基因组测序与序列组装.ppt

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　　标题： 4.基因组测序与序列组装

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 2

　　标题： 4.基因组测序与序列组装

　　正文： 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。基因组计划的终极目标是获得所研究的生物基因组的完整的DNA序列。 最佳状况是将物理图谱和遗传图谱进行整合，以确定基因以及其他重要的序列在基因组中的位置。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 3

　　标题： 4.基因组测序与序列组装

　　正文： 主要内容 4.1 DNA测序的方法 4.2 DNA序列的组装

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 4

　　第二代

　　Pacific 第三代 单分子测序仪 2013年

　　第一代

　　2007年

　　2006年

　　2005年

　　1977年

　　ABI solid

　　Illumina GA

　　Pacific 第三代 单分子测序仪 2013年

　　Roche 454

　　通量：600G

　　Illumina Hiseq2000

　　测序技术的发展历程

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 5

　　标题： 测序技术概况

　　正文： 从1977年第一代DNA测序技术 (Sanger发明双脱氧终止法)，发展至今四十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代、第四代，测序读长从长到短，再从短到长。 第二代测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置 2014年第三代测序技术，Pacific Biosciences SMAT测序仪。不过技术上还存在一些难题。 测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 6

　　标题： Frederick Sanger (1918-2013)曾经在1958年及1980年两度获得诺贝尔化学奖

　　正文： Sanger于1958年获得诺贝尔化学奖：蛋白质的结构，尤其是胰岛素的结构

　　Sanger于1980年再次获得诺贝尔化学奖：读取碱基序列

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 7

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 8

　　MegaBACE1000

　　第一代测序仪

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 9

　　标题： 第一代DNA测序技术——Sanger测序法

　　正文： DNA测序技术，起始于在20世纪70年代中期，用到 链终止法(chain termination method)，由Sanger和Coulson开创。通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的序列，合成的互补单链可在不同位置随机终止反应。此方法易于操作，可用于快速自动化测序。 或者 化学降解法(chemical degradation method)，由Maxam和Gilbert开创。将双链DNA分子用化学试剂处理，产生切口，用同位素标记确定序列。但是此方法的试剂含有毒性而有碍健康。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 10

　　标题： DNA 复制

　　正文： DNA复制需要4个基本条件：单链DNA模板、DNA聚合酶、可提供自由3’-OH的引物以及四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)。 双脱氧链终止法 与DNA的复制有关。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 11

　　(Gp:) O

　　(Gp:) 碱基

　　(Gp:) C

　　(Gp:) P

　　(Gp:) OH

　　(Gp:) H

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 5

　　(Gp:) O

　　(Gp:) 碱基

　　(Gp:) C

　　(Gp:) P

　　(Gp:) OH

　　(Gp:) H

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 5

　　(Gp:) OH

　　脱氧核苷酸(dNTP)的连接

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 12

　　(Gp:) O

　　(Gp:) 碱基

　　(Gp:) C

　　(Gp:) P

　　(Gp:) O

　　(Gp:) H

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 5

　　(Gp:) O

　　(Gp:) 碱基

　　(Gp:) C

　　(Gp:) P

　　(Gp:) OH

　　(Gp:) H

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 5

　　(Gp:) H2O

　　脱氧核苷酸(dNTP)的连接

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 13

　　(Gp:) O

　　(Gp:) 碱基

　　(Gp:) C

　　(Gp:) P

　　(Gp:) H

　　(Gp:) H

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 5

　　(Gp:) O

　　(Gp:) 碱基

　　(Gp:) C

　　(Gp:) P

　　(Gp:) OH

　　(Gp:) H

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 5

　　(Gp:) OH

　　X

　　?

