流式细胞仪原理及应用.ppt

　　流式细胞仪FLOW CYTOMETER

　　原理及应用

　　基本原理

　　光源 488nm兰绿色，15mW空冷，氩离子激光 流路 流动室(flow cell) 鞘液SHEATH：(ISOTON II, III) PBS 无颗粒，无荧光本底 无菌，稳定的pH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml 放大部分 光电倍增管PMT HV 放大电路 GAIN 增益 线性：LIN 对数：LOG 统计：计算机

　　FLOW CELL

　　(Gp:) Injector Tip

　　(Gp:) Fluorescence

　　(Gp:) signals

　　(Gp:) Focused laser

　　(Gp:) beam

　　(Gp:) Sheath fluid

　　FLOW CYTOMETRY(FCM)

　　(Gp:) PMT

　　(Gp:) AMP

　　(Gp:) computer

　　(Gp:) LIN

　　(Gp:) LOG

　　(Gp:) LASER

　　(Gp:) SAMPLE

　　(Gp:) SIGNAL

　　滤片

　　带通滤片 BAND PASS (BP) 只允许某些波长的光通过 二向色性滤片 DICHROIC FILTER 一定波长以上通过，该波长以下折射

　　630 nm BandPass Filter

　　Transmitted Light

　　White Light Source

　　620 -640 nm Light

　　Dichroic Filter/Mirror at 45 deg

　　(Gp:) Reflected light

　　(Gp:) Transmitted Light

　　(Gp:) Light Source

　　PMT

　　PMT

　　PMT

　　PMT 4

　　Dichroic

　　Filters

　　Bandpass

　　Filters

　　Flow Cytometry Principle

　　Laser

　　1

　　2

　　3

　　4

　　Flow cell

　　OPTICS

　　信号

　　荧光信号 FL1，FL2，FL3，FL4 线性，对数 散射光信号 前向散射光(FS)：细胞大小 侧向散射光(SS)：结构复杂程度

　　荧光染料的特性

　　激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION)

　　常用荧光染料的特性

　　荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 深红 PI 488 620 DNA染色 橙红

　　EPICS XL 流式细胞分析仪

　　BECKMANCOULTERFLOW CYTOMETER--------细胞分析领域中的CT实现快速、高灵敏度、多参数的细胞功能分析

　　细胞的特征与细胞功能

　　不同细胞的形态学特征 不同细胞的蛋白表达 其它细胞功能特征

　　Immunophenotyping

　　CD2

　　CD4

　　(Gp:) CD # = cluster designation number

　　90 Degree Scatter

　　0

　　200

　　400

　　600

　　800

　　1000

　　8

　　15

　　20

　　30

　　40

　　50

　　100

　　200

　　1000

　　Lymphocytes

　　Monocytes

　　Neutrophils

　　Side Scatter Projection

　　Light Scatter Gating

　　Scale

　　Log FITC

　　1000

　　100

　　10

　　1

　　.1

　　Immunophenotyping HISTOGRAM 单参数直方图

　　Log FITC Fluorescence (CD8)

　　.1

　　1

　　10

　　100

　　1000

　　1

　　2

　　3

　　4

　　45%

　　2%

　　26%

　　双参数直方图DOT PLOT

　　27%

　　CD分子(Cluster of differentiation) -------人类白细胞分化抗原1982年巴黎首届国际学术会议确定CD命名法已有200多个分化抗原群被鉴定和命名已得到WHO有关管理机关批准

　　CD抗原及其相关细胞群

　　细胞群 CD抗原 T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 B细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94 血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f 内皮细胞 CD105 CD106 CD109 细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126

　　流式细胞术的临床应用

　　临床免疫学 临床血液学 临床肿瘤学 血栓与止血 骨髓和器官移植 基础医学研究

　　(一) FCM在临床免疫学中的应用 1.评价机体的免疫功能 (1) 淋巴细胞亚群 T细胞： CD3+ CD4+ (Th/Ti) CD8+ (Ts/Tc) B细胞： CD19+ NK细胞：CD3- CD16+ CD56+

　　(2) 淋巴细胞亚群细分 T细胞：Ts：CD8+ CD28- Tc：CD8+ CD28+ Th：CD4+ CD29+ Ti：CD4+ CD45RA+ B细胞：B1：CD5+ CD19- B2：CD5 + CD19+

　　(3) 活化淋巴细胞亚群 活化总T细胞： CD3+ /HLA—DR+ 静止总T细胞： CD3+ /HLA—DR- 活化CD4+细胞：CD4+ /HLA—DR+ 活化CD8+细胞：CD8+ /HLA—DR+ 活化诱导分子： CD69 白细胞介素2低亲和力受体： CD25 CD25+ /CD3+：活化T细胞 CD25- /CD3+：静止T细胞

