第十一章 核酸化学及其生物合成.ppt

　　第十一章 核酸化学及其生物合成

　　第十一章 核酸化学及其生物合成

　　第一节 核酸化学 第二节 DNA的生物合成 第三节 RNA的生物合成

　　第一节 核酸化学

　　一、核酸的化学组成 二、DNA的结构和功能 三、RNA的结构和功能 四、核酸的理化性质 五、核酸变性与分子杂交 六、核酸酶

　　一、核酸的化学组成

　　(一)核酸的分类 (二)核酸的化学组成

　　(一)核酸的分类

　　核酸是存在于细胞中的一类大分子酸性物质，包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。 RNA和DNA都是以单核苷酸为基本单位所组成的多核苷酸长链。 RNA主要参与遗传信息的表达，而DNA则是遗传信息的载体。

　　(二)核酸的化学组成

　　1. 核酸的元素组成 2. 核酸的结构组成

　　核酸的元素组成

　　组成核酸的元素有C、H、O、N、P等 与蛋白质比较，核酸组成有两个特点 一是核酸一般不含元素S， 二是核酸中P元素的含量较多并且恒定，约占9～10%。 核酸定量测定的经典方法，是以测定P含量来代表核酸量。

　　核酸的结构组成

　　核酸的水解产物如下：

　　①

　　②

　　③

　　④

　　⑤

　　碱 基

　　核苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物，它们分别属于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。 碱基异构 稀有碱基 碱基的紫外吸收 碱基的表示：用单子母表示

　　嘌呤碱

　　腺嘌呤 鸟嘌呤

　　核苷酸中的嘌呤碱(purine)主要是鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤(adenine,A)

　　嘧啶碱

　　尿嘧啶 胞嘧啶 胸腺嘧啶

　　嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶(cytosine，C)、尿嘧啶(uracil，U)、胸腺嘧啶(thymine，T)

　　DNA和RNA都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C);胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于DNA中，不存在于RNA中;而尿嘧啶(U)只存在于RNA中，不存在于DNA中。

　　碱基异构

　　核苷酸中五种碱基的酮基和氨基，均位于碱基环中氮原子的邻位，可发生酮式一烯醇式或氨基-亚氨基之间的结构互变。这种互变异构在基因的突变和生物的进化中具有重要作用。

　　稀有碱基

　　稀有碱基(或修饰碱基)，是在核酸合成以后由常见嘌呤碱或嘧啶碱在不同部位进行甲基化或其它的化学基团酶促修饰衍生而成的，一般在核酸中的含量稀少，在各种类型核酸中的分布也不均一。 DNA中的修饰碱基如5-甲基胞嘧啶(m5C)，5-羟甲基胞嘧啶(hm5C); RNA中以tRNA含修饰碱基最多，如1-甲基腺嘌呤(m1A)，7一甲基鸟嘌呤(m7G))和5，6-二氢尿嘧啶(DHU)等。

　　常见的几种稀有碱基

　　碱基的紫外吸收

　　嘌呤和嘧啶环中含有共轭双键，对260nm左右波长的紫外光有较强的吸收。碱基的这一特性常被用来对碱基、核苷、核苷酸和核酸进行定性和定量分析。

　　几种核苷酸的紫外吸收

　　戊 糖

　　核酸中的戊糖有核糖和脱氧核糖(2位的羟基被氢取代)两种，分别存在于核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸中。为了与碱基标号相区别，通常将戊糖的C原子编号都加上“′ ”。

　　β-D-核糖 β-D-2-脱氧核糖

　　核苷

　　核苷是由戊糖与含氮碱基经脱水缩合而生成的化合物。 大多数情况下，核苷是由核糖或脱氧核糖的C1’ β-羟基与嘧啶碱N1或嘌呤碱N9进行缩合，生成的化学键称为β，N糖苷键。 所以有四种核糖核苷和四种脱氧核糖核苷 用单字母表示，在脱氧时加d，如dA。 稀有核苷

　　腺苷(AR) 脱氧胞苷(dCR)

　　β1’,N9-糖苷键 β1’,N1-糖苷键

　　β1’

　　β1’

　　N9

　　N1

　　四种核糖核苷

　　“稀有核苷”是由“稀有碱基”所生成的核苷。当然也有例外，例如：

　　假尿苷(ψ) β1’,C5-糖苷键

　　β1’

