流式细胞仪的原理及应用.ppt

　　流式细胞仪的原理及应用

　　流式细胞术的基本概念

　　流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性(如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等)进行多参数定量分析和分选的新技术。

　　流 式 细 胞 术 的 特 点

　　流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。

　　细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量

　　流式细胞仪的基本概念

　　流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。

　　BD FACSCanto流式细胞分析仪

　　流式细胞仪的检测范围

　　细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 ……

　　细胞功能 ? 细胞表面/胞浆/核的特异 性抗原 ? 细胞活性 ? 细胞内/外的细胞因子 ? 激素结合位点 ? 细胞受体 ? 钙离子浓度 ? 线粒体膜电位 ? ……

　　一、流式细胞仪的工作原理

　　采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率; 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性; 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。

　　1.流式细胞仪的基本结构

　　(1) 液流系统 (2) 光学系统 (3) 数据处理系统

　　(1)液 流 系 统

　　由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。

　　液 流 系 统 示 意 图

　　液流速度：低速、中速、高速

　　低速：10ul/min; 中速：60ul/min; 高速：120ul/min.

　　(2)光 学 系 统

　　由激光光源、分色反光镜、光束成形器、透镜组、滤片和光电倍增管组成。

　　(Gp:) Flow Tip

　　(Gp:) Laser

　　(Gp:) SS and FL Detector

　　(Gp:) FS Detector

　　(3)数 据 处 理 系 统

　　主要由计算机和及其软件(BD FASCDiva和BD ModFit LTTM)组成。

　　流 式 细 胞 仪 与 显 微 镜 的 区 别

　　二、散 射 光 的 测 量

　　细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。

　　前 向 散 射 光(FS)

　　前向散射光(forward scatter, FS)： 激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。

　　通常在FCM应用中，选取FS作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。

　　前 向 散 射 光 示 意 图

　　(Gp:) FALS Sensor

　　(Gp:) Laser

　　侧 向 散 射 光(SS)

　　侧向散射光(side scatter, SS)：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。

　　侧 向 散 射 光 示 意 图

　　(Gp:) FALS Sensor

　　(Gp:) 90LS Sensor

　　(Gp:) Laser

　　光 散 射 测 量 的 用 途

　　测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。

　　光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群

　　三、荧 光 的 测 量

　　荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。

　　荧 光 染 料 的 特 性

　　(Gp:) 激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION)

　　荧 光 信 号 的 检 测

　　使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量

　　四、细 胞 分 选 原 理

　　通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。

　　细 胞 分 选 示 意 图

　　(Gp:) 细胞悬液形成液流柱

　　(Gp:) 流动室振动

　　(Gp:) 液流断裂成液滴

　　(Gp:) 空白液滴

　　(Gp:) 含细胞的液滴

　　(Gp:) 弃去

　　(Gp:) 偏转落入收集器

　　(Gp:) 压电晶体

　　(Gp:) 产生机械振动

　　(Gp:) 不充电

　　(Gp:) 充电

　　五、数 据 的 显 示 与 分 析

　　参数：FS,SS,FL 数据显示方式 (单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ) 设门分析技术

　　(一)参 数 说 明

　　FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少

　　(二)数 据 显 示 方 式

　　直分析方图

　　单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析

　　1.单 参 数 直 方 图

　　由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。

　　单 参 数 直 方 图

　　(Gp:) 细胞相对数量

　　(Gp:) 信道(channel )

　　2.双 参 数 直 方 图

　　双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。

　　双 参 数 直 方 图 点 图

　　(Gp:) 绿色荧光强度

　　(Gp:) 红色荧光强度

　　(三)设 门 分 析 技 术

　　1.Gate设置：指根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群。

　　根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。

　　A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞

　　A、B、C均为任意门

　　线性门

　　2. 区阈(Region设置):

　　如十字门分析时，由四个区阈构成，即G=D1+D2+D3+D4。

　　D1：CD4+/CD3- D2：CD4+/CD3+ D3：CD4- /CD3- D4：CD4- /CD3+

　　六、流式细胞仪免疫分析的技术要求

　　样本制备 标记染色 质量控制

　　(一)免 疫 样 品 的 制 备

　　培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤

　　(Gp:) 单细胞悬液

　　单 细 胞 悬 液 的 制 备 与 保 存

　　新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 单细胞悬液的保存 深低温保存法(一年) 乙醇或甲醇保存法(2周) 甲醛或多聚甲醛保存法(2月)

　　(二)常 见 的 荧 光 染 料

　　(三)免 疫 荧 光 标 记

　　荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体

　　(三)流式细胞免疫学技术的质量控制

　　1.单细胞悬液制备的质控 适当的制备方式 实体组织来源标本用机械法 温度25-37℃，pH7.0-7.2

　　2. 免疫荧光染色的质控 温度 pH 染料浓度 固定剂

　　3. 仪器操作的质控 光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异(CV)。 PMT(光电倍增管)校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准: 保证计数的准确性。

