第十一章 RNA的生物合成（转录）.ppt

　　第 十 一 章

　　RNA的生物合成 (转录) RNA Biosynthesis, Transcription

　　转录 (transcription) 生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。

　　转录

　　(Gp:) RNA

　　(Gp:) DNA

　　转录与复制的相同点

　　都是酶促的核苷酸聚合反应 都以DNA 为模板 都需要依赖DNA的聚合酶 聚合的过程都是磷酸二酯键形成的过程 聚合方向(新链延长方向)都是：5’ ? 3’ 都遵循碱基配对规律

　　复制和转录的区别

　　参与转录的物质

　　原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA 酶: RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-pol) 其他蛋白质因子

　　模板和酶 Templates and Enzymes

　　第一节

　　一、转录模板

　　结构基因：DNA分子上转录出RNA的区段。

　　5′···GCAGTACATGTC ···3′

　　3′··· c g t g a t g t a c a g ···5′

　　5′···GCAGUACAUGUC ···3′

　　N······Ala · Val · His · Val ······C

　　编码链

　　模板链

　　mRNA

　　蛋白质

　　转录

　　翻译

　　DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作有意义链或Watson链。 相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为反义链或Crick链。

　　不对称转录(asymmetric transcription)

　　在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录 ; 模板链并非永远在同一条单链上。

　　5? 3?

　　3? 5?

　　模板链

　　编码链

　　编码链

　　模板链

　　结构基因

　　(Gp:) 转录方向

　　(Gp:) 转录方向

　　二、RNA聚合酶 (RNA-pol)

　　(一)原核生物的RNA聚合酶

　　DNA dependent RNA polymerase (DDRP)

　　核心酶 (core enzyme)

　　全酶 (holoenzyme)

　　(Gp:) ??

　　(Gp:) ?

　　(Gp:) ?

　　(Gp:) ?

　　(Gp:) ?

　　(Gp:) ??

　　(Gp:) ?

　　(Gp:) ?

　　(Gp:) ?

　　?亚基的功能：辨认转录的起始点 核心酶可以进行转录，但不能在特定的起始点上开始转录。

　　RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合

　　原核生物的RNA聚合酶都受一类结核菌药物利福平或利福霉素的特异性抑制

　　?亚基

　　目前发现多种?因子 常规基因表达采用的是?70(分子量70kD) 热休克反应： 细菌中: 当细菌受到热应激，则由?32启动另一套转录，所生成的产物称为热休克蛋白(Hsp)，Hsp编码的基因称为热休克基因(hsp) 真核生物中也存在热休克基因只是功能各异。

　　(二)真核生物的RNA聚合酶

　　RNA聚合酶II可认为是真核生物中最活跃的RNA聚合酶

　　三、模板上酶的辨认、结合

　　原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。

　　(Gp:) 5?3?

　　(Gp:) 3?5?

　　(Gp:) 结构基因

　　(Gp:) 调控序列

　　(Gp:) RNA-pol

　　启动子(promoter)：RNA聚合酶结合模板DNA的部位

　　RNA聚合酶保护法

　　开始转录

　　T T G A C A A A C T G T

　　-35 区

　　(Pribnow box)

　　T A T A A T Pu A T A T T A Py

　　-10 区

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) -30

　　(Gp:) -50

　　(Gp:) 10

　　(Gp:) -10

　　(Gp:) -40

　　(Gp:) -20

　　(Gp:) 5 ? 3 ?

　　(Gp:) 3 ? 5 ?

　　原核生物启动子保守序列

　　RNA-pol辨认位点 (recognition site)

　　(Gp:) 5?

　　(Gp:) 5?

　　(Gp:) RNA聚合酶保护区

　　(Gp:) 结构基因

　　(Gp:) 3?

　　(Gp:) 3?

　　(Gp:) TATA盒

　　(Gp:) CAAT盒

　　(Gp:) GC盒

　　(Gp:) 增强子

　　(Gp:) 顺式作用元件

　　结构基因

　　-GCGC---CAAT---TATA

　　(Gp:) 转录起始

　　真核生物启动子保守序列

　　转录过程 The Process of Transcription

　　第二节

　　(一)转录起始

　　转录起始需解决两个问题： RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。 DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。

　　一、原核生物的转录过程

　　2. DNA双链解开

　　1. RNA聚合酶全酶(?2????)与模板结合

　　(Gp:) RNApol (?2????) - DNA - pppGpN- OH 3?

　　(Gp:) 转录起始复合物:

　　(Gp:) 3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物

　　(Gp:) 5?-pppG -OH + NTP ? 5?-pppGpN - OH 3? + ppi

　　转录起始过程

　　(二)转录延长

　　1. ?亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移;

　　2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。

　　(NMP) n + NTP ?? (NMP) n+1 + PPi

　　转录空泡(transcription bubble)：

　　RNA-pol (核心酶) ···· DNA ···· RNA

　　5?

　　3?