　　双脱氧核苷酸(ddNTP)无法连接

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 14

　　标题： 链终止法

　　正文： 原理：采用相同的模板、相同的引物、相同的四种dNTP(其中一种或多种dNTP有32P标记)平行进行四组聚合反应，每组反应中分别加入一种ddNTP，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。 这四组DNA链再经过聚丙烯酰胺凝胶电泳，各自占据一个泳道，按链的长短分离开。被测DNA序列可以直接从凝胶中显示的位置信号直接读取。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 15

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 16

　　标题： 链终止法

　　正文： 双脱氧链终止法对DNA多聚酶的要求： 高酶活性 无5 ’-3 ’外切核酸酶活性，5 ’-3 ’外切核酸酶使DNA聚合酶去除已存在的链 无3 ’-5 ’ 外切核酸酶活性， 3 ’-5 ’外切核酸酶使DNA聚合酶校正自身错误 天然的DNA聚合酶不能满足，需要进行改造 Klenow聚合酶：来自大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，外切酶活性去除;但是酶活性不够，仅能合成250bp长度 测序酶Sequenase：现在广泛采用的，由噬菌体T7编码

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 17

　　标题： 链终止法

　　正文： 双脱氧链终止法要求单链作为模板： 将DNA克隆到质粒载体中：碱变性或热变性变为单链，双向测序;污染，干扰 以M13载体克隆单链DNA：无需变性，直接测序;>3kb，扩增时容易发生丢失与重排，小片段DNA测序 以噬菌粒(phagemid)克隆DNA：改造的质粒载体，2个复制起始点(质粒自身和 M13单链噬菌体)，在大肠杆菌细胞中产生单链噬菌粒， >10kb DNA测序 PCR产生单链DNA

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 18

　　PCR制备单链DNA

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 19

　　标题： 链终止法

　　正文： 双脱氧链终止法中引物的影响：引物决定了模板链的测序起点，一般来说，是采用克隆位点附近载体上的一段顺序。

　　A.通用引物：与载体DNA中附近插入片段的顺序退火，可引入新链的合成。 B.内部引物：提供一系列端部以及内部可完成长序列顺序的克隆。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 20

　　标题： DNA自动化测序

　　正文： Why? 由于DNA序列测定一次只能读出200-300个碱基，如果是对人基因组测序，需100个人，100多年才能完成，因为人类基因组大小为30亿bp。 DNA序列分析自动化包括两个方面的内容，一是指“分析反应”自动化。应该说这并不是影响DNA序列分析效率的主要问题，而且也是容易解决的。另一方面则是指“读片”过程的自动化，这才是问题的关键所在。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 21

　　标题： DNA自动化测序

　　正文： DNA序列分析自动化最主要的问题是：“读片”过程的自动化，需实时获得序列数据，采用的方法就是在电泳时实时检测凝胶中的DNA条带。 核苷酸荧光染料标记：4种ddNTP都标记上一个不同光谱的荧光基团。这样既能终止反应，又能把荧光标记连接到链终止的核苷酸上。 毛细管电泳技术：取代聚丙烯凝胶平板电泳，96个泳道，每次可同时进行96次测序，每轮实验不到2小时，1天可完成近千次反应

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 22

　　标题： 荧光染料标记物

　　正文： 以荧光颜色标记ddNTP，每种ddNTP各有一种颜色代表 只需要一组反应;免去了同位素标记必须同时进行4组反应的麻烦 整个反应在一个泳道中进行 当新和成的终止单链通过荧光检测仪时，可由光信号读出末端核苷酸并由电脑记录;加快了基因组测序的进程

　　(Gp:) ddNTPs-个有一种荧光颜色标记

　　(Gp:) 测序反应，产物分离

　　(Gp:) 显示系统

　　(Gp:) 检测

　　(Gp:) 荧光信号依次通过检测仪

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 23

　　标题： 第一代DNA测序技术——Sanger测序法

　　正文： 1977年，Sanger测定了第一个基因组序列：噬菌体X174，全长5375个碱基。自此，人类获得了窥探生命遗传本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。 研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。 优点：第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%。 缺点：但其测序成本高，通量低，严重影响了其真正大规模的应用。

