第十四章 基因重组与基因工程.ppt
1615251280解决。
基因信息的传递
第三篇
(Gp:) 生物化学与分子生物学教研室
(Gp:)
生物化学
第三篇 基因信息的传递
(Gp:) RNA的生物合成 (转录,transcription) 蛋白质的生物合成 (翻译,translation)
(Gp:) DNA的生物合成 (复制,replication)
(Gp:) 基因表达调控 (control of gene expression)
(Gp:) 基因表达 (gene expression)
(Gp:) 基因重组与基因工程 (genetic recombination and engineering)
2
3
中心法则(The Central Dogma)
(Gp:) 复 制
(Gp:) 转录
(Gp:) DNA
(Gp:) RNA
(Gp:) 蛋白质
(Gp:) 翻译
(Gp:) 逆转录
4
Genetic Recombination & Genetic Engineering
基因重组与基因工程
第十四章
主要内容： 第一节 DNA的重组 第二节 重组DNA技术 第三节 重组DNA技术与医学的关系
第 一 节 DNA的重组 DNA Recombination
DNA的重组
概念: 指在DNA分子内或分子间，通过片段交换或转移，形成遗传物质重新组合的现象。
接合作用 (conjugation)
转化作用 (transformation)
转导作用 (transduction)
转座重组 (transposition)
同源重组 (homologous recombination)
特异位点的重组(site-specific recombination)
方式:
DNA的重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组，又称基本重组(general recombination)。是最基本的DNA重组方式。 通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
一、同源重组 ——最基本的DNA重组方式
E.Coli的同源重组 Holliday模型 1964 R. Holliday提出
参与蛋白质与酶：Rec A、B、C、D蛋白 和DNA连接酶 Rec A 结合单链DNA，形成Rec A-ssDNA复合物 置换同源序列区的同源链 Rec BCD蛋白复合物 核酸酶及解螺旋酶活性
Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤。
Holliday模型:
①两个同源染色体DNA排列整齐; ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体; ③通过分支移动产生异源双链DNA; ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：
(Gp:) 片段重组体(patch recombinant)
(Gp:) 拼接重组体(splice recombinant)
片段重组体: 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。
拼接重组体: 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。
(Gp:) 内切酶 (recBCD)
(Gp:) DNA侵扰 (recA)
(Gp:) 分支迁移 (recA)
(Gp:) 内切酶 (recBCD)
(Gp:) DNA 连接酶
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
Holiday中间体
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
目 录
(Gp:) Holiday中间体
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 5′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 3′
(Gp:) 内切酶 (ruvC)
(Gp:) 内切酶 (ruvC)
(Gp:) DNA 连接酶
(Gp:) DNA 连接酶
片段重组体
拼接重组体
目 录
二、细菌的基因转移与重组
方式： 接合作用 转化作用 转导作用 细胞融合
(一)接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌)的DNA转移称为接合作用(conjugation)。
可接合质粒如 F 因子(F factor)
质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子
(二)转化作用
通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。
例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。
(三)转导作用
当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次感染另一(供体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。
λ噬菌体的生活史
溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
例:
目 录
