干细胞的体外培养.ppt

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　　干细胞的体外培养

　　xx大学医学院微生物学教研室 xxx

　　一、干细胞的概念

　　干细胞(stem cells, SC)是一类具有无限或长期自我维持和自我更新能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。

　　干细胞几个主要特征

　　具有自我更新能力与自我维持能力，可以无限增殖分裂。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有自我更新能力，以维持自身数目的恒定。既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应有修复能力，如骨髓间充质干细胞等。干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂

　　干细胞的对称分裂和不对称分裂

　　对称分裂 (symmetry division)

　　不对称分裂 (asymmetry division)

　　干细胞分化细胞

　　干细胞几个主要特征

　　干细胞本身不是终末分化细胞;具有多向分化的能力(多能性或全能性)，即可以分化发育成各种胚层组织的细胞(ES细胞)，或可以分化成为本系统各谱系的细胞(特定组织干细胞，如造血干细胞)。

　　干细胞几个主要特征

　　干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，也就是说干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将ES细胞种植入小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。

　　在不同生长因子刺激下干细胞可表现出不同分化潜能

　　干细胞几个主要特征

　　干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持为干细胞或分化为特定细胞。

　　二、干细胞的分类

　　1、按分化潜能大小来分类: 全能干细胞( Totipotent stem cell )：能分化成所有组织和器官的干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。多能干细胞( pluripotent stem cell )，具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。如骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞。专能干细胞( unipotent stem cell )，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。

　　2、根据来源来分: 来源于胚胎--- 胚胎干细胞 ESC (Embryonic Stem Cell ) 胚胎性生殖细胞 EGC (Embryonic Germ Cell ) 来源于成体组织--- 成体干细胞 ASC (Adult-derived Stem Cell )

　　胚胎干细胞

　　指从着床前的胚胎内细胞团(桑椹胚)或原始生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克隆细胞系。它可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。为全能干细胞。

　　成体干细胞

　　是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。来源于成年组织或器官，一般具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞或单能干细胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。

　　3、根据干细胞组织发生的名称进行分类:

　　胚胎干细胞造血干细胞骨髓间质干细胞肌肉干细胞成骨干细胞内胚层干细胞视网膜干细胞胰腺干细胞

　　三、干细胞研究的历史情况

　　1959年，美国首次报道了通过体外受精(IVF)动物。 60年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其来源于胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, EG细胞),此工作确立了胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells, EC细胞)是一种干细胞。 1968年，Edwards 和Bavister 在体外获得了第一个人卵子。 70年代，EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的EC细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。 1978年，第一个试管婴儿在英国诞生。

　　1981年，从小鼠胚泡内细胞团分离出小鼠ES细胞，并建立了小鼠ES细胞体外培养条件。将ES细胞注入小鼠，能诱导形成畸胎瘤。 1984-1988年，Anderews 等人从人睾丸畸胎瘤细胞系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的(克隆化的)细胞，称之为胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells, EC细胞)。克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。 1989年，Pera 等分离了一个人EC细胞系，此细胞系能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的(比正常细胞染色体多或少)，他们在体外的分化潜能是有限的。

　　1998年美国有两个小组分别培养出了人的多能干细胞： James A. Thomson在 Wisconsin大学领导的研究小组的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取 inner cell mass细胞，建立细胞株。 John D. Gearhart在 Johns Hopkins大学领导的另一个研究小组的方法是：从受精后5-9周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞( primordial germ cell )，建立细胞株。 1999年12月，美国科学家在《美国科学院院刊》报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人类的成体干细胞具有可塑性。 1999年12月，干细胞研究进展被《科学》杂志评选为该年度世界十大科学进展之首。 2007年日本的Yamanaka研究小组和美国的James Thomson 研究小组分别获得诱导多能性干细胞 (induced pluripotent stem cell，iPS细胞)。

　　诱导式多能性干细胞

　　2006年，日本京都大学山中伸弥(Shinya Yamanaka)发现将四个基因送入已分化完全的小鼠纤维母细胞，即可以把纤维母细胞重新设定变回具全能性的类胚胎干细胞。 2007年，山中伸弥研究小组和美国波士顿的 Rudolf Jaenisch的研究团队分别制造了第二代iPS细胞，不但具有和胚胎干细胞几乎一样的基因印痕模式，它们也可顺利地和成鼠形成嵌合体并产生后代。这项结果显示藉由老鼠体细胞 ”返老还童”的第二代 iPS细胞已经跟胚胎干细胞几乎是具有一模一样的特质了!

　　诱导式多能性干细胞

　　2007年11、12月山中伸弥研究团队再次成功地利用3-4个基因导入人类皮肤细胞并将其成功地转变成 iPS细胞! 同时，美国威斯康新的James Thomson研究团队利用4个基因将人类体细胞重新设定变回干细胞! 2007年底，美国波士顿 George Daley实验室利用山中伸弥建立的技术，从病人就诊时取得的皮肤细胞量身订作一个个人的干细胞库，让 iPS细胞用来治疗人类退化性疾病已经迈入真正的临床新纪元了!