　　(4) Ⅰ型变态反应介导分子 CD23： IgE低亲和力受体 膜结合：IgE (5) HLA类抗原 HLA-B7 / B-27 HLA-DR HLA-DP HLA-DQ HLA-ABC

　　(6) 细胞因子受体 IL-2 Receptor (CD25) IL-12 Receptor EGF-Receptor TNF-Receptor TGFβ-Receptor Insulin-Receptor (7) T细胞受体库 TGR γ/δ TGR α/β TCR νβ变异体

　　(8) 机体免疫功能监测的应用 自身免疫性疾病HLA-B27:强直性脊柱炎相 关标志 变态反应性疾病CD23: 与变态反应严重程度 呈正相关 免疫缺陷性疾病 感染性疾病(病毒、细菌、寄生虫感染) 免疫治疗监测 肿瘤免疫监测 移植免疫监测

　　5例正常人CD4,CD8计数

　　编 WBC LY/WBC LY CD4/LY CD4 CD8/LY CD8 CD4/CD8 号 *109/L *100% *109/L *100% *109/L *100% *109/L 1 8.1 33.1 2681 38.3 1027 25.4 680 1.51 2 6.7 35.0 2345 43.2 1014 26.0 609 1.66 3 8.0 36.5 2920 38.0 1110 27.0 788 1.41 4 5.4 36.0 1944 43.5 846 22.0 428 1.98 5 5.4 34.1 1841 46.5 856 25.5 469 1.82

　　8例HIV/AIDS患者CD4,CD8计数

　　编 WBC LY/WBC LY CD4/LY CD4 CD8/LY CD8 CD4/CD8 号 *109/L *100% *109/L *100% *109/L *100% *109/L 1 3.9 44.5 1736 34.9 606 48.0 833 0.73 2 1.8 32.0 576 4.3 25 61.8 356 0.07 3 3.6 48.3 1739 16.4 285 58.6 1019 0.28 4 3.1 36.2 1122 17.4 195 59.2 644 0.29 5 5.1 39.9 2035 2.9 60 74.7 1520 0.11 6 4.7 35.8 1683 23.8 401 35.6 599 0.67 7 4.0 18.0 720 10.3 74 43.3 312 0.24 8 4.6 60.1 2765 19.3 534 58.6 1620 0.23

　　8例HIV/AIDS患者临床情况

　　编 性 测出抗HIV 目前的 诊断 临 床 情 况 号 别 阳性的年龄 年龄 1 女 30 30 HIV感染 无临床症状 2 男 34 35 AIDS TB,PCP,面神经麻痹,HZV, 隐球菌脑膜炎 3 女 30 34 HIV感染 无临床症状 4 女 23 26 HIV感染 乏力,体力差 5 男 32 33 AIDS TB,PCP 6 女 62 63 HIV感染 无临床症状 7 男 29 30 AIDS PCP 8 男 31 35 HIV感染 无临床症状

　　(二) FCM在临床血液学中的应用 1.白血病的MIC分型 Morphology Immunology Cytogenetics 白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。白血病免疫分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要作用。

　　白血病免疫分型诊断标准 (EGIL) 标准

　　B淋巴系白血病 Pro-B-ALL (BⅠ型)： CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+ Common ALL (BⅡ型)： CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+，CD10+ Pre-B-ALL (BⅢ型)： CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+，Cy Ig M+ 成熟-B-ALL (BⅣ型)： CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+，Kappa/Lambda+

　　急性髓性白血病(AML)

　　AML中，M0 M6 M7可以通过免疫分型确诊

　　AML与ALL免疫表型

　　CD19 CD7 CD33 CD13 HLA-DR TdT B-ALL + - - - + +/- T-ALL - + - - -/+ + AML - -/+ + + +/- -

　　T-ALL表型特征

　　CD7 CD5 CD2 CD3 CD4 CD8 CD1a I + 90% 75% - - - - II + + + 25% 90% 90% + III + + + + +/- +/- -

　　非T-ALL亚型

　　HLA-DR CD19 CD10 CD20 Cyu smIg Ig重排 I + - - - - - - II + + - - - - + III + + + - - - + IV + + + + - - + V + + + + + - + VI + + - + - - +

　　AML免疫表型

　　M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 HLA-DR + + - + + +/- +/- CD34 + +/- - +/- +/- - +/- CD33 + + + + + +/- +/- CD13 +/- + + + + + +/- CD11b - + +/- + + - / CD15 - + +/- + + +/- / CD14 - +/- - + + - - GPA - - - - - + - GP - - - - - - +

