第二章 茶树次级代谢.ppt

　　第二章 茶树次级代谢

　　第一节 茶树次级代谢的特点、主要途径及调节

　　次级代谢特点 1)初级代谢 primary metabolism: 蛋白质、脂肪、核酸、碳水化合物等是植物生命活动不可缺少的物质，为生物体的生存、生长、发育、繁殖提供能源和中间产物，这类物质代谢我们称之为初级代谢或一级代谢。

　　2)次级代谢 secondary metabolism: 植物在长期进化过程中，在特定的条件下，以一些重要的初级代谢产物为前体，经过一些不同的代谢过程，产生一些对维持植物生长发育起着一定作用的化合物，如生物碱、黄酮、芳香物质等，合成这些化合物的过程称之为次级代谢。 由次级代谢产生的物质称为次生物质或次生代谢产物。

　　3)植物次级代谢的作用 : 植物次级代谢对于植物整个生命活动具有重要意义。 协调植物与周围环境的相互作用，如植物与昆虫、植物与微生物以及植物之间的相互作用。 有助于植物繁殖，如可以吸引其它动物来授粉。 植物次级代谢产物是决定人类食物质量的重要方面，如味觉、颜色、气味等。而且植物色素能体现植物和花的多样性。

　　初级代谢和次级代谢的关系及代谢的主要途径

　　在高等植物中，次级代谢的主要系统是从糖酵解系统(EMP)，磷酸戊糖循环(PPP or HMP)，柠檬酸循环(TCA)等初级代谢的中间产物派生出来的三个途径莽草酸途径、甲瓦龙酸途径、多酮化途径，借助这3个合成途径和氨基酸合成途径相结合生成生物碱、萜烯、黄酮类等次级代谢产物。

　　初级代谢和次级代谢的关系

　　1)初级代谢对次级代谢的调节 初级代谢的许多重要中间产物是次级代谢的始点，因而可通过调控初级代谢而增加次级代谢的产量和各种次级代谢的比例。 当盐酸乙胺添加到培养基中，在茶树愈伤组织中的氨基酸的积累大大提高，而多酚类、咖啡碱积累则下降。

　　次级代谢的调节

　　2)次级代谢的酶促调节 在高等植物中，多酚类化合物的合成是由莽草酸途径合成芳香族氨基酸后进一步合成的。而在这其中苯丙氨酸裂解酶(PAL，phenylalanine ammonialyase)起着重要的作用。如茶树新梢中的PAL以芽最高，按第一叶、第二叶、嫩茎的顺序递减，随叶片的成熟与老化而降低，多酚类则也随着叶片老化而下降。

　　3)环境因素对次级代谢的调节 和初级代谢相类似，在一定限度范围内，高等植物的次级代谢受环境因素的影响和调节。如激素、光照、温度、肥料等都会对次级代谢起着调节作用。

　　第二节 茶树中的生物碱代谢

　　1、茶树体内咖啡碱的分布 2、茶树体内咖啡碱的生物合成 咖啡碱生物合成部位 咖啡碱生物合成中嘌呤环的来源及嘌呤环的甲基化 (嘌呤环的直接生物合成;核酸降解;嘌呤甲基化) 嘌呤合成代谢与咖啡碱的生物合成途径 咖啡碱生物合成中重要的酶 3、茶树体内咖啡碱的分解

　　茶树中的生物碱以嘌呤碱为主，而嘌呤碱中又以咖啡碱为主体成分。 咖啡碱为茶树的特征性成分之一。

　　一、茶树体内咖啡碱的分布

　　茶树体内咖啡碱是从茶籽萌发开始形成，此后就一直参加茶树体内的代谢活动，并贯穿与生命活动的始终。咖啡碱广泛地分布在茶树体内。但各部位的含量，差异很大。除种子外，其它各部位均含有咖啡碱。并比较集中地分布在新梢部位，以叶部最多，茎梗中较少，花果中更少。

　　咖啡碱是比较集中地分布在新梢部位，但新梢中各部位的含量又不相同。以嫩的芽叶含量最多，老叶最少。说明咖啡碱在新梢中的含量是随芽叶的老化而减少，因此咖啡碱能作为茶叶老嫩度的标志成分之一。