　　山中伸弥约翰·伯特兰·格登 (Shinya Yamanaka) ( John Bertrand Gurdon)

　　2012年的诺贝尔生理学或医学奖获得者

　　1962年出生于日本大阪府，日本医学家，京都大学再生医科研究所干细胞生物系教授人生万事如塞翁失马：高中热衷柔道，受伤了10多次(骨折)，最后阶段学习，考入国立神户大学医学部;毕业后，蹩脚的整形外科医生;1989年，进入大阪大学研究生院，毕业后，前往美国旧金山的格拉斯顿研究所留学，开始从事老鼠的胚胎干细胞研究。1996年回国后研究陷入停滞;1999年12月，成为奈良先端科学技术大学院大学的副教授;2003年，日本科学技术振兴机构为他提供了为期5年、总额3亿日元的研究经费，至此逐步走向成功。荣誉：2008年，时代》杂志“世界百大影响力人物”，罗伯特·科赫奖(德国)，科学技术特别奖(日本)，邵逸夫生命科学与医学奖;2009年，拉斯克基础医学奖;2011年，沃尔夫医学奖;2012年，芬兰“千年技术奖”，诺贝尔生理学或医学奖。

　　山中伸弥

　　1933年10月2日出生于英国，发育生物学家。格登主要从事细胞核移植和克隆研究。 20世纪60年代所做一个划时代实验：把美洲爪蟾的小肠上皮细胞核注入去核的卵细胞，结果发现一部分卵依然可以发育成蝌蚪，其中的一部分蝌蚪可以继续发育成为成熟的爪蟾。当1997年多利羊诞生之后，这种技术被广为所知“克隆”。从科学蠢材→英国皇家学会院士→剑桥大学教授→拉斯克基础医学研究奖→诺贝尔奖获得者

　　约翰·伯特兰·格登

　　中国科学家的贡献- iPS细胞的全能性

　　2009年6月15日《Journal of Molecular Cell Biology》：上海生化与细胞所研究人员将猪的细胞诱导转变成了多能干细胞，为建立人类遗传病模型、培育供人类器官移植的转基因动物以及开发耐受猪流感等疾病的猪开创一条道路。

　　中国科学家的贡献- iPS细胞的全能性

　　2009年7月23日《Nature》：中国科学院动物研究所研究员周琪领导的研究组和上海交通大学医学院教授曾凡一领导的研究组共同完成一项研究成果。自主构建了37株iPS细胞系，然后把其中6株的iPS细胞分别注入1500多枚四倍体囊胚，进而植入一群代孕白鼠的子宫。27只黑鼠确实由iPS细胞发育而来。它们由此成为世界上第一批完全由iPS细胞孕育而成的活体小鼠，有力地证明了iPS细胞具有真正的“全能性”。27只黑鼠先后与普通白鼠成功配种，陆续生下数百只第二和第三代小鼠。“鼠爸爸”升格为“鼠爷爷”，过起了“儿孙绕膝”的幸福生活。

　　中国科学家的贡献- iPS细胞的全能性

　　2009年7月23日《Cell Stem Cell》：北京生命科学研究所高级研究员高绍荣组重编程了小鼠细胞，从而分离出了5个新的iPSC系。利用其中一个细胞系能够培育出存活到出生的四倍体互补胚胎，而且一个胚胎还存活到了成年。

　　至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：小鼠的胚胎干细胞(1981) 金黄地鼠(1988)、貂(1993)、猪(1994，1997)、鸡(1996)、恒河猴(1995)、绒猴(1996)。分离得到人的胚胎干细胞(1998)，胚胎生殖细胞(1998)，目前不断报道成年组织来源的的干细胞及iPSC。

　　四、胚胎干细胞的体外培养

　　(一)技术原理基本原则：促进ES增殖的同时，维持其未分化的二倍体状态。有饲养层(feeder layer)培养法：以小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系(STO)或小鼠胚胎成纤维细胞( Mouse Embryo Firbroblasts, MEF)制备饲养细胞单层，主要是利用其分泌的生长因子FGF和抑制干细胞分化因子白血病抑制因子(LIF)共同作用，保持干细胞在体外克隆而不分化。无饲养层培养法：利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基或在基础培养基中加入重组的LIF制备条件培养基。

　　(二)基本过程

　　饲养层细胞制备或条件培养基制备

　　胚胎的制备和培养

　　胚胎干细胞的分离

　　胚胎干细胞的培养

　　胚胎干细胞的鉴定

　　冻存与复苏

　　细胞克隆形态

　　碱性磷酸酶检测

　　核型的鉴定

　　分化能力的观察

　　嵌合能力的测定

　　1、饲养层细胞培养

　　小鼠胚胎成纤维细胞( MEF)：取孕12.5-14.5 d鼠胚胎躯干，以植块培养法或分散细胞培养法制备，取第三代至第五代细胞作为饲养层细胞。 STO细胞：按照一般已建细胞系培养方法。 DMEM加10%小牛血清作为培养液。采用胎数多小鼠一次大量培养MEF冻存，用时复苏。

　　MEF和STO的优缺点： MEF分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制分化因子的能力比STO强，STO作饲养细胞时常需在培养基中加入LIF。 MEF不能长期传代，需经常准备怀孕小鼠制备第三代至第五代细胞，STO则可长期传代培养。 MEF不具耐药性，不能作为转染外源性基因的胚胎干细胞筛选用。 SNL细胞为转染了neor抗性基因和LIF基因的STO细胞，可分泌足够的抑制分化因子，并因带有neor抗性基因可用于转基因胚胎干细胞筛选。