　　C5

　　稀有核苷

　　核苷酸

　　核苷中戊糖的羟基与磷酸以磷酸酯键连接而成为核苷酸，包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两大类。 戊糖有2′、3′、5′位自由-OH，因此可以形成2′、3′、5′-核苷酸，生物体内的核苷酸大多数是5′-核苷酸( 5′常被省略 ) 核苷酸在5′位进一步磷酸化即生成二磷酸核苷和三磷酸核苷，表示为NMP、NDP、NTP，脱氧时加“d”，如ATP、dATP。 核苷酸总结

　　核苷酸总结图

　　核苷酸的分子结构

　　几种腺苷酸

　　核 酸

　　核酸的基本单位是核苷酸 寡核苷酸 核酸的表示方式

　　核酸的基本单位是核苷酸

　　核酸是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸，DNA是由四种脱氧核糖核苷酸聚合而成;RNA是由四种核糖核苷酸聚合而成 核苷酸之间的连接方式是：一个核苷酸的5′位磷酸与下一位核苷酸的3′-OH形成3′，5′磷酸二酯键 核酸是不分支的线性大分子，由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故又可称为碱基顺序 核酸是有方向性的分子，即两个末端( 3′末端和5′末端)不相同。

　　3′，5′-磷酸二酯键

　　多核苷酸链具有方向

　　寡核苷酸

　　寡核苷酸是指二至十个甚至更多个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段，可用作DNA合成的引物、基因探针等，在现代分子生物学研究中具有广泛的用途。

　　核酸的表示方法

　　一般约定，碱基序列的书写是由左向右书写，左侧是5′末端，右侧为3′末端

　　二、DNA的结构和功能

　　(一)DNA的结构 (二)DNA的分布 (三)DNA的功能

　　(一)DNA的结构

　　1. DNA的一级结构 2. DNA的双螺旋结构 (空间结构或二级结构) 3. 染色体的结构

　　1. DNA的一级结构

　　一级结构是指四种核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按照一定的排列顺序，通过磷酸二酯键连接形成的多核苷酸，即DNA分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序及连接方式，又称为碱基顺序。 遗传信息储存在DNA分子的碱基序中。生物的多样性和差异性就蕴藏于其一级结构的多样性和差异性，同一个体不同器官、不同组织的DNA具有相同的碱基顺序。

　　2. DNA的双螺旋结构

　　(1)DNA的双螺旋结构的概念 (2)DNA的双螺旋结构的研究 (3)DNA的双螺旋结构的依据 (4)DNA双螺旋结构模型的要点 (5)B型双螺旋DNA的结构特征 (6)其他类型的DNA双螺旋结构

　　(1)DNA的双螺旋结构的概念

　　DNA分子由2条反向平行(一条链为5’→ 3’，另一条链为 3’→ 5’) 的多聚脱氧核苷酸链围绕同一螺旋轴互相缠绕，形成的右手双螺旋。 DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式，它是Watson和Crick两位科学家于1953年提出来的一种结构模型。

　　(2)DNA的双螺旋结构的研究

　　Chargaff小组的研究 Wilkins小组的研究 Watson-Creck的DNA二级结构模型 的提出

　　Chargaff小组的研究

　　1950～1953，Chargaff研究小组对DNA的化学组成进行了研究，他们发现： ① DNA碱基组成有物种差异，且物种亲缘关系越远，差异越大; ② 相同物种，不同组织器官中DNA碱基组成相同，而且不因年龄、环境及营养而改变; ③ DNA分子中四种碱基的摩尔百分比具有一定的规律性，即A=T、G=C、A+G=T+C。这一规律被称为Chargaff原则。

　　Wilkins小组的研究

　　1953年由Wilkins研究小组完成的研究工作，发现了DNA晶体的X线衍射图谱中存在两种周期性反射，并证明DNA是一种螺旋构象。

　　Watson-Creck的DNA二级结构模型 的提出

　　美国Watson 、英国Creck，总结了前人的工作，在1953年5月的《Nature》上合作了一篇文章，第一次科学的提出了DNA二级结构模型 。

　　(3)DNA的双螺旋结构的依据

　　对DNA分子结晶的X衍射数据：由Franklin和Wilkins提供，来源不同的DNA的二级结构非常相似 Chargaff规则：A与T、G与C在任何DNA分子中的摩尔数都相等。 DNA是遗传物质，能够自我复制。 大量的电位滴定(探测H键的方法)和其它物化数据