　　DNA

　　原核生物转录过程中的羽毛状现象

　　核糖体

　　RNA

　　RNA聚合酶

　　依赖Rho (ρ)因子的转录终止 非依赖Rho因子的转录终止

　　(三)转录终止

　　指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。

　　分类

　　A T P

　　1. 依赖 Rho因子的转录终止

　　Rho因子对RNA上的poly C 结合能力强 Rho因子有ATP酶活性和解螺旋酶活性

　　与RNA转录产物结合，使得Rho因子和RNA聚合酶都可发生构象变化，从而使RNA 聚合酶停顿，解螺旋酶活性使得DNA/RNA杂化双链拆离，利于产物从转录复合物中释放

　　Rho因子转录终止的作用：

　　2. 非依赖 Rho因子的转录终止

　　DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。

　　5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3`

　　5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3`

　　RNA

　　5?TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT... 3?

　　DNA

　　(Gp:) UUUU...…

　　(Gp:) UUUU...…

　　5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3`

　　茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构

　　使RNA聚合酶变构，转录停顿; DNA和RNA各自形成自己的局部双链，使杂化链更加不稳定，以致转录复合物趋于解体。 接着的一串寡聚U，则更是促进RNA新链从模板上脱落的促进因素。

　　(Gp:) 5′pppG

　　(Gp:) 5? 3?

　　(Gp:) 3?5?

　　(Gp:) RNA-pol

　　茎环结构使转录终止的机理

　　二、真核生物的转录起始

　　(一)转录起始

　　真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。

　　转录起始点

　　TATA盒

　　CAAT盒

　　GC盒

　　增强子

　　顺式作用元件(cis-acting element)

　　1. 转录起始前的上游区段

　　AATAAA

　　切离加尾

　　转录终止点

　　修饰点

　　外显子

　　翻译起始点

　　内含子

　　OCT-1

　　OCT-1：ATTTGCAT八聚体

　　2. 转录因子

　　能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。

　　反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。

　　参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ

　　3. 转录起始前复合物 (pre-initiation complex, PIC)

　　真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。

　　(Gp:) POL-Ⅱ

　　TFⅡF

　　ⅡA

　　ⅡB

　　由RNA-Pol Ⅱ催化转录的PIC

　　(Gp:) POL-Ⅱ

　　(Gp:) TFⅡF

　　ⅡH

　　ⅡE

　　TBP

　　TAF

　　TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合物

　　TATA

　　ⅡA

　　ⅡB

　　TBP

　　TAF

　　TATA

　　ⅡH

　　ⅡE

　　(Gp:) CTD-

　　(Gp:) P

　　PIC组装完成，TFⅡH使CTD磷酸化

　　4. 拼板理论(piecing theory)

　　一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。

　　(二)转录延长

　　真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。

　　RNA-pol前移处处都遇上核小体。

　　转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。

　　RNA-Pol

　　RNA-Pol

　　RNA-Pol

　　核小体

　　转录延长中的核小体移位

　　转录方向

　　(三)转录终止

　　—— 和转录后修饰密切相关。

　　真核生物mRNA带有聚腺苷酸尾巴的结构，这是转录之后加上的。 在模板链读码框架的3’端之后，常有一组共同序列AATAAA，再下游还有相当多的GT序列，这些序列称为转录终止的修饰点。

　　5?------AAUAAA-

　　5? ------AAUAAA--

　　核酸酶

　　-GUGUGUG

　　RNA-pol

　　AATAAA GTGTGTG

　　转录终止的修饰点

　　5?

　　5?

　　3?

　　3?

　　3?加尾

　　AAAAAAA······ 3? mRNA

　　真核生物的转录后修饰 Post-transcriptional Modification

　　第三节

　　几种主要的修饰方式

　　1. 剪接(splicing)

　　2. 剪切(cleavage)

　　3. 修饰(modification)

　　4. 添加(addition)

　　一、真核生物mRNA的转录后加工

　　(一)首、尾的修饰

　　5?端形成 帽子结构(m7GpppGp —) 3?端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail)

　　帽子结构

　　5? pppGp…

　　(Gp:) 5? GpppGp…

　　(Gp:) pppG

　　(Gp:) ppi

　　(Gp:) 鸟苷酸转移酶

　　(Gp:) 5? m7GpppGp…

　　(Gp:) 甲基转移酶

　　(Gp:) SAM

　　帽子结构的生成

　　(Gp:) 5? ppGp…

　　(Gp:) 磷酸酶

　　(Gp:) Pi

　　加工过程首先是在磷酸酶的作用下，将5‘-端的磷酸基水解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G进行甲基化 加帽出现在hnRNA中，说明可能在细胞核中完成，并在剪接之前。

　　真核生物mRNA中poly A的出现是不依赖于DNA模板的。 加入poly A之前，先由核酸外切酶切去3’末端一些过剩的核苷酸，然后加入polyA。 3‘’端修饰也是在细胞核中，在剪接之前进行的。 Poly A的有无与长短，是维持mRNA作为翻译模板的活性，以及增加mRNA本身的稳定性。