　　胚胎干细胞培养过程中，死亡MEF或STO的染色体可能导致胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。不易获得纯的胚胎干细胞作为生化和分子生物学方面的分析。使用前如用丝裂霉素C处理，如清洗不彻底，残余的丝裂霉素C会影响胚胎干细胞的增殖。

　　报道的人源性滋养层细胞：

　　人骨髓来源的间充质干细胞胎儿肌肉或胎儿皮肤细胞新生儿包皮成纤维细胞成人子宫内膜细胞人胎盘成纤维细胞人胚胎干细胞经体内分化获取的间充质干细胞

　　2、饲养单层制备

　　MEF或STO连成一片，以含10μg/ml丝裂霉素培养液370C作用2-3 h(如细胞层较薄，也可缩短至30min-1.5h)，或γ射线照射(剂量为30-100Gy)。弃含丝裂霉素培养液，PBS洗5次，γ射线处理者不用清洗。消化细胞，制备悬液种植至用0.1%明胶处理过(0.1%明胶水溶液覆盖培养瓶表面，室温2h以上)的培养瓶，种植细胞数：MEF7.5×104-105个/cm2，STO为5×104个/cm2。培养至细胞连成一片没有间隙(中间可补加处理过的细胞)，制备好的饲养单层置培养箱，5天内使用，使用前换成干细胞培养液。

　　观察：好的饲养单层，细胞连成一片，无间隙，死亡细胞和杂细胞极少。 MEF和STO产生的抑制分化因子一部分分泌到培养液中，一部分锚定在细胞外基质上。无间隙的饲养单层保证了胚胎干细胞都能与饲养层细胞接触而达到最佳效果。

　　3、用于培养胚胎干细胞的条件培养基

　　直接在胚胎干细胞培养液中加入重组的LIF，使终浓度为1000U/ml。 Baffalo大鼠肝细胞株BRL条件培养基(BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌(瘤)和胚胎干细胞分化的因子DIF。收集培养72h的培养液，过滤除菌，用前6-7份+3-4份胚胎干细胞培养液，再添加8-10%胎牛血清。年龄 2-3周大鼠心肌细胞条件培养基(RH-CM)：分泌抑制胚胎干细胞分化因子。收集1-6代细胞培养液，过滤除菌，用前6份+3份胚胎干细胞培养液+1份胎牛血清。

　　4、胚胎干细胞的分离和培养

　　(1)培养液配制培养液要用超纯水或五蒸水，不能有细菌内毒素污染，水要现用现制。高糖DMEM作为基础培养基，葡萄糖浓度为(4.5g/L)：有助于囊胚贴壁、内细胞团增殖及胚胎干细胞集落形成。使用前还要添加β-巯基乙醇(0.1mmol/L)或单硫甘油( 0.15mmol/L)：保护细胞内酶和蛋白质中的巯基不被氧化，促进胚胎干细胞的贴壁和克隆形成。使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺点。

　　血清缺点：成分复杂，不利于整合到胚胎干细胞基因组中外源性基因功能的测定; 可能含有一些未知的促进胚胎干细胞分化的因子; 含有微量的血红蛋白和内毒素，干扰胚胎干细胞生长。无血清胚胎干细胞培养液无上述缺点，但细胞贴附力不如有血清培养基。血清应用之前要进行质量和效率(细胞克隆形成率)检测、血清灭活。

　　(2)胚胎干细胞的分离

　　小鼠：母小鼠超数排卵交配(注射孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素)(远交小鼠制备胚胎) 胚胎采集：取孕3.5d(囊胚期或桑椹期)的母小鼠取胚胎胚胎培养：培养皿内制备直径0.5cm左右露滴状培养液液滴，并覆盖透明石蜡油，胚胎置于液滴中培养至囊腔充分扩展(也可直接置饲养层培养) 胚胎干细胞普通分离法：胚胎置饲养层继续培养2-4d，消化分离内细胞团(inner cell mass，ICM)，分散为3-4个细胞在一起的细胞团

　　胚胎早期发生：囊胚形成(囊胚内细胞团)

　　人胚胎干细胞来源

　　a.自终止妊娠(5-9周人工流产)的胎儿中提取生殖母细胞( primordial germ cell )。

　　Gearhart法

　　b.取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。用这种方法，每个胚胎可取得15-20个细胞用于培养。

　　Thomson法

　　c.通过体细胞核转移技术(SCNT技术)获取

　　(3)胚胎干细胞培养

　　有饲养层细胞培养：将内细胞团吸置处理过的饲养层上，一个内细胞团放置一个孔，370C、5%CO2、饱和湿度培养 2d后出现小集落，并逐步增大，6-10d可消化传代，消化时，消化30s后弃消化液，残余消化液继续作用，当饲养单层出现裂隙(或显微镜下细胞之间分开)，终止消化，一般为2-3min 加适量培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种新饲养层扩大培养。无饲养层培养：明胶包被培养板，条件培养基。

　　胚胎干细胞建系及常规培养：分散克隆培养建系，第一次分散原代克隆后，为避免非干细胞污染，可再进行克隆。常规培养：生长至80%汇合(生长旺盛2-3d)时传代，消化成单细胞悬液，添加新的培养液，按照1：3或1：6比例转种。

　　注意事项：最初分离的内细胞团以3-4个细胞团为宜，但集落形成后，传代过程中一定要消化成单细胞，否则胚胎干细胞会互相诱导，易于分化。培养条件要始终如一。为了增强胚胎干细胞粘附力，除明胶包被外，还可以用纤维连接蛋白和多聚赖氨酸等促进粘附。细胞系建成后，应尽快做核型分析，以检测染色体和性染色体组成。对已建立的永久性和长期培养的细胞系，需不断筛选，去除异常细胞。

　　(4)培养结果

　　hES细胞集落(×10)

　　胚胎干细胞呈集落状(岛屿状)生长，边缘整齐，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清。消化成单细胞后细胞小而圆，核大，胞浆小。

　　A phase contrast image of the pluripotent murine embryonic germ cell

　　A culture dish containing hundreds of colonies of murine embryonic germ cells. Each red-stained spot represents an individual colony comprised of hundreds or thousands of stem cells.