　　(4)DNA双螺旋结构模型的要点

　　目前已知DNA双螺旋结构可分为A、B、C、D及Z型等数种，除Z型为左手双螺旋外，其余均为右手双螺旋。 Watson-Creck提出的DNA二级结构模型为B型

　　(5)B型双螺旋DNA的结构特征

　　①

　　②

　　③

　　④

　　右手双螺旋

　　基本参数

　　碱基互补配对

　　稳定双螺旋的作用力

　　(5)B型双螺旋DNA的结构特征

　　①DNA分子由2条反向平行(一条链为5’→ 3’，另一条链为 3’→ 5’) 的多聚脱氧核苷酸链围绕同一螺旋轴互相缠绕，形成右手双螺旋。

　　(5)B型双螺旋DNA的结构特征

　　②磷酸和脱氧核糖分布在分子外面形成DNA的骨架，戊糖平面平行于螺旋主轴，DNA的侧链基团是碱基，分布在分子内部，碱基平面垂直于螺旋轴，戊糖和嘌呤平面为反式结构。螺距34?，直径20?，10bp/圈。分子表面的一条宽沟称为大沟，一条窄沟叫小沟，复制和转录的有关酶附在大沟处。

　　(5)B型双螺旋DNA的结构特征

　　③两条链靠链间的H键结合，H键的产生符合碱基配对原则：A=T，G≡C 。这种特异的互补配对，对于DNA分子的性质及其功能非常重要。 ④稳定双螺旋的作用力 横向靠两条链间互补碱基的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持，尤其以碱基堆积力更为重要

　　碱基配对及氢键形成

　　碱基互补配对的参数

　　(6)其他类型的DNA双螺旋结构

　　A-DNA Z-DNA 3股右手螺旋模型 环状双链DNA模型

　　A-DNA

　　B-DNA脱去部分结晶水而形成的，属粗短型DNA，仍为右手双股螺旋，螺距25?，直径26?，11bp/圈，进一步脱水可形成C-DNA

　　Z-DNA

　　左手双股螺旋，人工合成的d(GC)n就属于此，属瘦长型，螺距46?，直径18?，12bp/圈，大小沟不明显。 是DNA分子局部的二级结构，意义在于封闭基因表达，使复制和转录的酶找不到大沟 。

　　三种类型DNA双螺旋的比较

　　3股右手螺旋模型

　　人工合成d(Py)、d(Pu)，按照1：2或2：1混合就形成了3股右手螺旋。具体过程是，2条链先形成B-DNA，第三条链从大沟处附上。其意义在于形成分子剪刀，即在DNA分子的转弯处局部解链，其单链搭在正常DNA右手双螺旋的大沟处形成三股右手螺旋，该处易被Fe2+或EDTA水解，利于基因表达

　　环状双链DNA模型

　　2条反向平行的环状DNA单链按照碱基配对原则形成的右手双螺旋，其数据完全同B-DNA，是原核生物和真核生物细胞器DNA的结构 单链环状DNA，是病毒的遗传物质。 真核生物核DNA是一染色体的形式存在的。

　　3. 染色体的结构

　　(1)DNA超螺旋 (2)原核生物的染色体 (3)真核生物的染色体

　　(1)DNA超螺旋

　　DNA在双链螺旋式结构基础上,进一步折叠成为超级螺旋结构 ，使DNA分子得以紧密压缩。 超螺旋的形成是由分子内的张力引起的。 两种超螺旋 正超螺旋：左手超螺旋，是B-DNA加剧螺旋形成的超螺旋，不利于基因表达。 负超螺旋：右手超螺旋，是B-DNA减弱螺旋形成的超螺旋，利于基因表达。

　　超螺旋的形成

　　(2)原核生物的染色体

　　绝大部分原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋分子。这种双螺旋分子还需再次螺旋化形成超螺旋结构以保证其可以较致密的形式存在于细胞内。

　　真核生物的染色体

　　四级结构

　　一级结构

　　二级结构

　　三级结构

　　DNA分子

　　(3)

　　染色体的基本单位是 核小体， 即染色体的 一级结构。核小体由核心颗粒和连接区DNA二部分组成，在电镜下可见其成捻珠状，前者包括组蛋白H2A，H2B，H3和H4各两分子构成的致密八聚体(又称核心组蛋白)，以及缠绕其上一又四分之三圈长度为146bp的DNA链;后者包括两相邻核心颗粒间约60bp的连接DNA和位于连接区DNA上的组蛋白H1，连接区使染色质纤维获得弹性。