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　　(Gp:) 罗氏 454 FLX+

　　(Gp:) illumina HiSeq2000

　　第二代DNA测序仪器

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　　标题： 测序芯片

　　罗氏454 illumina

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 26

　　标题： 第二代DNA测序技术

　　正文： 第二代测序技术：不依赖链终止法，做到连续测序。 细分为三种技术： Roche公司的454技术：焦磷酸测序法，是第一个商业化运营二代测序技术的平台。 illumina公司的Solexa，Hiseq技术：边合成边测序，是目前全球使用量最大的第二代测序机器。 ABI公司的Solid技术：链接酶法

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　　其他占位符： 直接对模板进行复制，不需加入ddNTP。 在Sanger法的基础上，对四种dNTP设置不同的荧光标记。 当DNA聚合酶合成新链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光。 通过捕捉荧光信号，并经过特定的计算及处理，就可以获得待测DNA的序列信息。

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 27

　　第二代DNA测序技术

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　　(Gp:) 引物

　　(Gp:) 模板

　　(Gp:) 降解

　　(Gp:) 降解

　　(Gp:) 降解

　　(Gp:) 化学发光

　　(Gp:) 化学发光

　　(Gp:) G

　　(Gp:) GA

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 28

　　焦磷酸测序：链合成反应在不存在ddNTP的情况下进行。 每种dNTP分别加入，如果dNTP未掺入到正在合成的链中，就被反应体系中的核苷酸酶降解。通过从dNTP上释放的焦磷酸盐所引起的化学发光来检测核苷酸的掺入。因此，就可以得到dNTP加入到合成链上的顺序。

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　　标题： 454技术发明者：乔纳森·罗森伯格(Jonathan Rothberg)

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 30

　　标题： 第二代DNA测序技术

　　正文： 序列产生速度比链终止法快>100倍。 精确地将反应混合物中重复的连续加入dNTP，很容易自动进行; 化学发光的检测很灵敏。 第二代测序技术最显著特点是高通量，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序。 大大降低测序成本;大幅提高了测序速度;保持高准确性。以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周。

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　　标题： 第二代测序仪功能

　　其他占位符： 未知及已知物种表达谱, 基因组测序 鉴定RNA可变剪切 环境(宏)基因组(Metagenomics)测序 不同PCR产物混合测序 DNA甲基化鉴定 小RNA,非编码RNA测序 染色质免疫共沉淀分析(chip-seq)

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　　标题： 后二代测序仪(半导体芯片测序仪)

　　其他占位符： 32

　　The content provided herein may relate to products that have notbeen officially released and is subject to change without notice.

　　For more information, visit lifetechnologies/ionsequencing

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　　其他占位符： 33

　　标题： The Chip is the Machine?

　　Scalability Simplicity Speed

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　　其他占位符： 34

　　Confidential and Proprietary—DO NOT DUPLICATE

　　标题： SNP Validation:Proving de novo SNPs with PGM

　　正文： 袋獾 First Publication to use Ion Torrent data A de novo tasmanian devil genome and assembly of a tumors was constructed SNPs that were unique for the tumor were validated with Ion PGM sequencing Data from Validation used to work out what percentage of the tumor was not from the host.

　　Mike Lehmann (GNU Free Documentation License) ://popsci/environment/article/2008-12/whats-down-under

　　Miller W. et al, 2011, PNAS, doi: 10.1073/pnas.