　　5、胚胎干细胞的冻存和复苏

　　冻存液：胚胎干细胞培养液+10%-15%DMSO。冻存细胞密度：106-107个/ml 冻存与复苏方法同普通细胞。 LIF条件培养基培养的细胞，仍然用不含LIF的胚胎干细胞培养液冻存。

　　(三)胚胎干细胞的鉴定

　　1、 ES细胞生物学特性 (1)ES细胞形态结构及核型 ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了二倍体性质。正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。

　　(2)ES细胞生长特性 ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。 ES细胞增殖迅速，每18—24 h分裂增殖 1次。此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。

　　人胚胎干细胞(hES)的特点

　　形态：圆形或椭圆，体积较小，核质比较大，体外抑制分化培养时呈鸟巢状，集落生长并紧密堆积，细胞界限不明显。

　　(3)ES细胞的高度分化潜能

　　ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养中： “简单类胚体” ? “囊状胚体” ? 细胞分化物。 ES细胞可进行诱导分化 *用RA(维A酸或视黄酸)作诱导90%以上的ES细胞分化为神经胶质细胞， *聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩的心肌细胞。 *将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞组成可代表3个胚层细胞。 *用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重构胚和动物个体。

　　胚胎干细胞体外诱导分化

　　外源诱导因子诱导ES细胞分化诱导因子：维甲酸(RA)、骨形成蛋白BMPs)、成纤维细胞生长因子(FGFs)等转基因诱导ES细胞分化用转基因技术使某种促分化基因在ES细胞中表达、调节其分化与其他细胞共培养诱导ES细胞分化创造细胞分化的微环境

　　胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞---------------?造血细胞　　　RA 胚胎干细胞---------------?神经细胞　　　　　　DMSO 胚胎干细胞---------------?肌肉细胞　　TGF-B1, VEGF, bFGF 胚胎干细胞--------------?血管和内皮细胞　　　　　RA+胰岛素+T3 胚胎干细胞---------------?脂肪细胞　　　　　BMP-2, BMP-4 胚胎干细胞---------------?软骨细胞　　　　地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞---------------?骨细胞　　　　　基因转染胚胎干细胞--------------?胰岛素分泌细胞

　　(4)碱性磷酸酶的表达

　　许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶(AKP)表达，小鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。

　　(5)胚胎阶段特异性细胞表面抗原及标志基因的表达

　　早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原(SSEA-1)。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA-1的表达。小鼠SSEA-1的表达自8细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个标志。标志基因不断被发现：OCT3/4、SOX2+、E-RAS、FGF,等

　　2、ES细胞的全能性主要体现在以下几方面： ①形成畸胎瘤。将ES细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞; ②形成类胚体。培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目，能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种细胞系混杂的集合体、具有三个胚层组织;

　　③直系分化。通过控制ES细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3转人ES细胞，可使之分化为神经细胞; ④形成嵌合体。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体(chimera)，ES细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为ES细胞的标准。

　　3、ES细胞的鉴定

　　-- 细胞的形态结构 -- 核型分析 -- 碱性磷酸酶(AKP)染色 -- 特异表面抗原及标志物检测 -- 分化能力检测体外分化试验体内分化试验嵌合体形成试验核移植试验

　　(1)ES细胞形态学鉴定依ES细胞的形态结构(胞体体积小，核大、有一个或几个核仁)和生长特性(呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清)对ES细胞进行初步鉴定。

　　(2)核型分析 ES细胞具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验

　　(3)碱性磷酸酶(AKP)染色原理：AKP在碱性条件(pH9.0-9.6)下能使孵育液中的α-磷酸奈酚钠水解，产生α-奈酚，然后再与偶氮盐偶联，形成不溶性染料而呈现颜色。步骤：生长胚胎干细胞克隆的盖片以无水乙醇或冷丙酮固定10-15min→水洗→滴加孵育液室温5-10min→水洗10min→复染(甲基绿等) 10min。结果：未分化胚胎干细胞颜色以所用偶氮盐品种而异，分化者则为复染液颜色。对照：以已建系ES细胞(或小鼠的桑椹胚或囊胚)作为阳性对照，作用液中不含α-萘酚磷酸钠为阴性对照。

　　(4)胚胎干细胞特异表面抗原及标志物的检测

　　免疫荧光、免疫组化、Western-blot、RT-PCR、流式细胞仪胚胎阶段特异性抗原:SSEA-1 SSEA-3 SSEA-4 Thmoson分离的hES 阴性弱阳性强阳性 Gearhart分离的hES 阳性弱阳性阳性小鼠ES 阳性阴性阴性鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异。

　　(5)分化能力检测

　　体外分化能力观察:无饲养层和无抑制分化因子的条件下培养，胚胎干细胞会分化成各种细胞或发育成胚胎体：3d “简单类胚体” ? 5-10d“囊状胚体” ?贴壁细胞为细胞分化物。