　　茶树新梢中咖啡碱的生成量还随品种、气候、栽培条件的不同而有变化。在不同品种中，云南大种常比一般品种咖啡碱含量高。在不同季节中，夏茶常比春茶和秋茶含量高。在不同栽培条件中，遮阴和施肥的，常比露天和不施肥的含量高。这些生育中的 动态变化，都是茶树体内咖啡碱因代谢受不同环境条件影响，从而导致不同条件下咖啡碱的含量的差异。

　　二、茶树体内咖啡碱的生物合成

　　咖啡碱生物合成部位 研究表明，咖啡碱是在茶树幼嫩叶片中进行生物合成的，而在茎、根与子叶中合成能力能低甚至没有。而茶花中亦能合成咖啡碱。 细胞中的合成部位则是在叶绿体中。在叶绿体中含有咖啡碱生物合成所需的酶类。

　　咖啡碱生物合成中嘌呤环的来源及嘌呤环的甲基化 咖啡碱的结构特点是黄嘌呤，在1，3，7位置的N上连接3个甲基，生物合成中，一需要嘌呤环的来源，二需要甲基供体。 茶树中咖啡碱生物合成的嘌呤环，既可来自甘氨酸、谷酰胺、甲酸盐和CO2的直接合成，又可来自核酸代谢的核苷酸代谢库中的嘌呤，其中核苷酸库中腺嘌呤是咖啡碱合成的最有效的前体。 咖啡碱合成中的甲基主要来源于S-腺苷蛋氨酸，而转甲基作用则依赖于N-甲基 转移酶的活性。

　　嘌呤环的生物合成

　　应用同位素标记法对表明嘌呤中各氮、碳原子的先质来源进行了详细研究。结果证明，环中C4、C5分别来自甘氨酸中的羧基和α-碳原子。N7来自甘氨酸中的氨基。C2、C8来自甲酸盐，N3、N9来自谷氨酰胺，N1来自天冬氨酸，C6来自CO2,如图。

　　嘌呤环的生物合成不是先形成游离嘌呤骨架而后转变成嘌呤核苷酸，而是首先以核糖-5-磷酸为起始物质，并在此基础上逐步将先质中碳、氮原子一个一个连接而成次黄嘌呤核苷酸。具体过程如下。

　　以上合成的次黄嘌呤是形成其它嘌呤核苷酸的先质,由它可转变成腺苷酸、黄苷酸、鸟苷酸。

　　生物体内除上述方式合成嘌呤核苷酸外，尚能利用已有的嘌呤碱和核苷形成嘌呤核苷酸。现已知道，嘌呤碱与1-磷酸核糖通过核苷磷酸化酶的作用，可生成嘌呤核苷，后者再经核苷磷酸激酶的作用，由ATP供给磷酸基，即形成嘌呤核苷酸。嘌呤碱与5-磷酸核糖焦磷酸通过核苷酸焦磷酸化酶的作用，也可形成嘌呤核苷酸。其反应如下：

　　由此可知，腺嘌呤可以合成腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤可以合成鸟嘌呤核苷酸。这些嘌呤核苷酸的产生，在生物体内除参加核酸的合成外，还能转化成多种嘌呤衍生物。 在茶树体内用于合成生物碱的嘌呤大多来自核苷酸库，库中的腺嘌呤核苷酸被认为是最有效的前体，由它可在一系列酶的作用下转化成为咖啡碱 。

　　核酸降解

　　由于核酸组成中有嘌呤核苷酸，当大分子核酸降解时，就有许多的腺苷酸和鸟苷酸从结合态中游离出来，而它们又能分别转化为次黄嘌呤核苷酸和黄嘌呤核苷酸。 由于这些嘌呤核苷酸的相互转化，能够为咖啡碱合成提供嘌呤环来源，所以核酸降解与咖啡碱合成有密切的关系。

　　以上嘌呤来源的途径可看出，无论是直接合成，还是核酸降解，它们和咖啡碱合成的关系，都是嘌呤核苷酸为咖啡碱提供嘌呤环来源的结果。而嘌呤核苷酸既是合成的原料，又是核酸降解的产物，当核酸合成时，就通过直接合成途径形成嘌呤核苷酸，当核酸降解时，又能游离出嘌呤核苷酸。因此，咖啡碱中嘌呤环的来源实际上是和核酸代谢有关。当然也不能排除咖啡碱可以通过嘌呤基重新再利用的途径来合成嘌呤核苷酸的可能。

　　嘌呤的甲基化

　　(1)甲基供给体 咖啡碱中嘌呤环上的直接甲基供体为S-腺苷蛋氨酸，它是由蛋氨酸与ATP作用转化而来的。?