溶菌生长途径: 噬菌体DNA在宿主菌内迅速增殖，产生新的病毒颗粒，并溶解细菌、释放出新生噬菌体的过程。 溶源菌生长途径： 噬菌体DNA整合进宿主染色体，随宿主DNA的复制而被动复制的过程。
接合作用
转化作用
转导作用
方式:
细菌的DNA重组
→→→质粒DNA
→→→外源DNA
→→→病毒(DNA)
概念： 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。
三、特异位点重组
例： (一)λ噬菌体DNA的整合 λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合。
机制：噬菌体与宿主的重组位点存在 相同的核心序列。
例(二)细菌的特异位点重组
沙门杆菌H片段倒位决定鞭毛相转变
鞭毛相转变： 单菌落的沙门氏菌中出现少数呈 另一 H 抗原的细菌的现象。
H片段： 本质 一段995bp的 DNA; 结构 两个启动子 启动子中间的hin基因 两端的反向特异重组位点(hix)
例(二)细菌的特异位点重组
沙门杆菌H片段倒位决定鞭毛相转变
例(三)免疫球蛋白基因的重排
免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成; 分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(?和?)，一个编码重链。
轻链
重链
基因 片段
前导 可变 多样性 连接 恒定 片段 片段 片段 片段 片段
L V J C
L V D J C
免疫球蛋白重链基因 由可变基因(VH)和恒定基因(CH)构成，通过选择性转座和重组，表达出不同免疫球蛋白重链，对付不同的抗原。
四、转座重组
概念： 由插入序列和转座子介导的基因 移位或重排称为转座(transposition)。
可移动的DNA序列：插入序列和转座子介导
组成： 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列; 一个转座酶(transposase)编码基因;
(Gp:) IR
(Gp:) Transposase Gene
(Gp:) IR
(一)插入序列转座
插入序列(insertion sequences, IS)
本质：750～1500bp的DNA片段
IR侧翼有特异的正向重复序列。
发生形式： 保守性转座(conservative transposition)： 插入序列由原位移至新位。 复制性转座(duplicative transposition)： 插入序列复制后，一个保留在原位，一个移至新位。
插入序列(insertion sequences, IS)
插入序列的复制性转座
目 录
转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点分散的重复序列，即一段可以发生转座的DNA。 转座子组成：反向重复序列 转座酶基因 抗生素抗性等有用的基因
(Gp:) IR
(Gp:) IR
(Gp:) Transposase Gene
(Gp:) 有用基因
(二)转座子转座
接合作用
转化作用
转导作用
转座重组
同源重组
特异位点的重组
方式:
DNA的重组
最基本的方式
细菌的DNA重组
整合酶
插入序列与转座子
第 二 节 重组DNA技术
DNA Recombination Technique
——DNA克隆、分子克隆
重组DNA技术发展史 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术的操作步骤
本节主要内容
重组DNA技术的发展史
1868年，瑞士外科医生Miescher 发现核酸 1944年，Avery进行肺炎球菌转化实验 1973年，美国斯坦福大学的科学家构建第一个 重组 DNA分子。 1977年，美国南旧金山由博椰和斯旺森建立世界 第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA 技术制造医学上重要的药物。 1980年，开始建造第一家应用重组DNA技术生产 胰岛素的工厂。 1997年，英国罗林研究所成功地克隆了多莉。
一、重组DNA技术相关概念
克隆(clone) 原意是指单细胞纯系无性繁殖。 现代概念是将实验得到的人们所需的微量基因结构，引入适当的宿主细胞中去。在合适的生理环境中进行无性繁殖，从而利用宿主的生理机制繁衍人们所需要的基因结构，并进行表达。 即来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。
(一) DNA克隆
技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆(动物或植物)
由于整个操作在分子水平上进行，所以 称为分子克隆(molecular cloning)。
DNA克隆： 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA 。
在体外通过人工剪、接，将不同来源的DNA分子组成一个杂合DNA分子(DNA分子重组体)，然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程。由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。 基因工程的基本特点，分子水平操作，细胞水平表达。
基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等
基因工程目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ; ② 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)。