　　加尾(adding tail)：

　　3’端修饰示意图

　　真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。

　　断裂基因(splite gene)

　　(Gp:) C

　　(Gp:) A

　　(Gp:) B

　　(Gp:) D

　　编码区 A、B、C、D

　　(Gp:) 非编码区

　　(二)mRNA的剪接

　　1. hnRNA 和 snRNA

　　核内的初级mRNA称为杂化核RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA) snRNA (small nuclear RNA)核内小RNA

　　(Gp:) 核内的蛋白质

　　(Gp:) 小分子核糖核酸蛋白体 (并接体, splicesome)

　　(Gp:) snRNA

　　—— hnRNA 剪接的场所

　　2. 外显子(exon)和内含子(intron)

　　外显子 在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。 内含子 隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。

　　鸡卵清蛋白基因

　　hnRNA

　　首、尾修饰

　　hnRNA剪接

　　成熟的mRNA

　　鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰

　　鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图

　　DNA

　　mRNA

　　3. 内含子的分类

　　根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。

　　I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA基因; II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA; III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子; IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。

　　4. mRNA的剪接

　　—— 除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。

　　snRNP与hnRNA结合成为并接体

　　①

　　②

　　③

　　(Gp:) UACUACA - AG

　　(Gp:) UG

　　(Gp:) U4

　　(Gp:) U5

　　(Gp:) U6

　　(Gp:) E1

　　(Gp:) E2

　　(Gp:) U1

　　(Gp:) U2

　　(Gp:) UACUACA - AG

　　(Gp:) UG

　　(Gp:) U6

　　(Gp:) E1

　　(Gp:) E2

　　(Gp:) U1、U4、U5

　　pG-OH (ppG-OH, pppG-OH)

　　(Gp:) U-OH

　　(Gp:) GpU

　　(Gp:) pGpA

　　(Gp:) 第一次转酯反应

　　(Gp:) 第二次转酯反应

　　(Gp:) UpA

　　(Gp:) GpU

　　(Gp:) 外显子1

　　(Gp:) 内含子

　　(Gp:) 外显子2

　　(Gp:) G-OH

　　(Gp:) UpU

　　(Gp:) pGpA

　　剪接过程的二次转酯反应

　　? RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。

　　5. mRNA的编辑(mRNA editing)

　　(Gp:) 人类apo B基因

　　(Gp:) mRNA(14500个核苷酸)

　　(Gp:) 肝脏 apo B100 (分子量为500000)

　　(Gp:) 肠道细胞 apo B48 (分子量为240000)

　　(Gp:) mRNA编辑

　　二、tRNA的转录后加工

　　tRNA前体

　　(Gp:) RNA pol Ⅲ

　　(Gp:) TGGCNNAGTGC

　　(Gp:) GGTTCGANNCC

　　(Gp:) DNA

　　(Gp:) RNAaseP、内切酶

　　tRNA核苷酸转移酶、连接酶

　　ATP

　　ADP

　　碱基修饰

　　(Gp:) (2)还原反应

　　(Gp:) 如：U ? DHU

　　(Gp:) (3)核苷内的转位反应

　　(Gp:) 如：U ? ψ

　　(Gp:) (4)脱氨反应

　　(Gp:) 如：A ? I

　　(Gp:) 如：A ? Am

　　(Gp:) (1)甲基化

　　(Gp:) (1)

　　(Gp:) (1)

　　(Gp:) (3)

　　(Gp:) (2)

　　(Gp:) (4)

　　丰富基因：染色体上一些相似或完全一样的纵列串联基因单位的重复。 真核细胞的rRNA基因属于丰富基因。 45s的转录产物是三种rRNA的前体，经过剪接后形成核糖体小亚基的18S rRNA，其余形成5.8S及28S的rRNA。

　　三、rRNA的转录后加工

　　(Gp:) 转录

　　(Gp:) 45S - rRNA

　　(Gp:) 剪接

　　(Gp:) 18S - rRNA

　　(Gp:) 5.8S和28S-rRNA

　　(Gp:) rDNA

　　(Gp:) 内含子

　　(Gp:) 内含子

　　(Gp:) 28S

　　(Gp:) 5.8S

　　(Gp:) 18S

　　基因间隔

　　四、核 酶

　　具有酶促活性的RNA称为核酶。

　　核酶(ribozyme)

　　四膜虫rRNA内含子的二级结构

　　四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式

　　5′-端核苷酸序列

　　最简单的核酶二级结构——槌头状结构 (hammerhead structure)

　　底物部分

　　通常为60个核苷酸左右 同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份组成锤头结构

　　除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。

　　核酶研究的意义

　　核酶的发现，对中心法则作了重要补充; 核酶的发现是对传统酶学的挑战; 利用核酶的结构设计合成人工核酶 。