　　蛋氨酸活化为S-腺苷蛋氨酸后即可提供甲基，当供出甲基后，变成S-腺苷同型半胱氨酸，它脱去腺苷，就变成同型半胱氨酸。而它再接受甲基，又能变成蛋氨酸。蛋氨酸再活化后，又产生S-腺苷蛋氨酸。这样循环往复，在生物体内形成蛋氨酸的甲基转移循环。

　　(2)甲基的转移和甲基化顺序

　　咖啡碱的合成中，嘌呤甲基化的过程，是先由7-甲基黄嘌呤甲基化形成可可碱(3，7-二甲基黄嘌呤)，再由可可碱甲基化形成咖啡碱。 咖啡碱嘌呤环上的甲基是由S-腺苷蛋氨酸供给，在甲基转移酶的作用下，按7、3、1氮原子位置的先后顺序进行甲基化作用。

　　(三)、茶树体内的嘌呤合成代谢与咖啡碱生物的合成途径

　　1、腺苷酸琥珀合成酶与裂解酶;2、AMP脱氨酶;3、IMP脱氢酶;4、GMP合成酶;5、GMP脱氨酶;6、GMP还原酶;7、核苷激酶或核苷转磷酸酶;8、5′-核苷酸酶或磷酸酶;9、11、12、N-甲基转移酶;10、N-甲基核苷酶;13、鸟嘌呤核苷脱氨酶;14、PRPP合成酶。

　　(四) 咖啡碱生物合成中的重要酶

　　N-甲基转移酶 茶树体内只有三种N-甲基转移酶，分别为黄嘌呤核苷N-甲基转移酶(7-NMT)、7-甲基黄嘌呤N-甲基转移酶(3-NMT)和可可碱N-甲基转移酶(1-NMT)。其中以3-NMT活性最高，它的活性是7-NMT和1-NMT活性总和的10倍以上，因此，在生物合成旺盛的芽叶中，常常有可可碱的大量积累。H.Ashihara等研究发现，四个月的茶树幼苗中的咖啡碱主要分布在叶片内，而合成咖啡碱的先质可可碱只存在嫩叶中，咖啡碱是在嫩叶中经可可碱合成的。

　　茶树中的咖啡碱合成酶(Caffeine synthase,CS)为3-NMT 和1-NMT的总称。即催化由7-甲基黄嘌呤生成咖啡碱的两步反应。 茶叶中的咖啡碱合成酶已经得到分离纯化，并对性质进行了全面的研究(Kato M.Mizuno K.et al.1999)而且，茶树中的咖啡碱合成酶基因的cDNA全长已经克隆(Kato M.Mizuno K.et al.2000) ，催化甲基化反应的两种N-甲基化转移酶(3-NMT 、1-NMT)很多性质相同，例如，最适pH值均为8.5,Mg2+ 、Ca2+和Mn2+都能微弱刺激酶的活性，Hg2+和Cu2+能强烈的抑制酶的活性，巯基试剂对活性几乎没有影响，有人把两种酶看作同一种酶，称为咖啡碱合成酶(Caffeine synthase,CS)(Suzuki T.and Takahashi E.1975)。

　　若以黄嘌呤核苷和嘌呤核苷酸为底物，则不能检测到咖啡碱合成酶的活性。上述研究表明至少有两种不同的N-甲基转移酶(7-NMT, 咖啡碱合成酶)参与了咖啡碱的合成。

　　N.Fujimori 等测定了茶树体内嘌呤碱生物合成中N-甲基转移酶与5-磷酸核糖焦磷酸酯(PRPP，phosphaoribosyl pyrophosphate)合成酶的活性，发现N-甲基转移酶在四、五月份的茶树叶片上活性最强，但到七、八月份酶活性就消失，而PRPP合成酶活性仍然维持到可检测水平。这说明咖啡碱的生物合成能力主要决定于N-甲基转移酶的活性，因此可望通过对N-甲基转移酶的诱导与抑制来调控茶树体中咖啡碱的合成。

　　N-甲基核苷酶 此酶为水解酶，主要是催化7-甲基黄嘌呤核苷水解脱去核糖而转变为7-甲基黄嘌呤的反应。其分子量大约为55,000，最适pH为8.0-8.5,最适温度为40-450C。 它是咖啡碱合成中的一个调节酶，如果没有该酶对7-甲基黄嘌呤核苷的水解，以后嘌呤甲基化，进而生成咖啡碱的反应就无法进行。