在这个过程中： 1.“基因剪刀” 剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起 3.“交通工具” 使用载体好比一辆车子 4.“乘客” 有用基因如IL2好比使乘客，车子把乘客送进理想天堂(宿主细胞)去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治疗(IL2/LAK→抗癌)。
(二)工具酶
限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶
重组DNA技术中常用的工具酶
限制性核酸内切酶
1、定义： 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
(Gp:) GGATCC CCTAGG
(Gp:) G CCTAG
(Gp:) GATCC G
+
Bam HⅠ
2、限制性内切酶的命名和分类：
限制性内切酶的命名是根据含有该酶的微生物种属而定。
书写时用斜体的3个字母缩略语表示。
(1)命名方法：
第一个 大写 取自细菌属名的第一个字母
斜体的3个字母：
第二、三个 小写 取自细菌种名的头两个字母
若有株名 再于其后加一大写字母表示
若同一菌株有几种限制性内切酶 根据其发现和分离先后顺 序用罗马数字加以区分
先后分离到了3种限制性内切酶，分别被命名为HindⅠ、HindⅡ和Hind Ⅲ
如：副流感噬血杆菌
(haemophilus parainfluenzase)
H
in
d
Ⅰ
代表Haemophilus属
代表influenzae种
代表 d 株
代表被分离的次序
(2)分类方法：
根据限制性内切酶的组成、辅助因子及切割DNA的方式不同分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型三类。
与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
3、限制性内切酶的功能和特性
(1)识别序列
大多数Ⅱ型酶识别4～6个具有反转对称结构的特异核苷酸序列，这种特殊的结构序列称回文结构(palindrome)。
5‵ ………GGATCC……… 3‵ 3‵....……CCTAGG……… 5‵
(2)内切频率
识别序列为n个核苷酸时，切割频率为1/4n
如：
4个核苷酸的切点为256(44)bp出现一次
6个核苷酸的切点约4096(46)bp出现一次
(3)内切末端
粘性末端： 有些酶解产物双链末端一条链 多出一个至几个核苷酸，形成 突出的末端。
均产生含5?-磷酸基和3?-羟基的末端
有些酶切割后产生平头或钝性末端
①产生3 ?突出粘性末端 :以 EcoR Ⅰ为例： 5' …GAATTC..3' →5' …Gp? OH-TTAAC…3' 3' …CTTAAG..5' →3' …?CTTAA-OH?? pG…5' ②产生5 ?突出的粘性末端：以 PstⅠ为例： 5' …CTGCAG…3' → 5' …CTGCAp? OH-G…3' 3' …GACGTC…5' → 3' …G-OH? pACGTC…5' ③产生平末端 : Alu Ⅰ为例： 5' …AGCT…3' →5' …AGp OH-CT…3' 3' …TCGA…5' →3' …TC-OH pGA…5'
举例：
同功异源酶： 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶(同裂酶)。
(Gp:) GGATCC CCTAGG
(Gp:) G CCTAG
(Gp:) GATCC G
+
Bam HⅠ
(Gp:) GGATCC CCTAGG
(Gp:) G CCTAG
(Gp:) GATCC G
+
BstⅠ
同尾酶： 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。
Bam HⅠ
Bg lⅡ
(Gp:) GGATCC CCTAGG
(Gp:) AGATCT TCTAGA
(Gp:) G CCTAG
(Gp:) GATCC G
+
+
(Gp:) A TCTAG
(Gp:) GATCT A
(三)目的基因
目的基因指分离制备或人工合成的特定外源基因片断(DNA片段)。
指用重组DNA技术要获得的特定基 因或特定基因的表达产物—蛋白质，这些特定基因称为目的基因。
(三)目的基因
种类：
cDNA (complementary DNA)： 基因组DNA (genomic DNA)：
指经反转录合成、与RNA互补的单链DNA。
指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。
载体是携带靶DNA片段进入受体细胞进行扩增和表达的工具，没有载体，外源DNA是难以进入受体细胞发挥作用的。
1 、定义：
载体本身也是具有某些特性的DNA分子。
(四)基因载体
(四)基因载体
质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
来源
2、常用载体：
功能
克隆载体 表达载体
克隆载体(cloning vector)： 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) ： 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
(1) 质粒 (plasmid)
特点： 能在宿主细胞内独立自主复制;带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的小型双链环状DNA分子。