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　　其他占位符： 35

　　标题： Genomic characterization of an Outbreak strain E. coli O104:H4

　　正文： 5 days from starting sequencing to draft genome release via NCBI. Identified differences from previous outbreak strain

　　Mellman et al, 2011,PLoS One, doi: 10.1371/journal.pone.0022751

　　“The biggest advantage [of the PGM] from my point of view as a public health official is that it's speedy, and speed is what is needed at the moment,” Prof. Dr. Med Dag Harmsen, University Hospital Muenster

　　“[The PGM] takes the shortest time to generate genomic data.” Junjie Qin, BGI

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　　其他占位符： 36

　　标题： de novo assembly of an outbreak bacterial strain

　　正文： Authors describe a crowd sourced analysis of a sample from the German E. coli outbreak from 2010 Authors demonstrate speed of PGM "Initially, we sequenced the genome of the isolate from the 16-year-old girl (TY2482), using the Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM), and obtained an initial draft of the genome 3 days after receipt of the DNA sample. "? 7 runs generated 79MB data with an average read length of 101 bases using Ion 314 chip and chemistry from Q2 2010

　　Rohde H. et al , 2011,NEJM, doi: 10.1056/NEJMoa1107643

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 37

　　标题： 第三代DNA测序技术

　　正文： 2004年，美国国家人类基因组研究所启动了两个旨在大幅度降低DNA测序费用的研究计划： 第一期，研发一种高速低价的DNA测序方法，是单个人类基因组的测序费用降低到100,000美元 第二期，研发一种超速低价的DNA测序方法，是单个人类基因组的测序费用降低到1000美元 这一宏伟的测序计划催生了第三代测序技术：旨在更加大幅度的降低测序成本。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 38

　　标题： 第三代DNA测序技术

　　正文： 第三代测序技术旨在更加大幅度的降低测序成本。 PacBio公司的SMRT：也应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体 Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术：基于电信号而不是光信号的测序技术 Ion Torrent：基于半导体芯片的新一代革命性测序技术 与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 39

　　标题： Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术

　　设计了特殊的 纳米孔蛋白质

　　当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度(每种碱基产生不同的电阻)，灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 40

　　标题： Ion Torrent 基于半导体芯片的测序技术

　　正文： 该技术使用了一种布满小孔的高密度半导体芯片， 一个小孔就是一个测序反应池。当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA链上时，会释放出一个氢离子，反应池中的PH发生改变，位于池下的离子感受器感受到H+离子信号，H+离子信号再直接转化为数字信号，从而读出DNA序列。

　　这一技术的发明人同时也是454测序技术的发明人之一——Jonathan Rothberg，它的文库和样本制备跟454技术很像，甚至可以说就是454的翻版，只是测序过程中不是通过检测焦磷酸荧光显色，而是通过检测H+信号的变化来获得序列碱基信息。 成本相对来说会低，速度也相当快速，非常适合小基因组和外显子验证的测序。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 41

　　标题： 测序技术的比较

　　正文： 测序成本，读长和通量是评估测序技术先进与否的三个重要指标。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 42

　　标题： 测序技术的比较

　　正文： 测序成本，读长和通量是评估该测序技术先进与否的三个重要指标。 第一代测序技术：链终止法。成本大，通量低，读长1kb。 第二代测序技术：不依赖链终止法，做到连续测序。优点是成本较第一代大大下降，通量大大提升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。 第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，同时提高读长，并要保持二代技术的高通量，低成本的优点。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 43

　　标题： 测序仪全球分布 (://omicsmaps/)

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 44

　　标题： 测序公司

　　正文： 高通量测序技术在动植物研究领域中的应用 ://life.scichina:8082/sciC/CN/abstract/abstract506659.shtml#

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 45

　　标题： 4.基因组测序与序列组装

　　正文： 主要内容 4.1 DNA测序的方法 4.2 DNA序列的组装

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 46

　　标题： 4.2 DNA序列的组装

　　正文： 将大量短的DNA序列进行组装 (sequence assembly) 几乎是近年来第二代、第三代高通量测序中最热门的话题。 简单来说，就是把基因组长长的序列打断 (shotgun sequencing)，因为我们不知道基因组整条序列是如何排列(成一条链，最后成为一条染色体)组合的，而我们又无法实现一次把整条长序列完整测序(即使目前的第三代单分子测序也是暂时面向小基因组)。 然后，我们通过算法，计算机的帮助，把这些短的序列组装起来成为一条完整有序的序列。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 47