　　染色体的一级结构

　　染色体的二级结构

　　DNA链进一步折叠成每圈六个核小体，直径30nm的纤维管状结构

　　染色体的三级结构

　　30nm纤维再扭曲成襻，许多襻环绕染色体骨架形成棒状的200nm纤维，将核小体压缩将近一万倍。

　　染色体的四级结构

　　在200nm纤维的基础上，核小体又进一步旋转折叠，形成纤维状结构及襻状结构、最后形成棒状的染色体，将近l m长的DNA分子容纳于直径只有数微米的细胞核中。

　　(二)DNA的分布

　　原核生物：原核细胞的核区、质粒 真核生物：细胞核、线粒体和植物细胞的叶绿体; DNA病毒

　　(三)DNA的功能

　　1. DNA的功能 2. 基因和基因组DNA 3. 真核生物基因组结构特点 4. 原核生物基因组结构特点

　　1. DNA的功能

　　(1)储存遗传信息 (2)复制遗传信息 (3)表达遗传信息 (4)遗传变异

　　(1)储存遗传信息

　　核酸是遗传的物质基础。除极少数RNA病毒外，DNA是绝大多数生物的遗传信息储存者，在生物体内的生物大分子中占有中心位置。这是DNA的第一个功能。 DNA以它巨大分子和变化万千的核苷酸序列以及神奇的结构储存生物的全部信息。 DNA的核苷酸序列决定所有细胞内的RNA核苷酸和蛋白质的氨基酸序列，并且通过蛋白质、酶间接作用细胞内其他构成成份的合成，决定所有生命物质的大小、形状和功能，还包含调控蛋白质、RNA表达的的信息。

　　生物体的遗传物质是DNA的证明： 实验一，肺炎双球菌的转化实验

　　实验二，放射性同位素对噬菌体的标记实验

　　(2)复制遗传信息

　　DNA通过自我复制能将储存的遗传信息稳定地、忠实地从一代细胞传至下一代细胞，这是DNA的第二个功能。 DNA的双螺旋结构和碱基互补配对原则(氢键相互作用)是DNA复制，遗传信息从亲代细胞传至子代细胞的基础，众多的酶、蛋白质因子参与复制是DNA复制能忠实、稳定进行的保证。

　　(3)表达遗传信息

　　遗传信息的表达是将DNA储存的遗传信息通过转录和翻译产生蛋白质而体现生物体的生命活动和生命现象，这是DNA的第三个功能。 在子代个体中，通过遗传信息的表达 ，实现亲代遗传信息指导的新个体的构建，从而使子代表现出与亲代相同或相似的性状。

　　(4)遗传变异

　　生物的遗传性和变异性同时存在，生物的遗传性是基因稳定性的表现，变异性是基因变异(基因突变)的表现。 遗传和变异都是普遍存在的自然现象。在一定范围内的突变是生物产生新的遗传特性和新的生物物种所必需的,是生物适应环境的变化的根本所在。没有突变，就没有生物的进化，变异也可以说是DNA的一个功能。

　　2. 基因和基因组DNA

　　DNA分子中不同排列顺序的DNA区段构成特定的功能单位，即基因(gene)。 一般将细胞内遗传信息的携带者——染色体所包含的DNA总体称为基因组(genome)。 同一物种的基因组DNA含量总是恒定的，不同物种间基因组大小和复杂程度则差异极大，一般讲，进化程度越高的生物体其基因组构成越大、越复杂。 如病毒SV40的基因组大小为5.1×103bp，大肠杆菌为5.7×106bp，人为3×109bp。 

　　3. 真核生物基因组结构特点

　　①真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因组是双份的(即双倍体)，即有两份同源的基因组。 ②真核细胞基因转录产物为单顺反子，即一个结构基因转录、翻译成一个mRNA分子，合成一条多肽链。

　　3. 真核生物基因组结构特点

　　③存在大量重复序列，即在整个DNA中有许多重复出现的核苷酸顺序，重复序列长度可长可短，短的仅含两个核苷酸，长的多达数百、乃至上千。重复频率也不尽相同; 高度重复序列重复频率可达106次，包括卫星DNA、反向重复序列和较复杂的重复单位组成的重复序列; 中度重复序列可达103～104次，如为数众多的Alu家族序列，KpnI家族，Hinf家族序列，以及一些编码区序列如rRNA基因、tRNA基因、组蛋白基因等 单拷贝或低度重复序列，指在整个基因组中只出现一次或很少几次的核苷酸序列，主要是编码蛋白质的结构基因，在人基因组中占约60～65%，因此所含信息量最大。