　　4. 免疫检测的质控 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。(通常采用未染色细胞作为阴性对照) 全程质量控制：同型对照与待测标本一起标记和检测，该实验结果可靠。

　　七、流 式 细 胞 仪 的 科 研 应 用

　　树突细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究 流式细胞术在免疫检验中的应用

　　FCM 在 细 胞 生 物 学 中 的 应 用

　　DNA 细 胞 周 期 分 析

　　(Gp:) S

　　(Gp:) cell division

　　(Gp:) G1

　　(Gp:) (DNA synthesis)

　　(Gp:) G2

　　(Gp:) M (mitosis)

　　细 胞 周 期(cell cycle)

　　G1期(DNA合成前期)　从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，此期主要合成RNA和核糖体。 S 期(DNA合成期)　除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。 G2期(DNA合成后期) 大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。 M期(细胞分裂期)由一个母细胞分裂成为两个子细胞 。 G0期(细胞休眠期)暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一定生物学功能的细胞所处的时期 。

　　PI染色检测细胞周期 Protocol

　　离心收集细胞，弃上清，用PBS洗细胞两次。 加入预冷的70%乙醇，于40C固定过夜，或-200C长期固定。 细胞染色：离心收集细胞，用1mlPBS洗细胞一次，加入500ulPBS(含50ug/ml溴化乙锭(PI)，100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-100)40C避光孵育30分钟。 流式细胞仪检测：一般细胞计数2-3万个。结果用软件Modfit分析。

　　Modfit LT 分 析 细 胞 周 期

　　细 胞 周 期 结 果 分 析

　　CV值：又称为变异系数，一般CV值越小，峰型越好，越尖锐。能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。 G2/G1为1.82.(即G2期是四倍体细胞，而G1期是二倍体细胞，比值应为1.8-2.0之间。若小于1.8，则细胞染色不充分。

　　Peng zhang; Free Radical Research,2009,43(3):224-233.

　　细 胞 凋 亡 的 检 测

　　细胞形态及细胞膜通透性的变化(Hoechest 33342和碘化丙啶(propidium iodide，PI) Caspases激活(Caspase-3 ) 线粒体跨膜电位降低 (Rhodamine123) 膜磷脂酰丝氨酸外化(Annexin V-FITC/PI) Ca2+ 浓度升高 (Fluo-3) DNA断裂及含量的变化 (TUNEL 和 PI) 

　　FCM 检 测 细 胞 凋 亡 的 特 点

　　FCM能鉴别及定量分析凋亡细胞，揭示凋亡相关的分子及其功能机制，测定凋亡细胞功能特征的变化，并能对细胞的多个特征同时进行多参数测量，还具有简便、快速、检测所需细胞量少等优点 .

　　Annexin-V 和 PI 双 染 protocol

　　细胞用冷PBS洗涤二次并在恰当的染色缓冲液(binding buffer)中以1 x 106 细胞/mL的浓度重悬 吸取100ul的细胞(1 x 105)至试管中。 加进适量的荧光标记的annexin-V试剂和PI。 混匀后避光室温下孵育15分钟。(必须在室温下进行) 孵育后加进400ul染色缓冲液，立即上流式细胞仪分析。

　　Annexin-V和PI双染的特点和注意事项

　　检测特点：简便，快速，准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。 注意事项： 1.细胞制备(如贴壁细胞)和储存时细胞膜的破损会导致磷脂酰丝氨酸(PS)跨膜分布的改变，造成假阳性。 2.染色后立即上机检测。

　　Effect of PQQ on MeHg-induced distributive change of early and late apoptotic cells. (A) control. (B) PC12 cells were treated with MeHg for 4 h. (C) Cells were pre-treated with PQQ for 30 min and then were exposed to MeHg for 4 h

　　Q3: 正常细胞; Q4：早期凋亡细胞; Q2：晚期凋亡细胞; Q1：坏死细胞。

　　荧 光 补 偿

　　补 偿 方 法

　　Annexin V-FITC和PI双染： 空白对照 Annexin V-FITC单染 PI单染

　　细胞内活性氧水平的检测(DCFH-DA)

　　Fig. 4. Effect of ASE on the level of intracellular peroxides in RAW264.7 macrophages stimulated by LPS plus IFN-. Cellswere treated with ASE and 10g/ml LPS plus 20 U/ml IFN- for 3 h. The level of intracellular peroxides was determined by labeling with DCFH-DA and the fluorescent intensity was analyzed by flow cytometer. The results are reported as means±S.D. of three independent experiments. *p < 0.05 or **p < 0.01 compared with the LPS plus IFN- treated cells.

　　上机前使用300目过滤网过滤，以防进样针堵塞。

　　Thank you for your attention!