目 录
复制方式：
对复制的控制没有如此严格，在一个细胞内 的拷贝数，可达数十个至数百个。
严紧复制型质粒：
在基因工程中应用有限，复制时受到严格控 制，每个细胞只有一个或数个拷贝。
松弛复制型质粒：
噬菌体是以细菌作为宿主细胞的病毒，通常是线性双链DNA。
常用作基因工程载体的噬菌体有?噬菌体和M13噬菌体。
(2)噬菌体 (phage)
λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列(插入型，适用cDNA克隆) EMBL系列(置换型，适用基因组克隆)
(2)噬菌体 (phage)
M13噬菌体DNA改造系统(含lacZ基因) M13mp系列 pUC系列
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 (如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒)
(3)其他
二、重组DNA技术基本原理
(Gp:) 基本原理：
(Gp:) 目的基因的获取
(Gp:) DNA导入受体菌
(Gp:) 外源基因与载体的连接
(Gp:) 克隆载体的选择和构建
(Gp:) 重组体的筛选
(Gp:) 克隆基因的表达
SS基因
基因载体
重组体
分
切
接
转
筛
表
SS
(一)目的基因的获取
1、 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2、基因组DNA文库(genomic DNA library) 3、cDNA文库(cDNA library) 4、聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
* 化学合成法获取目的基因
DNA合成仪
已知核苷酸序列
目的DNA
* 化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
组织或细胞染色体DNA
基因片断
克隆载体
重组DNA分子
含重组分子的转化菌
限制性内切酶
受体菌
基因组DNA文库： 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。
* 从基因组DNA文库获取目的基因
目 录
(Gp:) 限制酶切位点
(Gp:) 限制酶消化
(Gp:) 除去中间片段
(Gp:) cos L
(Gp:) R cos
(Gp:) cos L 左臂
(Gp:) R cos 右臂
(Gp:) 真核生物染 色体DNA
(Gp:) 限制酶部分消化
(Gp:) 外源DNA与载体DNA混合
(Gp:) 连接反应
(Gp:) 体外包装
(Gp:) 用重组噬菌体 感染大肠杆菌
(Gp:) ~20 Kb DNA 片段
(Gp:) cos L
(Gp:) R cos
(Gp:) ~20 Kb 外源 DNA 片段
(Gp:) 基因文库
目 录
图14-11 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库
(Gp:) mRNA
(Gp:) cDNA
(Gp:) 双链cDNA
(Gp:) 重组DNA分子
(Gp:) cDNA文库
(Gp:) 反转录酶
(Gp:) 载体
(Gp:) 受体菌
(Gp:) 复制
(Gp:) * 从cDNA文库获取目的基因
(Gp:) 逆转录酶
(Gp:) A A A A
(Gp:) T T T T
(Gp:) AAAA
(Gp:) SI核酸酶
(Gp:) DNA聚合酶Ⅰ
(Gp:) 碱水解
(Gp:) T T T T
目 录
图14-12 构建cDNA文库示意图
组织或培养细胞
mRNA
cDNA
载 体
cDNA与载体DNA连接
导入大肠杆菌
鉴定cDNA文库的克隆数与特性
DNA
利用了DNA的变性、复性和复制的机制：
加热
退火、延伸
单链DNA
复制的DNA双链
引物、dNTP
聚合酶
* 利用PCR技术获取目的基因
PCR(polymerase chain reaction ):
即聚合酶链式反应技术，是一种选择性体外快速扩增特定核酸片段的技术。
PCR测序反应示意图
PCR的基本原理
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
模板DNA
第1轮扩增
第2轮扩增
第3轮扩增
第4轮扩增
第5轮扩增
第6轮扩增
聚合酶链式反应(PCR)
目的基因
基因载体
重组体
(二)克隆载体的选择和构建
选择和构建合适的载体是基因工程成功的关键步骤。
载体的选择和构建要根据基因工程的目的。
(三)外源基因与载体的连接
将目的基因或序列插入载体，主要靠DNA连接酶 。
方法： 1、粘性末端的连接 2、平端连接 3、同聚物加尾连接法 4、人工接头连接
1、粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接
条件: 末端碱基序列互补
Bam HⅠ切割反应
(Gp:) GGATCC CCTAGG
T4 DNA连接酶 15oC
(Gp:) GATCC G
(Gp:) G CCTAG
(Gp:) +
(Gp:) 目的基因用 Bam HⅠ切割
(Gp:) 载体DNA用Bam HⅠ切割
(Gp:) 重组体
(Gp:) 载体自连
(Gp:) 目的基因自连
同一限制酶切位点连接
目 录
不同限制酶切位点(配伍末端)的连接
Mbo Ⅰ切割位点
BamH Ⅰ切割位点
配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。
目 录
(Gp:) GATC CTAG
(Gp:) G GATCC CCTAG G
(Gp:) CTAG
(Gp:) GATCC G
