蛋白中的 特定基因产物进行鉴定

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　　正文： 流式细胞术也称为荧光激活细胞分拣技术。是一种快速定量分析细胞的新技术。其基本原理也是抗原抗体的特异结合，但抗原一般位于活细胞表面或内部的蛋白质分子，用荧光标记的抗体与抗原结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，从而根据其信号的强弱，来判断细胞内某基因的表达活性。 对转染细胞的外源基因表达情况也可以采用此法。

　　二、流式细胞术可在细胞水平上分析特定蛋白质

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　　正文： 免疫组化其基本原理是利用显色剂标记的特异抗体在组织或细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学显色反应检测特定抗原。 免疫组化将免疫反应的特异性、组织化学的可见性和显微镜的显像和放大作用巧妙地结合起来，成为蛋白质水平分析基因的直观特异的方法之一。

　　(三)免疫组化方法可对细胞内或组织中的特定基因 表达产物进行定性和半定量分析