　　3. 真核生物基因组结构特点

　　④基因组中不编码的区域多于编码区域。 ⑤基因不连续，真核生物结构基因的内部存在许多不编码蛋白质的间隔序列，称为内含子，编码区则称为外显子。内含子与外显子相间排列，转录时一起被转录下来，然后RNA中的内含子被切掉，外显子连接在一起成为成熟的mRNA，作为指导蛋白质合成的模板 ⑥基因组远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小

　　4. 原核生物基因组结构特点

　　①基因组较小，没有核膜包裹，且形式多样，可能是单链的，也可能是双链的，可能是闭环分子，也可能是线性分子;细菌染色体基因组则常为环状双链DNA分子，并与其中央的RNA和支架蛋白构成一致密的区域，称为类核。病毒的基因组可能是RNA。 ②功能相关的结构基因常常串连在一起，并转录在同一个mRNA分子中，称为多顺反子。

　　4. 原核生物基因组结构特点

　　③DNA分子绝大部分用于编码蛋白质，不编码区部分(又称间隔区)通常包含控制基因表达的序列。 ④基因重叠是病毒基因组的特点，即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子。 ⑤除真核细胞病毒外，基因是连续的，即不含内含子序列。

　　RNA的结构和功能

　　RNA的一级结构 RNA的种类 RNA的空间结构 tRNA的结构 mRNA的结构 rRNA的结构 RNA的分布

　　RNA的一级结构

　　RNA的一级结构是指四种核苷酸(AMP、CMP、GMP、UMP)按照一定的排列顺序，通过3′，5′-磷酸二酯键连接形成的多核苷酸 ，即核苷酸顺序。

　　RNA的种类

　　主要的RNA种类有rRNA、mRNA、tRNA、hnRNA、SnRNA、ScRNA等 mRNA：信使RNA，是从基因上转录下来去指导蛋白质合成的RNA。 tRNA：转运RNA，在蛋白质合成过程中运输氨基酸。 rRNA：核糖体RNA，是核糖体的组成部分

　　RNA的空间结构

　　RNA通常以单链形式存在，但也可形成局部的双螺旋结构。 RNA的二级结构的通常为发夹结构或茎环结构，指RNA单链局部回折形成2条反向平行的片段，2片段中碱基互补的地方就形成右手双股螺旋，符合A-DNA模型，不互补的地方就形成环状结构。

　　tRNA的结构

　　tRNA的一级结构 tRNA的三叶草结构模型 tRNA的空间结构

　　tRNA的一级结构

　　tRNA是细胞内分子量最小的一类核酸, 100多种tRNA都由70至90个核苷酸构成 tRNA是细胞内含稀有碱基最多的一类核酸。其分子中含10%～20%的稀有碱基。 稀有碱基是指除A、G、C、U外的一些碱基，包括二氢尿嘧啶(DHU)、假尿嘧啶(ψ)和甲基化的嘌呤(mG,mA)等。 tRNA是保守性最强的RNA

　　tRNA的三叶草结构模型

　　tRNA核苷酸中存在局部互补配对的区域，可以形成局部双链，进而形成一种茎-环样结构或发夹结构，中间不能配对的部分则膨出形成环状或襻状，使tRNA形成“三叶草形”二级结构。从5′端开始，分别称为DHU环、反密码环、额外环以及Tψ环等四环，环连接主体的部分分别为四臂。

　　氨基酸臂

　　额外环

　　DHU臂

　　反密码臂

　　TψC臂

　　四臂

　　包含3’和5’端其3’端具有CCA-OH序列，这个-OH将和氨基酸中的-COOH形成酯键，携带AA。 DHU臂和Tψ臂，以及反密码臂分别是环与主干的连接

　　四环

　　二氢尿嘧啶环：含有二氢尿嘧啶，稀有碱基 反密码环：最底部具有反密码子，可以和mRNA上的密码子配对，将携带的AA送到恰当的位置。 额外环：显示tRNA特异性的地方，是tRNA分类的依据。 TψC环：含有稀有碱基T(本应该在DNA中的)、假尿苷ψ