(Gp:) GATCC CTAGG
2、平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端
(Gp:) 目的基因
(Gp:) 载体
(Gp:) 限制性内切酶
(Gp:) 限制性内切酶
(Gp:) T4 DNA连接酶 15oC
(Gp:) 重组体
(Gp:) 载体自连
(Gp:) 目的基因 自连
限制性内切酶切割产生的平端
粘端补齐或切平形成的平端
3、同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。
同聚物加尾连接
4、人工接头(linker)连接
人工接头是用人工合成的一段双链寡核苷酸，大小一般为8 ?12bp，内含某种限制酶的酶切位点。 接头连接在DNA片段和载体的平端，用相应的内切酶切成具有互补的粘性末端后再连接成重组子。
人工接头及其应用
(Gp:) CCGAATTCG GGCTTAAGC
(Gp:) 5′- 3′-
(Gp:) Eco RⅠ
(Gp:) Eco RⅠ
(Gp:) Eco RⅠ
(Gp:) Eco RⅠ
目 录
受体菌条件： 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent)
(四)重组DNA导入受体菌
目的基因与载体在体外重组后要导入受体细胞才能进行扩增和表达。 受体细胞包括原核细胞和真核细胞两类。
在分子生物学和基因工程工作中可采取 一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易 接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源 DNA接触，就能提高转化效率。
导入方式： 转化(transformation) 转染 (transfection) 感染(infection)
感受态细胞：
1、转化 由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化，但DNA进入细胞的效率很低。
方法：
CaCl2处理：大肠杆菌经冰冷CaCl2的处理， 就成为 感受态细菌，当加入重组质粒后，突然由4℃转入 42℃作短时间处理，质粒DNA就能进入细菌。 电穿孔转化法：用高电压脉冲短暂作用于细菌也能 显著提高转化效率 。 微注射法：微注射器，每一次只能注射一个细胞。
重组的噬菌体DNA也可以质粒DNA的方 式进入宿主菌，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等 处理成感受态细菌再接受DNA， 进入感受态细菌 的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称 为转染 。
2、转染
3、感染
噬菌体进入宿主细菌、病毒进入 宿主细胞中繁殖就是感染.
1、用人工改造的噬菌体活病毒作载体， 以 其DNA与目的序列重组， 2、在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组 DNA包装成有活力的 噬菌体或病毒， 3、以感染的方式进入宿主细 菌或细胞，使 目的序列得以复制繁殖。效率很高， 4、但DNA包装成噬菌体或病毒的操作麻烦。
感染过程：
(五)重组体的筛选
筛选(screening)是从大量细胞 克隆中，得到含有目的基因的阳性重 组子细胞或菌落的过程。 可以针对含重组体细胞的表型改 变，蛋白质产物或目的基因的存在设 计相应的检测方法。
方法： 1、直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 2、免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等
(1)抗药性转入获得 利用携带某种抗药性标志基因的克隆载体进行筛选，只有含这种抗药基因的转化细菌才能在含该抗生素的培养基上生存并形成菌落，从而区别转化菌和非转化菌。 如质粒pBR322: 含氨苄青霉素抗性基因 (ampr)和四环素抗性基因(terr )。
(插入失活法) 抗药性标记选择
目 录
(2)标志补救 是利用重组DNA和受体细胞之间基因产 物的互补性来筛选重组体的方法。 如酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因、pUC 质粒载体。
组氨酸缺陷 型大肠杆菌
无组氨酸 的培养基
酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因
促进组氨酸合成
λDNA
重组体
标志补救
目 录
α 互补的检测
目 录
(3)分子杂交法 是利用探针与转移至硝酸纤维素膜上的 DNA片段进行分子杂交。 探针：放射性如32P标记，且与目的基因同源。 如：原位杂交、Southern blot。
原位杂交
目 录
Southern blot
目 录
鸡的β肌球蛋白的克隆和检出
目 录
重组DNA技术操作过程可形象归纳为:
小 结
(Gp:) 分
(Gp:) 分离目的基因
(Gp:) 切
(Gp:) 限制酶切目的基因与载体
(Gp:) 接
(Gp:) 拼接重组体
(Gp:) 转
(Gp:) 转入受体菌
(Gp:) 筛
(Gp:) 筛选重组体
重组DNA技术操作的主要步骤
(Gp:) 载体
(Gp:) 质粒
(Gp:) 噬菌体
(Gp:) 病毒
(Gp:) 目的基因(外源基因)
(Gp:) 基因组DNA
(Gp:) cDNA
(Gp:) 人工合成
(Gp:) PCR产物
(Gp:) 限制酶消化
(Gp:) 开环载体DNA
(Gp:) 目的基因
(Gp:) 连接酶
