酶联免疫反应.ppt

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　　标题： 酶联免疫反应

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　　标题： 概述

　　正文： 免疫分析：是以抗原抗体相互结合的免疫反应为基础，研究免疫学技术及其在医学领域中的应用。

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　　正文： 免疫分析的分类 根据分析过程中是否需要标记物可分为两类 一、标记免疫分析：根据标记物的种类可分为 1、酶免疫分析 2、放射免疫分析 3、发光免疫分析 4、荧光免疫分析 5、金(银)免疫标记分析

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　　正文： 二、非标记免疫分析： 免疫沉淀实验、免疫浊度分析技术

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　　正文： 一、酶免疫分析：是利用酶的高效催化和放大作用与特异性免疫反应结合而建立的一种标记免疫技术。 原理： 用酶标记的抗原(或抗体)用于免疫反应，并以相应的底物被酶分解的显色反应对样品中的抗体(或抗原)进行定位的分析和鉴定。

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　　正文： 根据是否需要分离结合与游离的酶标记物可分为可分为非均相(或异相)酶免疫测定和均相酶免疫测定两种方法 。 均相酶免疫分析法(homogeneous enzyme immunoassay，HEI)是在检测过程中抗原抗体反应后，无需分离结合和游离酶标记物，直接根据反应前后酶活性的改变进行待测物质的测定的分析方法。 均相酶免疫分析主要有酶扩大免疫测定技术和克隆酶供体免疫测定两种方法。

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　　正文： 均相酶免测定的对象为小分子抗原或半抗原，主要用于药物测定。可以直接用于全自动生化分析仪测定。

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　　正文： 非均相酶免疫分析法(heterogeneous enzyme immunoassay) 常用的酶免疫分析法多为非均相法，又可分为液相酶免疫法和固相酶免疫法两种，以后者最常用，称为酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。ELISA是临床上最常用的免疫分析方法。需经过结合的标记物和游离的标记物的分离才能测定. 分离的方法主要通过固相载体吸附后清洗未结合的游离标记物。

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　　正文： ELISA既可以测定抗原，也可以测定抗体。根据测定对象不同，可采用不同的模式，主要有双抗夹心法、间接法和竞争法等。

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　　(Gp:) 一、ELISA简介

　　(Gp:) 二、ELISA原理

　　(Gp:) 三、ELISA分类

　　(Gp:) 四、ELISA相关试剂

　　(Gp:) 五、ELISA影响因素

　　(Gp:) 六、ELISA应用

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　　标题： 一、ELISA简介

　　1971年瑞典学者 Engvall和Perlmann，荷兰学者Van Weeman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA)。 自上世纪70年代初问世以来， ELISA发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

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　　二、ELISA原理

　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的 量直接相关，故可根据呈色的深浅进行 定性或定量分析。

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　　(Gp:) Y

　　(Gp:) Y

　　①固相的抗原或抗体(免疫吸附剂)

　　②酶标记的抗原或抗体(标记物)

　　③酶作用的底物(显色剂)

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　　加样本

　　微量反应孔

　　包被好的抗体

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　　振荡、洗板

　　待测项目(抗原)

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　　加入酶标记得抗原

　　(Gp:) V

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　　(Gp:) V

　　(Gp:) 酶标 记 物

　　(Gp:) 轻链

　　螯合剂

　　辣根过氧化物酶

　　重链

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　　振荡、洗板

　　(Gp:) V

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　　加入底物显色液

　　H

　　H

　　H

　　H

　　H

　　H

　　H

　　H

　　H

　　H

　　H

　　H

　　H

　　H

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　　(Gp:) 免疫标记技术

　　(Gp:) 放射物标记技术

　　(Gp:) 酶标技术

　　(Gp:) 免疫荧光技术

　　(Gp:) 其他标记技术

　　(Gp:) 酶联免疫吸附技术

　　(Gp:) 酶免疫组化技术

　　(Gp:) 双抗体夹心法

　　(Gp:) 竞 争 法

　　(Gp:) 双抗原夹心法

　　(Gp:) 间 接 法

　　三、ELISA分类

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　　双抗体夹心法

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　　竞争法

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　　间接法

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　　标题： ELISA基本实验过程

　　其他占位符： 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色

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　　标题： 实验中对照的设置

　　其他占位符： 阳性对照 阴性对照 空白对照 临界标准品

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　　标题： ELISA试剂

　　其他占位符： (1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂); (2)酶标记的抗原或抗体(结合物); (3)酶的底物; (4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中)，参考标准品和控制血清(定量测定中); (5)结合物及标本的稀释液; (6)洗涤液; (7)酶反应终止液。