　　tRNA的空间结构

　　tRNA的共同三级结构是倒“L”型，倒“L”形三级结构中TψC环与DHU环相距很近。

　　mRNA的结构

　　mRNA分子中含有稀有核苷酸 mRNA可形成局部双螺旋结构的二级结构 mRNA在真核生物中的初级产物称为hnRNA，hnRNA经转录后加工才能转变为成熟的mRNA 大多数真核成熟的mRNA分子具有典型的5’-端的7-甲基鸟苷三磷酸(m7GTP)帽子结构和3’-端的多聚腺苷酸(polyA)尾巴结构 mRNA分子中带有遗传密码，其功能是为蛋白质的合成提供模板

　　真核生物mRNA 5’-端帽子结构

　　真核生物mRNA 3’-端的polyA结构

　　rRNA的结构

　　rRNA是细胞中含量最多的RNA，占总量的80%。 rRNA与蛋白质一起构成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所 rRNA 也能形成二级结构。 在原核生物中，rRNA有三种：5S，16S，23S。 在真核生物中，rRNA有四种：5S，5.8S，18S，28S。

　　核蛋白体的组成

　　大肠杆菌16S rRNA的二级结构

　　RNA的分布

　　RNA的分布 原核生物：核区、胞液; 真核生物：细胞核、线粒体、细胞液和植物细胞的叶绿体; RNA病毒

　　三、 核酸的理化性质及应用

　　(一)核酸的一般理化性质 (二)DNA的变性 (三)DNA复性与分子杂交

　　(四)核酸的一般理化性质

　　核酸的酸碱性、粘度和稳定性 核酸的紫外吸收 显色反应和溶解性 核酸的沉降性和核酸电泳 核酸分子量测定和DNA呼吸作用

　　核酸的酸碱性、粘度和稳定性

　　核酸的酸碱性：核酸具有较强的呈酸性 核酸的粘度：DNA是线性高分子，粘度极大，RNA分子远小于DNA，，DNA为线状分子，RNA为线团，粘度小得多。 稳定性：DNA分子在机械力的作用下易发生断裂，DNA耐碱，而RNA易被碱水解。

　　核酸的紫外吸收

　　1.嘌呤和嘧啶环中均含有共轭双键，使其在260nm左右波长处有最大紫外吸收。这是DNA和RNA定量最常用的方法，碱基展开程度越大，紫外吸收就越厉害 2.测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷消光系数ε(P)来表示溶液中核酸的含量。 A为光密度，c为每升溶液中磷的摩尔数，L为比色杯内径 3.用A260/A280来表示核酸的纯度： DNA很纯>1.8， RNA很纯>2。 4.紫外吸收随核酸的状态不同而不同，从小到大排列如下： 超螺旋< 双螺旋<单链< 核苷酸

　　显色反应和溶解性

　　显色反应：鉴别DNA和RNA 1.浓HCl 中，RNA加入苔黑酚呈绿色，DNA加入二苯胺呈蓝紫色 2.啡啶溴红(荧光染料)可对DNA染色，它为平面分子，卡在DNA分子中，紫外光下，增强荧光，DNA的离心和电泳显色可用它们 溶解性： 核酸都溶于水而不溶于乙醇，因此，用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而RNA不溶，故可用苯酚来沉淀RNA。

　　核酸的沉降性和核酸电泳

　　核酸的沉降性 对于拓扑异构体(核苷酸数目相同的核酸)，其沉降速度为： RNA > 超螺旋DNA > 解链环状DNA > 松弛环状DNA > 线形DNA 在离心管中最上层是线形DNA，最下面是RNA。 核酸电泳：核苷酸、核酸均可以进行电泳，泳动速度主要由分子大小及构象来决定，因此，电泳是测定核酸分子量的好方法。迁移率从大到小如下： 闭口环状>线性双螺旋>切口环状 单链DNA有典型的构象，具有特征性，当然，其构象要受环境因素的影响

　　核酸分子量测定和DNA呼吸作用

　　DNA分子量测定最直接的方法：用适当浓度的EB(溴嘧啶)染色DNA，可以将其他形式的DNA变成线形DNA，用电镜测出其长度，按B-DNA模型算出bp数，根据核苷酸的平均分子量就可计算出DNA的分子量。通常用电泳方法测小分子核酸的分子量。 DNA呼吸作用是指DNA双螺旋两条链之间的氢键经常打开有闭合的现象，称为DNA的呼吸作用。