　　标题： 短序列组装的基本流程

　　(Gp:) 测序出来的短序列 (reads)

　　(Gp:) 寻找互相重叠的短序列

　　(Gp:) 将互相重叠的短序列拼 接成contigs (重叠群)

　　(Gp:) 重叠群

　　(Gp:) 利用BAC末端序列将重叠群 (contigs)拼接成支架 (scaffolds)

　　(Gp:) 支架

　　(Gp:) 将支架连接成基因组草图，甚至是完成图

　　正文： 术语 BAC末端序列 (BAC-end sequence)：一个BAC克隆插入片段两端的已测序的序列，不包括内部序列，可用于确定BAC的排列和重叠群 (contig)在支架 (scaffold)中的排列方向。 测序覆盖度：基因组上一个碱基位点被短段序列覆盖的平均次数。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 48

　　标题： 序列组装的术语

　　正文： BAC末端序列 (BAC-end sequence) 一个BAC克隆插入片段两端的已测序的序列，不包括内部序列，可用于确定BAC的排列和重叠群 (contig)在支架 (scaffold)中的排列方向。 重叠群 (contig) 一群相互重叠的克隆或DNA序列，包括连续的或不连续的DNA序列。 支架 (scaffold) 一组已经锚定在染色体上的重叠群，内部含间隙或不含间隙。 草图序列 (draft sequence) 人类基因组计划定义为经Phred Q20软件认可的覆盖测序克隆片段3-4倍的DNA序列，含间隙或无间隙，排列方向和位置未定。 完成序列 (finished sequence) 已完成测序的任何一个克隆或基因组的序列，它们是连续的，不含任何内部间隙，误差率少于0.01%

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 49

　　标题： 序列间隙和物理间隙

　　正文： 任何基因组测序都不可避免会出现序列间隙和物理间隙 序列间隙 (sequence gap)：测序时遗漏的序列，这些序列依然保留在尚未挑选到的克隆中。可从基因组文本库中进一步筛选遗漏的克隆予以填补。 物理间隙 (physical gap)：构建基因组文库时被丢失的DNA序列，它们从已有的克隆群体中永久性地消失。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 50

　　标题： 填补序列间隙

　　正文： 重叠群1和2之间的间隙位于单个DNA克隆的配对端点序列中(配对端点序列是一对来源于单个DNA克隆两末端的微小序列)，因此可以通过对DNA克隆进一步测序来填补序列间隙。

　　(Gp:) 拼接好的序列

　　(Gp:) 覆盖间隙的DNA克隆

　　(Gp:) 采用内部引物完成测序， 填补序列间隙

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 51

　　标题： 填补物理间隙 (两种策略)

　　(Gp:) 合成寡聚核苷酸引物1,2,3等

　　(Gp:) 策略1：用寡聚核苷酸构建第2个克隆文库

　　(Gp:) 策略2：以成对的寡聚核苷酸进行PCR筛选

　　(Gp:) 结论：重叠群1和4应该相连

　　寡聚核苷酸1和7能够扩增

　　寡聚核苷酸1和7与同一克隆杂交，说明该克隆跨越重叠群1和4间隙两侧的序列

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　　其他占位符： 寡聚核苷酸，是一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸)，寡核苷酸可以很容易地和它们的互补链结合，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用於基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 52

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 53

　　(Gp:) 克隆重叠群 指导的测序 图4.15

　　(Gp:) 全基因组直接鸟枪法测序 图4.16

　　(Gp:) 基因组物理图

　　(Gp:) 序列组装

　　(Gp:) 序列组装

　　(Gp:) DNA片段内部用鸟枪法测序

　　(Gp:) 序列的物理位置已知

　　(Gp:) 用分子标记来确定组装序列在基因组学还是那个的位置

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 54

　　标题： 作图法测序 (克隆重叠群测序)