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　　标题： 固相抗原或抗体

　　其他占位符： 1、固相载体的性状 固相载体在ELISA 测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。 ELISA 载体的形状主要有：膜(NC膜、PVDF膜、尼龙膜)、微量滴定板(96孔板)、小珠和小试管，以微量滴定板(96孔板)最为常用。 良好的ELISA 用96孔板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。 2、包被用抗原 用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 3、包被条件

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　　标题： 酶标记的抗原或抗体(结合物)

　　其他占位符： 1、酶 用于ELISA 的酶应符合以下要求： (1)纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵; (2)制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力; (3)在受检标本中不存在相同的酶; (4)相应底物易于制备和保存，价格低廉; (5)有色产物易于测定，光吸收高。 常用的酶为辣根过氧化物(horseradish peroxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase，AP)。

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　　标题： 酶的底物

　　其他占位符： 1、HRP 的底物 HRP 催化过氧化物的氧化反应，常用的供氢体有邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。 TMB 经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB 性质较稳定，可配成溶液试剂，无致癌性等优点。酶反应用HCl或H2SO4 终止后，TMB 产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量， 2、 AP 的底物 AP 为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p‐NPP)作为底物。 产物为黄色的对硝基酚，用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。 NBT/BCIP，紫色反应，水冲洗终止反应。

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　　标题：

　　其他占位符： 试剂因素 标本因素 实验原理或操作方法 环境因素

　　五、ELISA影响因素

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　　其他占位符： ● 抗原抗体的纯度 ● 标准品定值的准确性 ● 抗体的亲和力、滴度和特异性 ● 标记物的比活性或免疫活性

　　试 剂 因 素

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　　标题：

　　其他占位符： 内源性物质常见的有: 类风湿因子(RF)、嗜异性抗体(Id)、补体、人抗动物抗体(HAAA)、药物及其导致的代谢产物和交叉反应物质等。 外源性物质主要为：标本溶血、标本细菌污染、标本储存时间过长、标本凝集不全和采血管中含有添加剂等。 自身免疫产品：胆红素浓度小于0.05mg/mL的黄疸，血红蛋白浓度小于5.0mg/mL的溶血和甘油三酯浓度小于25.0mg/mL的脂血对检测结果没有影响。

　　标 本 因 素

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　　其他占位符： 钩状效应(HOOK效应)及交叉反应现象 颜色终止条件 ELISA实验终止剂选用引起的持续发展的颜色加深影响了阴性和弱阳性样品及定量检测样品的结果, 特别在大批样品需较长时间进行读数时, 这种潜在的颜色逐渐加深现象成为结果影响的重要因素。 ELISA的洗板过程 洗液冲力过大会造成酶结合物丢失, 本底偏浅, 吸光度值偏低, 且洗板后残留液规定一般不超过2ul。

　　实验原理或操作方法

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　　其他占位符： 通风、采光与防尘。 控制温度及湿度, 环境温度与湿度随地理位置不同可有很大差异应使用系统空调进行控温, 并要求控制空气湿度为40%～70%之间 消除噪音与电磁干扰。 稳定水电, 实验过程中应采用蒸馏水(纯水) 或经软化处理的自来水。

　　环 境 因 素

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　　标题： 六、ELISA应用

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　　饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定(主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素 ) 饲料中有害微生物的快速筛检 (如沙门氏菌 )

　　甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析

　　ELISA在饲料安全检测中的应用

　　ELISA用于农药残留的检测

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　　河豚毒素

　　植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素

　　苯并芘

　　主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松( FN )、 甲氟磷酸异已酶( SOMAN )、 草不绿( Alachor )、 西维因( Carbaryl )、 多菌灵及克菌丹( Captan )等。

　　农药的检测

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　　ELISA检测 “非典型肺炎”冠状病毒

　　ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2(hnRNPA2)/类风湿性关节炎(PtA)33抗体

　　ELISA在疾病诊断中的作用

　　ELISA法检测幽门螺杆菌抗体