　　(五)核酸的变性与分子杂交

　　1. DNA的变性 2. DNA复性与分子杂交

　　1. DNA的变性

　　DNA变性的概念 DNA变性后性质的改变 DNA解链曲线 影响DNA变性的因素

　　DNA变性的概念

　　在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，DNA双螺旋结构松散，变成单链的过程 其中加热是实验室最常用的DNA变性的方法。

　　DNA变性后的性质改变

　　①增色效应; ②旋光性下降; ③粘度降低; ④生物学功能丧失或改变。

　　增色效应

　　加热时，DNA双链解链过程中，内部的碱基暴露，对260nm波长紫外光吸收增加，并与解链程度有一定的比例关系。这种关系称为DNA的增色效应。

　　DNA解链曲线

　　连续加热DNA的过程中以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线 从曲线中可以看出，DNA的变性从开始解链到完全解链，是在一个相当窄的温度内完成的，这是一个协同过程。 紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度(融解温度)，记为Tm。 在Tm时，核酸分子内50%的双链结构被解开, Tm一般在70～85℃之间。

　　影响DNA变性的因素

　　DNA分子中的碱基比例 介质的离子强度 分子的均一性 有机溶剂 溶液的pH

　　DNA分子中的碱基比例

　　GC/AT越大，Tm越高，原因是G≡C，A=T，经验公式：Tm值计算公式： Tm=69.3+0.41%(G+C) 小于20bp的寡核苷酸的Tm计算：Tm=4(G+C)+2(A+T)。

　　介质的离子强度

　　离子强度越大，Tm值愈高。 核酸链骨架上的磷酸基团带有较多的负电荷，它们之间的静电排斥作用是双链不稳定的因素之一。加入盐后，正离子中和磷酸基团的负电荷，使DNA双链稳定性增加，Tm值升高。DNA通常在1毫升/摩尔的NaCl中。

　　分子的均一性

　　复杂度越高，Tm越高，复杂度指DNA分子中的最小重复单位中的bp个数。例如：d(AT/TA)n的复杂度为2，d(ATTA/TAAT)n的复杂度为4。

　　有机溶剂

　　甲酰胺、二甲基亚砜、脲、尿素和甲醛等可以降低Tm，等。用50%的甲酰胺大约可使杂交双链的Tm值降低30℃

　　溶液的pH

　　当溶液的pH接近12时，碱基由酮式转变为烯醇式，当pH接近2～3 时，碱基发生质子化，从而影响分子的稳定。

　　2. DNA复性与分子杂交

　　DNA复性的概念 影响DNA复性的因素 核酸的分子杂交

　　DNA复性的概念

　　DNA复性：变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。复性后核酸物化性质随之恢复，其中伴随着，粘度增加，减色效应，即A260减低。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，又称为退火

　　影响DNA复性的因素

　　温度和时间 DNA顺序的复杂性 DNA浓度 DNA的长度 及碱基错配程度

　　温度和时间

　　保温时间太短以及温差较大均不利于复性，一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。 复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。

　　DNA顺序的复杂性

　　将温度、溶剂离子强度、核酸片段大小等其它影响因素均予以固定，以不同程度的核酸分子重新缔合的部分(在时间t时的复性率)对Cot(Co为单链DNA的起始浓度，t是以秒为单位的时间)作图，可以得到复性动力学的曲线。 复杂性以非重复核苷酸对的数目表示。如多聚(A)的复杂性为1，重复的(ATGC)n组成的多聚体的复杂性为4，分子长度是105核苷酸对的非重复DNA的复杂性为105。

　　复性动力学曲线

　　核酸分子的非重复碱基对数即复杂性

　　在标准条件下(一般为0.18ml/L阳离子浓度，400核苷酸长的片段)测得的复性率达0.5时的Cot值(称Cot1/2)，与核苷酸对的复杂性成正比，Cot1/2表示复性速度与DNA顺序复杂性的关系。 DNA分子的序列越复杂，Cot1/2越大，复性速度越小。所以，通过Cot1/2值可以推断基因组DNA的杂度。 从复性动力学曲线可以分析到，原核生物的Cot曲线简单，基因组均为非重复顺序，而真核基因组的Cot曲线复杂，基因组中含有许多不同程度的重复序列。