　　次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH, inosine monophosphate dehydrogenase) 该酶催化咖啡碱生物合成途径中由次黄嘌呤核苷酸脱氢产生黄嘌呤核苷酸的过程。此酶最适pH范围较宽(8.8~9.8)。受嘌呤核苷酸的抑制，抑制敏感性为GMP>XMP>AMP。IMPDH可能是嘌呤类核苷酸转化为咖啡碱和鸟嘌呤核苷酸合成的关键酶类。

　　AMP脱氨酶 (adenosine monophosphate deaminase) 此酶是催化腺苷酸脱氨产生次黄嘌呤核苷酸的反应。 Fujimori N, Ashihara H,(1993) 研究了茶树花芽中嘌呤碱的生物合成，试验表明[8-14C]腺嘌呤在雄蕊中先转化成腺嘌呤核苷酸，然后转化成可可碱和咖啡碱，如果加入 AMP脱氨酶抑制剂(Coformycin)，能够抑制转化成嘌呤碱的放射强度。说明从腺嘌呤核苷酸合成咖啡碱受AMP脱氨酶活性所调控。

　　三、茶树体内咖啡碱的分解

　　咖啡碱的分解与腺嘌呤和鸟嘌呤的分解相类似，都是先脱去环上的基团，变成黄嘌呤。所不同的是腺嘌呤和鸟嘌呤脱去的是氨基，而咖啡碱脱去的是甲基，脱下的甲基又可以通过四氢叶酸载体，在相应酶的作用下，转移到其它的化合物中。 黄嘌呤会有两种去向，一种是继续分解，另一种也可能又转化为其它嘌呤核苷酸被再利用。

　　黄嘌呤的分解代谢途径

　　植物体内这类嘌呤碱分解代谢主要发生于老叶，分解后生成的尿酸，尿囊素可从叶子中转运出来，作为储备物质到春天生长时再重新利用。 而茶树体内的黄嘌呤分解产物中，又是以尿酸和尿囊素为主。所以这种形式的分解产物，在茶树体内还有贮藏组分的作用。

　　人们饮茶后，咖啡碱进入人体内的分解情况有所不同，由于人体内缺乏分解尿酸的能力，所以咖啡碱在人体内除脱去部分甲基外，就被氧化成尿酸，因此大部分是以甲基尿酸或尿酸的形式排出体外，而不在体内积累，所以不会对人体造成危害。 血中尿酸正常含量：149-416 μmol/L，溶解度低。一旦嘌呤代谢障碍时，血中尿酸浓度升高，尿酸盐结晶沉积于软组织、软骨及关节等处，而导致关节炎、尿路结石及肾脏疾病。

　　由咖啡碱的合成与分解研究可知，茶树体内咖啡碱的代谢和核酸、蛋白质代谢紧密相连。核酸中的嘌呤核苷酸，蛋白质中的蛋氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸等都和咖啡碱的合成有关。因此，在核酸、蛋白质代谢旺盛的嫩叶中，咖啡碱含量最多，随着芽叶老化，代谢强度减弱，以及嘌呤本身分解代谢的加强，老叶中的咖啡碱含量明显减少。它们之间这种显著的相关性，也说明咖啡碱在茶树体内是积极参加新梢中的物质代谢活动的，并随代谢强度的变化而变化。

　　本节小结

　　咖啡碱的分布：茶树体内除种子外，其他各部位均含有咖啡碱。主要分布在茶新梢部位，以芽、叶部最多并且随着叶部的老化而减少。在茎梗中较少，花果中更少。 咖啡碱的生物合成部位：主要是在茶树幼嫩叶片中合成，此外茶花中也可进行咖啡碱的生物合成。

　　咖啡碱的生物合成 1、嘌呤环的来源 直接生物合成：以核糖-5-磷酸为 起始物，分别由甘氨酸、谷氨酰胺、 天冬氨酸、甲酸盐、二氧化碳提供相应的C、N原子，按N9-(C4-C5-N7)-C8-N3-C6-N1-C2的顺序合成次黄嘌呤核苷酸。 核酸降解：核酸降解产生的腺嘌呤为咖啡碱最有效的合成前体。

　　2、嘌呤的甲基化 由蛋氨酸在腺苷酸转移酶的催化下经ATP活化后产生的S-腺苷蛋氨酸提供甲基。甲基化顺序为N7-N3-N1。 3、咖啡碱的合成途径及重要酶 咖啡碱的降解

　　作业题

　　什么是植物的次级代谢?茶树中有哪几类特征性的次级代谢产物? 茶树中咖啡碱嘌呤环中C、N的来源?咖啡碱最有效的合成前体、甲基供体、生物合成中重要的酶类分别是什么?