　　正文： 首先构建基因组物理图或遗传图，然后按图索骥，逐段完成测序。 基本单元是大分子DNA克隆，如BAC或PAC。 根据基因组物理图上已知的克隆，从中挑取待测的成员进行测序。 大肠杆菌、酵母、线虫基因组的序列都是通过克隆重叠群测序完成的。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 55

　　标题： 全基因组鸟枪法测序

　　正文： 20世纪90年代，随着DNA大规模自动化测序技术和超级计算机的出现，美国Celara Genomics公司首创鸟枪法测序路线，在没有任何遗传图和物理图信息的情况下，对基因组进行测序，于1995年第一次应用于流感嗜血杆菌基因组。 2000年，果蝇是第一个完全采取鸟枪法完成基因组测序的真核生物，180Mb。 2001年，Celera Genomics在1年内用鸟枪法完成了人类基因组测序和序列组装。而另一个组织——“国际人类基因组计划”采用的是作图法测序来绘制人类基因组草图。 2002年中国华大基因研究中心在绘制籼稻基因组工作框架图的过程中，采用的是全基因组鸟枪测序法。植物基因组有大量的重复序列，重复序列的正确识别和组装，因此需要开发特殊的计算软件。

　　Craig Venter： Celera Genomics 主席兼首席科学家

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 56

　　标题： 全基因组鸟枪法测序的主要特征

　　正文： 在全基因组范围内进行随机克隆与重叠群构建，与作图法测序(如BAC克隆内重叠群构建)相比，会产生比率高得多的间隙。 鸟枪法测序计划中最费时的地方是将单个序列重叠通过填补序列间隙和物理间隙而连接在一起。 为了使需要填补的间隙数量降到最低，全基因组鸟枪法需要利用至少两个不同类型载体构建的克隆文库。

　　重点

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 57

　　正文： 小米基因组测序用到四种不同类型的克隆载体，采用全基因组鸟枪法测序，测序技术是Sanger ABI3730xl。

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 58

　　标题： 教材上其它基因组测序的例子

　　正文： 85页-87页 流感嗜血杆菌基因组测序与序列组装 (全基因组鸟枪法) 水稻基因组测序

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　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 59

　　标题： 全基因组鸟枪法测序的主要特征

　　正文： 使用多种克隆载体的原因 不同的克隆载体含有的克隆片段可以互补，尽量覆盖更多的物理基因组序列。如此一来，在序列拼接的时候，大文库的构建可以很好地填补小文库造成的序列间隙或物理间隙 (教材图4.15)。 涉及到重复元件所引起的序列组装问题。

　　60张

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 60

　　标题： 全基因组鸟枪法测序的优势与局限

　　正文： 优点：速度快，无需提供相关的遗传图与物理图。 缺点：如果基因组太大，结构过于复杂，序列组装的起始阶段工作量非常大。 对于全基因组鸟枪法绘制的人类基因组草图和“国际人类基因组计划”作图法公布的草图进行对比后发现：鸟枪法无法检测到人类基因组中重复出现的DNA片段，这些片段占基因组的3%-5%，对于理解遗传性疾病非常重要。

　　61张

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 61

　　正文： 全基因组鸟枪法得到的序列可能达不到预期的标准程度。部分问题是序列产生的随机性。意味着基因组的某些部分被测序产生的微小片段覆盖很多次，而其他部分只能被覆盖一次或者两次。 一般基因组上每个位点被短序列覆盖>8次有利于后续的组装精确度。

　　(Gp:) 基因组序列

　　(Gp:) 测序产生的微小片段(reads)