　　体内分化能力观察：ES细胞接种同一品系小鼠腹股沟(107个细胞)或裸鼠、SCID小鼠(106个细胞)→约2周后出现肿块，4-5周进一步增大，摘除肿块→固定切片染色：见三个胚层组织，为畸胎瘤结构裸鼠和SCID小鼠可接种异种细胞和组织的移植也可接种腹腔，2-3周后观察肿瘤

　　嵌合能力测定：野灰色小鼠品系(如129鼠)ES 白化体小鼠(BALB/c小鼠)或纯合非野灰色小鼠(C57BL/6小鼠)着床前胚胎内假孕母鼠子宫内，使之发育成个体嵌合体小鼠：毛色是ES细胞来源品系小鼠和胚胎供体小鼠毛色的杂合，即有白色皮毛也有野灰色或黑色皮毛。除毛色观察，也可检测同工酶遗传标记，或采用PCR和小卫星DNA方法等鉴定嵌合体。

　　注射

　　移植

　　发育

　　(四)胚胎干细胞研究的意义及面临的问题意义： ES细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究中极有价值的工具; ES细胞是研究细胞分化的理想手段; ES细胞是研究基因功能的首选细胞; ES细胞作为生产转基因动物的主要途径之一; ES细胞有可能成为今后细胞替代疗法和组织器官移植的最佳来源; ES细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选。

　　ES研究面临的难题：

　　(1)体外培养ES细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态，目前在ES细胞研究中存在着建系成功率不高等问题。 (2)ES 细胞具有形成畸胎瘤的可能性, 因此在使用ES细胞进行治疗前必须首先体外诱导ES细胞分化产生某种特异的组织细胞或设计自杀基因,当移植的细胞向肿瘤发展时,自杀基因能启动自毁机制使其凋亡。但如何诱导ES细胞定向分化成单一类型的分化细胞, 尚未完全解决。必须寻找各种细胞定向诱导分化的条件和方法，以及不同干细胞的表面标志和分选技术，从而得到所需要的细胞或组织。

　　(3)ES细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破，因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程, 很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。即便是发育完整的来自自然机体的器官, 要离体培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到, 器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。 (4)最大的障碍来自于伦理学问题，特别是ES细胞应用受到伦理、法律、宗教以及社会因素的强烈反对，有些国家甚至明令禁止进行人类ES细胞研究。

　　五、成体干细胞

　　自然条件下成体干细胞倾向于分化成所在组织的细胞，参与组织更新和损伤修复; 外界条件诱导下成体干细胞也可横向分化成其他组织的细胞，参与这些组织的损伤修复。

　　优点源于患者自身的成体干细胞在应用时不存在组织相容性的问题，避免了移植排斥反应和使用免疫抑制剂理论上，成体干细胞致瘤风险很低，而且所受伦理学争议较少成体干细胞还具有多向分化潜能

　　但胚胎干细胞也存在自身的优势：胚胎干细胞能永生化，可以传代建系，且增殖能力强，来源充沛。虽然成体干细胞具有向多系分化的能力，但这种分化的“效率”尚不理想。通过体外的扩增培养能提高转化效率，但是体外的转化是否会引起成体干细胞遗传变化还有待证实，而且这种分化是否是成体干细胞多系分化的结果尚无法肯定。成体干细胞和胚胎干细胞各有自身的优势和缺陷。

　　成体干细胞分离纯化 ----利用细胞表面标志分离单克隆抗体的特异性和多样性是利用不同抗体的合理组合分离不同类型的细胞成为可能。阳性细胞分选法：从混杂细胞群体中获得表达与抗体相应膜抗原的细胞群; 阴性细胞分选法：除去表达与抗体相应膜抗原的细胞，而收集其余的细胞群体，称为阴性细胞分选法。

　　技术：抗体/补体介导细胞溶解法：阴性细胞分选法流式细胞仪分选法平面粘附分离法免疫磁珠分离法

　　阳性、阴性细胞分选法

　　免疫溶解法将待消除细胞的特异性表面标志的抗体和补体加入细胞培养物中，使抗体及补体作用于具有相应抗原的细胞并溶解之，而对该抗原阴性的细胞进行富集。细胞溶解法适用于细胞悬液或细胞培养物中待消除细胞数量不是很大的情况。

　　流式细胞分选术流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一项综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术，对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。已从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。

　　流式细胞术是对单个微粒(如细胞、微生物和人工合成微球等)进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号(分别代表荧光、散射光、光吸收或细胞光阻抗)，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。

　　免疫磁珠分选技术用免疫磁珠做细胞分选(MACS)是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法。原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或者已包被二抗的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱/试管上，实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离。

　　(一) 神经干细胞 (neural stem cell, NSC) 1.概念：成体神经系统内存在的一些可分裂的细胞，具有自我更新及分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等的能力，这些细胞称为~ 2.存在部位及取材：嗅球、皮层、室管膜层或者室管膜下层、下脑室区、纹状体、海马的齿状回、脊髓等脑组织中分布着神经干细胞。早期胚胎的神经管和神经嵴或胎儿的脑组织是体外培养神经干细胞的最理想材料来源。