(Gp:) 重组体
(Gp:) 转化
(Gp:) 体外包装，转染
(Gp:) 带重组体的宿主
(Gp:) 筛选
(Gp:) 表型筛选
(Gp:) 酶切电泳鉴定
(Gp:) 菌落原位杂交
目 录
表达体系的建立: 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化
(六)克隆基因的表达
1、 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用) 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足： ①不宜表达真核基因组DNA ②不能加工表达的真核蛋白质 ③表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 ④很难表达大量可溶性蛋白
大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌
目 录
优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济
2、真核表达体系 酵母、昆虫、哺乳类动物细胞
表达载体pFASTBACI 的物理图谱
目 录
(一)疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。
第三节 重组技术与医学的关系
(二)生物制药
如：Lesch-Nyhan综合症
动物药厂 通过转基因动物生产感兴趣的基因 ↓ 把YFG放在β—乳球蛋白的启动子下 ↓ 注入羊卵细胞→植入借腹怀孕的母羊体内 ↓ YFG在乳腺中表达 ↓ 乳汁中提纯YFG蛋白。
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囊性纤维变性是一种遗传病，患者体内会产生粘稠的粘液，阻塞肺部、胰腺和消化器官的内部通道，大约有一半的患者活不过31岁。英国PPT公司培育了植入人体基因的克隆羊，羊奶中含有能够治疗囊性纤维变性的人体蛋白。 维尔莫特所在的研究所曾向德国一家药厂出售一头这样的转基因羊，获得50万英镑。
重组DNA医药产品
(Gp:) 预防霍乱
(Gp:) 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗
(Gp:) 预防乙肝
(Gp:) 乙肝疫苗(CHO, 酵母)
(Gp:) 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗
(Gp:) 单克隆抗体
(Gp:) 抗组织损伤
(Gp:) 超氧化物歧化酶
(Gp:) 激活、剌激各类白细胞
(Gp:) 白细胞介素
(Gp:) 抗病毒感染及某些肿瘤
(Gp:) 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?)
(Gp:) 治疗糖尿病
(Gp:) 胰岛素
(Gp:) 治疗侏儒症
(Gp:) 生长素
(Gp:) 刺激细胞生长与分化
(Gp:) 生长因子(bFGF, EGF)
(Gp:) 剌激白细胞生成
(Gp:) 促红细胞生成素
(Gp:) 剌激白细胞生成
(Gp:) 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子
(Gp:) 促进凝血
(Gp:) 血液因子VIII
(Gp:) 抗凝
(Gp:) 组织胞浆素原激活剂
(Gp:) 功 能
(Gp:) 产 品
目 录
基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变，又称DNA诊断。
(三)基因诊断
基本过程：
区分或鉴定DNA的异常
分离、扩增待测的DNA片断
特点：
①针对性强：以基因作为检查材料和探查对象，属于病因诊断 ②特异性高：以分子杂交为基本原理，选用特定的基因序列为探针 ③诊断灵敏度高因 (皮克水平)：多种检测技术均有有放大效应 ④适应性强、诊断范围广： ⑤早期诊断：由于以基因为探查对象，往往在疾病出现前，或者患儿出生前就可确定
美国前副总统汉弗莱
九年后，他被诊断为患有“膀胧癌”，两年后死于该病。
例：
(四)基因治疗
1、定义： 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。
2、方式： 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)
(4)基因失活(gene inactivation) 特异性封闭或破坏某些有害基因的表达
3、方法：
(1)基因修正(gene correction) 在缺陷的基因原位修复突变的基因
(2)基因置换(gene replacement) 用正常基因原位取代缺陷基因
(3)基因增补(gene augmentation) 缺陷基因不做处理，将正常基因输入体内
1990年 第一例 治疗腺苷脱氨酶缺陷患者成功。
4、应用：
遗传病、恶性肿瘤、心脑血管病以及 病毒感染性疾病等疑难病的基因治疗方面， 进行了大量实验研究。
如将固氮基因引入水稻，就可以不用施氮肥了
1、产前诊断 2、携带者测试 3、症候前诊断 4、遗传病易感性
(五)遗传疾病的预防
重点及思考题 1、名词解释: 基因重组,转化,转导,特异位点重组, 转座重组,基因工程,重组DNA, DNA克隆, 限制性核酸内切酶,基因载体。 2、简述重组DNA技术基本原理及操作步骤。 3、有哪些方法可获得目的基因? 4、外源基因与载体的连接有哪些方法? 5、重组体的筛选有哪些方法?
再见
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