　　62张

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 62

　　标题： 两种测序方法总结

　　鸟枪法测序的策略

　　作图法测序的策略

　　不需要所测序基因组的背景信息，如遗传图与物理图

　　构建克隆群 (遗传、物理图谱)，需要几年的时间

　　速度快，需要大型计算机，得到的是基因组的草图

　　耗时长，能够得到精细的基因组图谱

　　缺点：如果基因组太大，结构过于复杂，序列组装的起始阶段工作量非常大。

　　缺点：耗时长，主要是时间的问题。

　　重点

　　63张

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 63

　　标题： 人类基因组计划相关的重大事件

　　正文： 1987年，第一份人类遗传连锁图发表。 1988-1993年，自动PCR仪诞生，BAC和PAC克隆技术问世。 1990年10月，国际人类基因组计划正式启动，预计用15年完成。 1995年，第一个原核基因组—流感嗜血杆菌的全序列发表，大小为1.8Mb。人类基因组YAC重叠群物理图和STS物理图发表。 1996年，第一个真核生物——酿酒酵母的基因组全部测序完成。 1997年9月，大肠杆菌基因组全部测序完成，全长5Mb;同月毛细管测序仪出现。 1998年，第一个多细胞生物——线虫基因组完成。 2000年，人类基因组计划完成，存在大量尚需填补的间隙。 2003年，人类基因组草图序列中绝大多数间隙已被填补。 2004年12月，人类基因组完成序列，覆盖99%的常染色质区。 2002年，第一个谷类作物——水稻基因组草图完成。 2005年，发表黑猩猩基因组草图序列。

　　64张

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 64

　　标题： 人类基因组计划相关的重大事件

　　正文： 2012年，完成人类基因组“DNA成分百科全书”数据库计划(ENCODE)。 2012年，国际千人基因组计划(1000 Genomes)。 2016年，Simons基金会人类多样性群体的基因组计划启动。 2016年，美国政府宣布启动“国家微生物组计划”。

　　65张

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 65

　　标题： 人类基因组测序中的伦理问题

　　正文： 基因专利问题：DNA序列的归属，人类基因组信息包含非常可观的经济利益，基因序列指导新药的开发、针对癌症或其他疾病的治疗方案。 个人DNA序列的隐私权，如：“此等”基因携带者可能受到歧视，职业限制，医疗保险等问题。 必须足够谨慎以确保基因组序列不被应用于某个个人;要保证匿名。

　　66张

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 66

　　正文： 影星安吉丽娜.朱莉通过基因检测，选择手术切除乳腺以降低患乳腺癌风险; 2011年去世的苹果公司创始人史蒂芬.乔布斯患癌时，也曾接受过全基因测序。 近年来，基因测序近年来因“名人效应”广泛应用于高端体检(如健康状态评价，癌变早期检测)、产前诊断(如遗传性疾病预测)等领域，价格不菲。有些宣称个人全基因测序的体检项目，收费高达数万元。

　　67张

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 67

　　标题： 基因组计划现状

　　68张

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 68

　　标题： 基因组计划现状

　　69张

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 69

　　标题： 作业

　　正文： 名字解释： 测序覆盖度，物理间隙，序列间隙 简答题 假如你有能力制备这些不同插入片段大小的克隆载体：2kb质粒，4kb质粒，40kb质粒，fosmid，BAC，YAC。你打算进行某一个真核生物的全基因组鸟枪法测序。那么你希望从中选择哪种或那几种类型的载体，提交给测序公司进行测序? 三代测序技术各自的核心内容是什么? 在链中止法中，双脱氧核苷酸的功能是什么?

　　70张

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 70

　　标题： 作业

　　正文： 论述题 简述鸟枪法测序与作图法测序有何优缺点? 图形测试 测序序列进行拼接后，会出现两种间隙：序列间隙和物理间隙。那么下面这个图是在尝试填补哪一种间隙?

　　(Gp:) 质粒或λ克隆

　　(Gp:) 配对末端 序列

　　(Gp:) 配对末端 序列

　　71张

　　其他占位符： 基因组学概论

　　其他占位符： 71

　　人类基因组计划 (Human Genome Project, HGP) 的后基因组时代