　　3.培养基：基本培养基是一种特定的N2液。添加因子有葡萄糖、人胰岛素、人转铁蛋白、黄体酮、二氢氯丁二胺、硒酸钠、谷氨酰胺和肝素等。神经干细胞的诱导因子(促有丝分裂原)： EGF(表皮生长因子)：调节神经干细胞增殖分化，bFGF (碱性纤维母细胞生长因子)：强效有丝分裂原。 4.生长基质：多聚赖氨酸或成纤维细胞包被，或不包被。 5.培养方法及结果：胰蛋白酶消化或组织块培养。培养7-10天可形成神经球性克隆。

　　6.传代：吹打神经球或消化分散，未分化的神经干细胞一般每隔7-10天细胞数可增加一倍， 6-10天传代一次，一般可传35代。 7.鉴定：巢素蛋白。 8.分化及诱导分化：神经球性克隆，去除生长因子、降低血清浓度(2-5%)、悬浮培养均使神经干细胞分化为各种神经细胞; 特殊分化诱导剂诱导分化：维A酸(RA)、DMSO、γ-氨基丁酸、多肽生长因子等 9.分化细胞以其特殊标记来鉴定。

　　体外培养的干细胞用于治疗神经损伤和退行性疾病治疗所面临问题：

　　需要培养足量的神经干细胞如何标记移植细胞移植细胞的数量移植后细胞的存活率如何鉴别移植的干细胞从移植部位移行至损伤部位移植后干细胞是如何分化为有功能的神经细胞，并进行修复和功能重建

　　(二)造血干细胞 (hematopoietic stem cell , HSC)

　　(1)概念：是指存在于造血组织内的一类能分化生成各种血细胞的原始细胞。造血干细胞不是纯一的细胞群体，而是由不同年龄等级的干细胞组成。这些不同年龄等级的干细胞的表面抗原、免疫表型和粘附分子的表达不一，生物学特性也有一定的差异。

　　(Gp:) 造血干细胞

　　(Gp:) 淋巴系干细胞

　　(Gp:) 再生

　　(Gp:) B 淋巴细胞

　　(Gp:) T 淋巴细胞

　　(Gp:) NK细胞

　　(Gp:) 单核细胞

　　(Gp:) 嗜中性粒细胞

　　(Gp:) 嗜酸性粒细胞

　　(Gp:) 嗜碱性粒细胞

　　(Gp:) 肥大细胞

　　(Gp:) 血小板

　　(Gp:) 红细胞

　　(Gp:) 巨核细胞

　　(Gp:) 髓红系干细胞

　　(Gp:) 髓系干细胞

　　(Gp:) 粒-单核系干细胞

　　(Gp:) 红母细胞

　　(Gp:) 造血干细胞的分化途径

　　(Gp:) 树突状细胞

　　(Gp:) ?

　　(Gp:) 树突状细胞

　　(Gp:) ?

　　(2)造血干细胞来源

　　一般造血干细胞来源于：外周造血干细胞。　　骨髓造血干细胞。　　脐带血造血干细胞。　　胎盘来源造血干细胞

　　(3)造血干细胞的表面标志

　　人的造血干细胞表面标志包括CD34+、CD38-、Lin-、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR+、LFA-1+、CD45RA-、CD71-、KLS+等。人类造血干细胞还对5-氟脲嘧啶和4-氢过氧环磷酰胺有抗性。在干细胞不同的分化阶段，有不同的表面标志表达，故不同的表面标志已成为区分造血干细胞分化阶段的重要标志。

　　(4)造血干细胞的分离纯化

　　通常先利用密度梯度离心等方法去除待分离物中的红细胞和成熟粒细胞等成分，获得单个核细胞。然后利用CD34等分子特异的抗体标记单个核细胞，通过流式细胞分选、免疫吸附系统(包括淘洗技术、免疫吸附柱层析、免疫磁珠等)等方法将被标记细胞与未被标记细胞分离开来。另外，也可以利用造血干细胞大多处于静止期，对活体染料拒染的特性对其进行富集纯化。例如，RNA结合染料Pyronin Y、线粒体结合染料Rhodamine 123或DNA结合染料Hochest 33342均可用于造血干细胞的纯化。

　　(5)体外培养和诱导分化

　　分离纯化后的造血干/祖细胞培养方法有多种，可采用液体或半固体培养基，后者可用甲基纤维素或琼脂作为支撑物，培养基为IMDM、McCoy5或DMEM。培养基中加入不同的细胞因子及组合可诱导造血干细胞向不同的方向分化。

　　造血干细胞作为干细胞研究与应用的突破口

　　1. 造血细胞是细胞增殖分化的最佳模型。 2. 造血干/祖细胞及各系血细胞的表面标志较为清楚，细胞表型特征可进行定量分析，且可分选。 3. 造血干细胞增殖及向各系分化的重要诱导因子、受体、信号转导、微环境等因素较为清楚。 4. 造血细胞发挥功能可相对游离，不需“生物支架”、神经、血管、外科移植等复杂的“下游”工艺，因此便于直接应用于临床。

　　(三)骨髓基质细胞或间充质干细胞 ( bone marrow stromal cell or mesenchymal stem cell) (1)概念：存在于骨髓中不同于造血干细胞，并可分化为骨、关节、脂肪、肌腱、肌肉和骨髓基质等多种组织细胞的干细胞。