　　能正确区别AML和ALL，并能进一步区别 ALL中的T系和B系及亚型。 能正确鉴别AML中的M0、M6、M7 诊断双系或双表型白血病 发现仅表达个别次要非本系列相关抗原 的白血病 诊断少见疑难白血病(如毛细胞性白血病)

　　免疫分型的价值

　　2.白血病的耐药基因(MDR)检测 MDR表达产物—P糖蛋白(P-gp) P-gp的作用机理 P-gp在白血病检测中的临床意义

　　成人急性白血病P-gp表达的临床意义 P-gp+ P-gp- 缓解率(CR) 20.5% 78.5% AML 6个月复发率 66.7 % 8.7% 151 平均无病生存期 5M 13M 缓解率(CR) 66.7% 80.0% ALL 6个月复发率 50.0 % 9.5% 47 平均无病生存期 4M 13M

　　李建勇 Clin J Oncol 1998,4:302

　　成人ALL多药耐药P-gp与形成学分型的关系 分型 例数 P-gp+ P-gp- P-pg阳性率 L1 25 3 22 12% L2 40 10 30 25% L3 3 1 2 33.3%

　　P>0.05 华东：中华血液学杂志，1998，19：371

　　P-gp表达与ALL免疫分型的关系 免疫分型 例数 P-gp阳性例数 阳性率(%) B 38 8 21.1 T 10 1 10.0 T/B 4 2 50.0 难分类 4 2 50.0 My- 40 4 10.0 My+ 16 9 56.3

　　My+ALL 的P-gp阳性率明显增高

　　AML中免疫表型与P- gp表达的关系 成人： P-gp的表达与CD7、CD14、CD42b、CD61、 CD34 等高度相关。 老年人： P-gp的表达与CD14、CD42b、CD61有相关性 P-gp的表达与CD34高度相关。

　　3.白血病的其它检查 (1) 细胞凋亡的检查 Fas及FasL Apo 2·7 bcl-2 P53 Annexin Ⅴ Caspase(半胱氨酸蛋白酶) (2) 细胞DNA分析 (3) 白血病残留病灶检查(MRD)

　　4.血液病的其他应用

　　AA，PNH鉴别诊断 自身抗体检测 PAIgG, PAIgM, PAIgA RBC抗体 粒细胞抗体

　　PNH红细胞表面CD59表达

　　(三) FCM在临床肿瘤学中的应用 肿瘤患者的免疫功能检查 肿瘤患者的粘附分子检查 ICAM-1 CD54 ICAM-2 CD102 ICAM-3 CD106 CD62、CD63、CD42a/b、CD41/61、TSP

　　肿瘤标本的FCM检查 耐药基因检查 癌基因与抗癌基因在肿瘤细胞中的表达及与预后的关系 粘附分子检查 细胞凋亡检查 细胞DNA及细胞周期分析(癌前病变,恶性肿瘤预后评价) 细胞增殖能力研究 肿瘤细胞耐药性筛选 肿瘤相关抗原，特异标志物 激素受体 与癌细胞生物行为有关的因子，如CD44

　　利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等) 与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量

　　细胞DNA分析原理

　　G2

　　M

　　G0

　　G1

　　s

　　0

　　200

　　400

　　600

　　800

　　1000

　　(Gp:) G0

　　(Gp:) G1

　　s

　　(Gp:) G2

　　(Gp:) M

　　DNA Analysis

　　DNA content

　　Count

　　(Gp:) 2N

　　(Gp:) 4N

　　Normal Cell Cycle

　　0

　　200

　　400

　　600

　　800

　　1000

　　PI Fluorescence

　　DNA Analysis

　　2N

　　4N

　　0

　　200

　　400

　　600

　　800

　　1000

　　PI Fluorescence

　　DNA Analysis

　　Aneuploid peak

　　(Gp:) DNA index 1.21

　　1.出现非整倍体细胞峰， DI>1.1或DI<0.9 2.无明显的异倍体，但S期>15% 3.无明显的异倍体，但G0/1的CV>10%， S期在10% -15% 4.S+G2/G1/0 >20%

　　DNA诊断肿瘤病标准 (Klein et al)

　　DNA的倍体和DNA指数的关系

　　(Gp:) DI=

　　(Gp:) 样品G0/1细胞峰均道值

　　(Gp:) 正常二倍体标准细胞G0/1期细胞均道值

　　淋巴瘤组织学分级与DNA倍体及S期细胞关系

　　Histology DNA Analysis S 期比值(%) Low -grade Diploid 1~5 Intermediate-grade Frequently Aneuploid 5 ~15 High-grade Frequently Diploid >15

　　异倍体癌前病例病变结果

　　组织类别 异倍体(例数) 癌变例数 组织学分级 1 2 3 鼻咽 13 7 0 1 6 口腔 7 4 0 0 4 胃 10 3 0 0 3 宫内膜 9 6 0 1 5 宫颈 6 2 0 0 2 总计 45 22 2 20