　　第三节 茶树中的茶氨酸代谢

　　一 氨基酸在茶树中的分布 二 茶氨酸的生物合成 1.茶氨酸合成酶 2.茶氨酸生物合成的先质(谷氨酸、乙胺) 三 茶氨酸的分解代谢 四 茶氨酸的规模化发酵生产

　　茶氨酸，一种非蛋白质氨基酸，是茶叶中的特色成分之一，占茶叶干重的1-2%、占整个游离氨基酸的70%。 除茶氨酸外，茶叶中还含有一定量的谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、天冬氨酸。

　　一、氨基酸在茶树中的分布

　　发芽前后的种子中主要的氨基酸是茶氨酸和精氨酸;当幼根和茎叶开始生长时，所含氨基化合物由子叶中蛋白质水解产物运输而来。当幼苗开始分化时，则吸收无机氮合成氨基酸。茶树氨基酸在各个组织都含有，但含量差异较大。 游离氨基酸以第一叶最高、茎木质部最低。茶氨酸在各组织(果实除外)含量都十分突出，以芽叶最高，第二、三及四五叶依次下降。

　　茶树因施肥种类不同，氨基酸的分配和积累有明显的差异，施用铵态氮肥初期，茶树体谷氨酰胺的浓度急剧上升，茶树根部茶氨酸、精氨酸和谷氨酰胺的浓度也呈直线上升，但不久，除茶氨酸的浓度仍继续提高外，其它氨基酸都有所下降。这时，地上部分以精氨酸为主，根部主要是茶氨酸。 硝态氮肥的用量与根部氨基酸类化合物的浓度不呈现上述关系。

　　茶树氨基酸特别是茶氨酸的积累和分布也与其转移速度和利用速度有关。茶树氨基酸中以谷氨酸在茶树中利用最快，而茶氨酸贮存期长，因为茶氨酸由根部转移到叶部的速度和叶部利用的速度都比谷氨酰胺慢，新梢中的茶氨酸从萌发开始就具有较高的含量，随着新梢的生长一直保持较高的水平，这一点亦可看作茶氨酸在新梢中含量高的理由。

　　冬季茶树处于休眠期，茶氨酸和谷氨酰胺主要贮存在根部，精氨酸则贮存于地上部，谷氨酸在各器官中含量均较高。茶树根部贮存的养分对翌年春茶萌发时往新梢中运输，对新梢的生长发育起着较大的作用。 氨基酸的季节性变化规律明显，按氨基酸总量和茶氨酸表现出春高、秋低、夏居中的趋势，而精氨酸则相反。

　　二 茶氨酸的生物合成

　　1. 茶氨酸合成酶(theanine synthase)

　　茶氨酸合成酶催化由L-谷氨酸和乙胺合成茶氨酸的反应。该酶最适pH 为7.5左右，对Mg2+离子浓度有依赖性。 茶氨酸合成酶的底物特异性很强，同样反应条件下，用D-谷氨酸、L-α-氨基己二酸或L-天冬氨酸替代L-谷氨酸均不能与乙胺反应生成茶氨酸。

　　2. 茶氨酸生物合成的先质 日本佐佐冈启等人的同位素实验结果表明，谷氨酸和乙胺可能是形成茶氨酸的直接先质。并且在生物合成中需要ATP的活化。 此后，小西茂毅等研究表明茶氨酸是在茶树根部由乙胺与L-谷氨酸生物合成的。

　　(1)茶根中，谷氨酸合成的途径及相关酶的性质

　　谷氨酸脱氢酶(GDH，glutamate dehydrogenase)催化还原氨基化反应合成谷氨酸 茶树利用铵态氮，形成茶氨酸等氨基酸和酰胺，首先要通过这一途径。