　　DNA浓度

　　复性反应遵循二级反应动力学。溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合的机会越大，有：

　　k对DNA具有特征性，与碱基数呈反相关，也与DNA分子的复杂度呈反相关。

　　DNA的长度 及碱基错配程度

　　DNA分子越长，复性越慢 复性双链的碱基错配程度程度高，Tm值低，杂交双链同源性每降低1%，Tm值降低1.5℃为15—150bP的寡核苷酸探针更为明显。

　　核酸的分子杂交

　　分子杂交的概念 核酸探针 分子杂交的种类 两种常用的核酸杂交 Southern Blotting Northern Blotting 分子杂交的应用

　　分子杂交的概念

　　将不同来源的DNA单链以及DNA单链和RNA依靠同源序列的碱基互补配对，形成双螺旋的方法称为核酸的分子杂交。其产物叫杂交分子 不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序。 一般情况是将热变性后的DNA溶液缓慢冷却，在低于变性温度约25～30℃的条件下保温一段时间(退火)，则变性的两条单链DNA可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。 核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA杂交。

　　核酸探针

　　用同位素、生物素或荧光染料标记一小段已知序列的多聚核苷酸的末端或全链，称为核酸探针。探针的序列如果与DNA或RNA序列互补，复性时形成杂交分子，就可以探知核酸分子。

　　分子杂交的种类

　　核酸的分子杂交技术有很多种：滤膜杂交、斑点杂交、液相杂交、原为杂交，目前已发展为高通量的芯片杂交技术

　　滤膜杂交与斑点杂交

　　滤膜杂交是指将待测核酸片段结合到滤膜上，然后同标记探针进行杂交。 将粗制的或纯化的核酸样品变性后直接点样于滤膜表面，再与标记的探针进行杂交的方法称斑点印迹杂交或狭缝杂交。斑点印迹为圆形，狭续印迹为线状。

　　原位杂交

　　标记探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交的方法称原位杂交。 该法不需要从组织或细胞中提取核酸，而是在组织和细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量的特异性方法之一，在细胞的生物学功能、基因表达调控以至肿瘤发生机制及病原微生物的检测等研究领域发挥着重要作用。

　　液相杂交

　　液相杂交是指待测的核酸和标记的探针同时溶于杂交液中进行反应，然后分离杂交双链和未参加反应的标记探针，再进行检测。 由于液相杂交反应条件均一，各种反应参数易确定，反应速度较快，因此便于杂交反应动力学的理论研究。

　　DNA芯片

　　DNA芯片是利用微点阵技术，将探针(通常是DNA或cDNA)以高密度点阵的形式按一定的顺序固定排列在1平方厘米的硅片(玻片、尼龙膜等)表面上，再将所研究的样本材料如DNA、RNA或cDNA用荧光标记，在芯片上与探针杂交;然后通过激光共聚焦显微镜等对芯片进行扫描，并配合计算机系统进行分析，从而快速、准确地得出所需信息。 只需要一次实验，DNA芯片便能够将成千上万的基因表达图谱记录下来。

　　Subclone contig

　　(Gp:) 1

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　　(Gp:) Selected Subclone tilling

　　(Gp:) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

　　(Gp:) 13 14 15 16 17 18 ……

　　(Gp:) DNA in 96-well plate

　　(Gp:) DNA Chips

　　(Gp:) Detection

　　Southern Blotting

　　用于钓基因，即用已知的DNA单链或RNA，钓取未知DNA分子中的基因，方法如下： 未知的DNA→DNA限制性内切酶→DNA片段→琼脂糖电泳分离→碱液变性→影印在硝酸纤维薄膜上→与放射性标记的已知DNA单链或RNA杂交→放射自显影

　　Northern Blotting

　　用已知的DNA钓mRNA，方法如下： 未知RNA→电泳分离→变性→影印→用标记的已知DNA单链杂交→放射自显影

　　分子杂交的应用

　　杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一，不仅可用来检验核酸的缺失、插入，还可用来考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序列以确定它们在进化中的关系。例如，一段天然的DNA和这段DNA的缺失突变体(假定这种突变是DNA分子中部丢失了若干碱基对)一起杂交，电子显微镜下可以看到杂化双链中部鼓起小泡。测量小泡位置和长度，可确定缺失突变发生的部位和缺失的多少。

　　六、核酸酶

　　?具有自身催化作用的RNA称为核酶(ribozyme)，核酶通常具有特殊的分子结构，如锤头结构。