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　　(2)分离培养

　　采集部位：髂骨上嵴、胫骨和股骨、胸骨和腰椎。分离方法：密度梯度离心法细胞贴壁筛选法细胞分子标记分选法一般经2周左右可形成一些较大的细胞克隆，为成纤维样细胞，具有粘附性。注意低密度培养以保持其多潜能性，50%-60%汇合时传代，5-8×103/cm2接种传代。

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　　光学显微镜

　　扫描电镜

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　　原代培养15天的人骨髓间充质干细胞

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　　(3)公认的骨髓MSCs表面标记：不表达CD34、CD45等，但表达CD44 、 CD54、 CD133 、CD105、 CD90等。

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　　(4)间充质干细胞诱导分化

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　　诱导分化—成骨细胞

　　在MSCs培养体系中加入地塞米松、β-磷酸甘油和抗坏血酸等单独或联合诱导, 可分化为成骨细胞。透明质酸、骨形态形成蛋白-2(BMP-2)以及铜等均可促使MSCs向成骨细胞分化。

　　人骨髓间充质干细胞传代后经过14天诱导分化形成的成骨细胞碱性磷酸酶阳性呈紫红色 40X

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　　诱导分化—软骨细胞

　　(1)三维培养方式 (2)无血清培养基 (3)添加转化生长因子β家族成员在成人骨髓的MSCs培养体系中加入地塞米松和TGF-β3,在第14天时,在细胞外基质中检测到Ⅱ型胶原;在含10 - 7moL/ L 地塞米松的培养基中培养, 有Ⅱ、Ⅹ型胶原表达。

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　　诱导分化—脂肪细胞

　　用异丁基-甲基黄嘌呤 (IBMX)、地塞米松、胰岛素和吲哚美辛 (IM)联合诱导人的MSCs , 可使95%以上的细胞定向分化为脂肪细胞, 分化的脂肪细胞在体外培养可健康生长至少3个月。

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　　人骨髓间充质干细胞传代后经过14天诱导分化形成的脂肪细胞红油染色阳性 40X

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　　诱导分化—神经细胞

　　在丁化羟基苯甲醚(BHA)或β-巯基乙醇作用下, 可诱导大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化用双丁酰环磷腺苷(dbcAMP)和异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)处理MSCs可诱导神经分化早期标记的表达在神经生长培养基中添加EGF和脑源性神经营养因子(BDNF)同样可诱导神经分化早期标记的表达在bFGF和PDGF存在下，DMSO/BHA可诱导大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化

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　　BMSCs优点：

　　BMSCs易于提取、纯化及扩增，适合作基因治疗的载体细胞。患者可以用自己的干细胞治疗疾病，从而克服了移植排斥反应。另外，MSCs具有可植入性，在特定的条件下还可分化为骨、软骨、肌肉等组织细胞，是多种疾病基因治疗的理想种子细胞。另外，BMSCs具有极强的自我复制能力和多向分化潜能，来源广泛，易于获取，且具有低免疫原性，应用方便。

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　　BMSCs缺点：

　　BMSCs具有体外易衰老等缺点，BMSCs传代至6-7代后细胞生长逐渐缓慢，呈现衰老现象，故细胞存在数量不足、体外扩增困难、体外传代、保存及复苏后增殖及分化能力下降等问题，影响其进一步广泛研究及临床应用。随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退; 移植给异体可能引起免疫反应; 取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。

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　　(四)诱导多能性干细胞(iPS)

　　1、概念：将某些转录因子导入已分化的体细胞，经过重编程使体细胞转变为类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，称为induced pluripotent stem cells，即iPS细胞。 iPS在细胞形态、生长特性、干细胞标志物等表达与ESC相似，其染色质状态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、分化能力、类胚体和畸胎瘤生成能力、形成嵌合动物等都与胚胎干细胞极为相似。

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　　2、诱导因子

　　特异性表达在ESC的转录因子：Nanog、Oct3/4、Sox2、UTF1、Sox15等在ESC中起重要作用的生长和肿瘤相关的基因产物：c-Myc、Klf4、Stat3、β-catenin等山中伸弥 --- Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 ;Thomsom--- Oct3/4、Sox2、 Nanog、Lin28

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　　3、iPS细胞建立的主要过程

　　(1)分离和培养宿主细胞; (2)通过病毒介导或者其他的方式将若干多个多能性相关的基因导入宿主细胞; (3)将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上，并于ES细胞专用培养体系中培养，同时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程; (4)出现ES样克隆后进行iPS细胞的鉴定(细胞形态、特异蛋白标志、表观遗传学、体外分化潜能等方面)。

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　　4、优点

　　与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术不同，iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此没有伦理学的问题。利有iPS技术可以用病人自己的体细胞制备专有的干细胞，所以不会有免疫排斥的问题。

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　　5、存在的问题

　　肿瘤相关基因，如c-myc的使用，有诱发癌症的可能。逆转录病毒转染可能会导致一些癌基因的激活，也可能导致某些重要基因功能受阻。 iPS细胞与hES细胞的DNA分析结果显示两者之间仍有差异存在。诱导效率低。要得到安全实用的有临床应用价值的治疗型iPS细胞，还面临许多急待突破瓶颈和需要深入研究的领域。

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　　假说：肿瘤：机体在各种致癌因素作用下，局部组织的细胞异常增生形成的新生物肿瘤来源于肿瘤干细胞肿瘤由肿瘤干细胞驱动形成