　　各类癌前病变组织学分级与DNA倍体关系(1)

　　组织类别 不典型增 例数 DNA倍体(例数) 生分级 二倍体 异倍体 鼻咽粘膜 1 11 11 0 2 28 23 5 3 13 5 8 口腔粘膜 1 10 10 0 2 6 6 0 3 19 12 7

　　各类癌前病变组织学分级与DNA倍体关系(2)

　　组织类别 不典型增 例数 DNA倍体(例数) 生分级 二倍体 异倍体 胃粘膜 1 18 18 0 2 14 13 1 3 14 6 8 宫内膜 1 10 10 0 2 14 13 1 3 16 8 8 宫颈粘膜 1 9 9 0 2 16 12 4 3 5 3 2

　　辅助诊断肿瘤 估计肿瘤的预后 监测疗效

　　细胞DNA分析的临床意义

　　尿液 宫颈分泌物 胸腹水 肺泡灌洗液 各种刺激液

　　脱落细胞的DNA分析

　　(四) FCM在血栓与止血中的应用 1.血小板糖蛋白 血小板质膜糖蛋白 GPⅠa ：CDw49b GPⅢa： CD61 GPⅠb ：CD42b GPⅣ： CD36 GPⅠc ：CDw49f GPⅨ： CD42a GPⅡa ：CD29 GPⅡb： CD41 GPⅡa'：CD31 血小板颗粒膜糖蛋白 α颗粒：CD62P (GMP140、PADGEM) GMP-33 TSP λ颗粒：溶酶体完整膜糖蛋白 CD63 溶酶体相关膜糖蛋白-1 LAMP-1 溶酶体相关膜糖蛋白-2 LAMP-2

　　血小板切面模式图

　　垂直切面

　　赤道切面

　　2.活化血小板检测 CD62P， CD63 GPⅡb/Ⅲa(CD41/61) GPⅣ(CD36) GPⅨ-Ib (CD42a/CD42b) Thrombospondin 血小板内钙离子

　　3.遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断 巨血小板综合症(BSS) GP Ib-Ⅸ(CD42a/CD42b)缺陷或缺乏 血小板无力症(CT) GP Ⅱb/Ⅲa(CD41/61)缺陷或缺乏 贮存池疾病 ?-SPD下降

　　活化血小板的概念 循环血液中处于静息状态的血小板受到生物或物理因子刺激后,使血小板胞浆内颗粒膜糖蛋白释放与质膜融合,血小板膜表面糖蛋白发生数量重排和构象变化而成为活化血小板

　　活化血小板的功能 ◆参与血栓形成与止血 ◆参与炎症和免疫反应 ◆参与肿瘤的转移

　　血小板活化标志物在缺血性脑血管疾病中研究： 1.脑缺血患者急性期血小板CD62p、CD63测定 2.缺血性脑血管患者CD62p、CD54、CD49d测定 3.缺血性脑血管患者CD62p、TSP、CD54测定

　　(五) FCM在骨髓和器官移植中的应用 骨髓或脐血的祖干细胞细胞测定 CD34+ CD38- CD34+ CD38+ CD34- CD38+ 移植前配型 HLA-I类抗原的抗体(PRA) 血管内皮细胞抗体(VEA) 移植后的免疫监测 淋巴细胞及活化淋巴细胞亚群 粘附分子

　　(六) FCM在基础医学研究中的应用 造血祖干细胞扩增及保存 肿瘤的发生与发展 药物治疗机理的研究 基础免疫学的研究

　　应用FCM曾开展过的一此基础研究： ?胃癌及癌旁组织DNA、细胞凋亡、P- gp 、粘附分子检测的临床意义 ?哮喘患者氨茶碱诱导细胞凋亡的实验研究 ? NO与造血干细胞增殖活性关系的研究 ?中药 “清心饮”拆方治疗病毒性心肌炎机制的实验研究 ?中药治疗强直性脊柱炎的机理研究 ?氨氯地平治疗高血压的机理研究 ?葛根素对心肌细胞保护机制的实验研究 ?心脏移植后免疫排异反应监测的研究

　　细胞凋亡研究

　　亚二倍体 CD95(Fas, APO1) APO2.7 ANNEXIN V-PI 断裂点掺入

　　细胞周期分析---异倍体与凋亡峰

　　凋亡检测 Annexin V-PI双标记

　　BECKMANCOULTER流式新概念 ------INSIGHTOMETRY From Discovery to Diagnosis

　　完整的细胞分析---结构、功能、相互作用 血液学与流式细胞学的最佳结合 一切为了人类健康