　　(五)肿瘤干细胞

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　　干细胞和肿瘤细胞的相似性

　　自我更新; 产生分化程度不同、表型特征不同、增殖潜能不同的细胞，以及构成组织; 激活抗凋亡途径; 迁移和转移。

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　　存在于肿瘤组织中、数量稀少的、具有干细胞性质的细胞群体具有自我更新的能力，是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断扩大的源泉

　　概念

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　　系列稀释的小鼠白血病细胞移植到同品系的动物体内，移植细胞仅有1-4%能形成脾脏克隆

　　从小鼠腹水中分离骨髓瘤细胞,体外集落培养仅1/10000-1/1000 癌细胞能形成集落,而且与在体内利用脾脏培养的克隆形成率一致

　　从急性淋巴细胞白血病病人中分离出不同种类的白血病细胞，表面标记为CD34+CD38-的细胞移植到NOD/SCID小鼠后能够形成克隆，而其他细胞都不具有致瘤性

　　正式提出Cancer Stem Cell的概念

　　从乳腺癌患者分离CD44+CD22-/low的癌细胞200个，然后移植于小鼠身上形成乳腺癌;再从小鼠乳腺癌内分离癌细胞200个，又可形成肿瘤

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　　正常干细胞和肿瘤干细胞的不同点

　　肿瘤干细胞没有分化为完全成熟细胞的能力, 其分化程序异常。肿瘤细胞倾向于积累复制错误, 而正常干细胞的发育机制要防止这种现象的出现。干细胞可以在某一时间内连续分裂, 也可在较长时间内处于相对静止状态, 干细胞的自我更新具有反馈机制调节, 增殖和分化处于平衡状态, 有序的; 而在肿瘤干细胞中, 这一调节机制并不存在, 它的增殖分化是无序的, 失控的。干细胞的增殖具有自稳定性, 当组织处于稳定状态时, 平均一个干细胞产生一个子代干细胞和一个特定分化细胞, 其干细胞总数保持恒定。而肿瘤细胞无自稳定性的特点。

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　　肿瘤干细胞分离和鉴定

　　①CSC筛选最常用的手段是利用CSC细胞表面特异标志物，通过流式细胞术或磁珠分选法分离得到CSC。 ②根据肿瘤细胞中一群称为SP细胞(side population cell)能将核酸染料Hoechst33342排出胞外的特性，通过流式细胞术来分选.虽然一些SP细胞也具备自我更新和分化能力，但究竟是不是CSC还需进一步研究。 ③根据CSC的克隆形成能力来筛选。将肿瘤细胞放在软琼脂培养基上培养，CSC在无血清添加生长因子条件仍具有很强的自我更新和保持非分化状态的能力，进而能形成克隆，而其他肿瘤细胞则在传代过程中消亡。

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　　④鉴定CSC细胞的金标准是看分选得到的CSC能否在移植动物体内形成新肿瘤。将分离出来的各细胞亚群按不同细胞浓度梯度接种NOD/SCID小鼠比较各细胞群成瘤能力，从而筛选出优势细胞表面标志，或者将几种优势细胞表面标志进行组合，筛出各种组合的细胞群，这一方法又称系列原位移植法。 ⑤非粘附球囊分析法相比于系列原位移植法更简便，逐渐被用来分选鉴定CSC，CSC细胞能在无血清添加生长因子的培养基中保持未分化状态并形成致密球体，非CSC则贴壁缓慢生长，CSC得以富集。非粘附肿瘤细胞具备裸鼠体内致瘤能力和分化能力。但非粘附肿瘤球囊细胞是否是由于渗入的正常干细胞引起的效应还有待进一步证实。

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　　研究肿瘤干细胞的意义

　　了解无限增殖是正常干细胞和肿瘤干细胞共同特性, 有助于阐明肿瘤发生、发展的机制。了解肿瘤干细胞的特性及其在肿瘤中的分布、数量, 有利于对肿瘤的诊断和判断预后、调节化放疗剂量。

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　　传统治疗的对象是肿瘤的整体。但大多数肿瘤细胞并无肿瘤源性, 其生长依赖于少量干细胞样的细胞。而目前的治疗并未有效地攻击这些细胞。肿瘤组织中存在着肿瘤干细胞，肿瘤干细胞是肿瘤生长、侵袭、转移和复发的根源。肿瘤干细胞则是机体的正常干细胞或者其前体细胞在一系列内外因素的作用下增殖分化失常形成的，因此，肿瘤是一种干细胞疾病，是干细胞在长期的自我更新过程中，由于多基因突变导致干细胞生长失去调控，而停止在分化的某一阶段无限增殖所形成的异常的组织或器官。

　　肿瘤干细胞带来的启示

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　　肿瘤的转移也是肿瘤干细胞选择相宜的组织器官“安家落户”的过程，肿瘤治疗后的复发同样也是由于肿瘤干细胞没有被完全消灭而导致的结果，从理论上来说，只要剩余一个肿瘤干细胞就足可以导致肿瘤的复发。肿瘤干细胞是肿瘤发生发展的源泉，只有杀死肿瘤干细胞才可以成功的治愈癌症。

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　　六、目前干细胞的研究热点

　　人体干细胞的建株; 干细胞保持不分化的培养; 干细胞的定向诱导分化; 干细胞应用的法律、伦理道德问题; 干细胞、组织工程、器官工程; 诱导性多能干细胞。

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　　七、干细胞应用前景

　　细胞治疗组织工程药物筛选发育研究基因功能研究

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　　Human Disease model

　　(Gp:) Hepatocytes