　　茶树根部的GDH在氨基化反应过程中，存在基质抑制现象，即当α-酮戊二酸浓度、NH4+浓度超过一定值时，酶活性受到抑制。 GDH催化氨基化反应，用NADH + H+ 做辅酶，比用NADPH + H+ 作辅酶，亲和性要强9倍。 Zn2+、Ca2+ 、 Mg2+ 等金属离子影响GDH的氨基化反应。添加适量的 Ca2+ 、Mg2+能提高酶活性，当浓度超出一定范围时则对酶活性有抑制作用。Zn2+对此酶则表现明显的抑制作用。

　　茶树具有喜铵性和耐铵性，尽管茶园施用较多量的铵态氮，但茶树根部存在高效率将铵态氮转变成谷氨酸的能力。高浓度的谷氨酸虽有抑制此酶催化氨基化的反应，但茶树能够很快地将体内的谷氨酸转换成谷氨酰胺，茶氨酸之类的酰胺或其它氨基酸，因而，消除了这种抑制。这一研究结果，解释了在茶树吸收高浓度的铵态氮时，而茶根部谷氨酸浓度并不太高，而是大大地提高了茶氨酸和谷氨酰胺浓度的现象。也就是说，茶树根部吸收了铵态氮，但并不以L-谷氨酸的形态积累，而是很快地将谷氨酸转换成茶氨酸等酰胺类化合物。

　　在谷氨酰胺合成酶/谷酰胺-α-酮戊二酸氨基转移酶(GS/GOGAT)系作用下的合成谷氨酸途径

　　GS/GOGAT: glutamine synthase/glutamine:2-oxoglutarate aminotransferase 谷酰胺-α-酮戊二酸氨基转移酶，即谷氨酸合成酶

　　研究认为，在高等植物内，这一GS/GOGAT途径可能是氮同化的主要途径。谷酰胺-α-酮戊二酸氨基转移酶，它与转氨酶不同，既催化转氨作用，又催化α-酮戊二酸的还原氨化，为了把它和一般转氨酶区别开来， 又将它称为谷氨酸合成酶。现在一般称为GS/GOGAT途径。 茶树是多年生的作物，又是一种喜铵性作物，耐铵性比一般植物强，多量施用铵态氮亦未见铵中毒的现象。特别引人注目的是茶树体内大量积累着茶树特有的酰胺—茶氨酸，那么茶树通过GS/GOGAT酶系对铵态氮的利用是肯定的。

　　用L-蛋氨酸-DL-亚砜基亚胺(谷酰胺合成酶和谷氨酸合成酶的抑制剂)处理茶实生苗后，发现茶苗根部合成氨基酸和酰胺的能力明显降低。 同时发现用L-蛋氨酸-DL-亚砜基亚胺处理茶根，并不影响GDH的活性。说明抑制效应主要发生在对GS/GOGAT抑制作用上。研究表明，在一般情况下GDH只起着辅助GS/GOGAT系的作用。也就是说，茶根利用铵态氮合成氨基酸及其酰胺，是以GS/GOGAT系起着主导的作用。倘若此酶受到抑制时，根部茶氨酸等酰胺化合物的浓度便趋于下降。显然，抑制了茶树体内的GS/GOGAT酶系，就几乎抑制了茶树体内茶氨酸的生物合成。

　　(2)茶氨酸生物合成的前导物—乙胺的代谢

　　同位素标记研究表明，茶氨酸的乙胺部分是来自于丙氨酸的降解产物乙胺。茶根只要同时吸收L-丙氨酸和L-谷氨酸就可以合成L-茶氨酸。

　　茶树体内，根和茶芽叶中都有茶氨酸合成酶，为何茶氨酸仅在茶根部合成?这是因为由L-丙氨酸脱羧形成乙胺的反应只能在根部进行，而不能在茎或其它器官中进行。

　　茶树体内茶氨酸的合成途径

　　三 茶氨酸的分解代谢

　　茶树体内，茶氨酸的降解，有它独特的地方。首先是酰胺键酶促水解，而不是马上脱胺或脱羧。水解生成谷氨酸和乙胺，生成的乙胺，部分地参与儿茶素的合成。研究表明茶氨酸的降解代谢与光照有关，遮荫叶片茶氨酸含量高，这是因为弱光对茶氨酸的分解有抑制作用，从而抑制了茶氨酸向儿茶素的转化，使茶氨酸得以积累 ，这对提高茶叶品质有重要作用。

　　茶氨酸降解生成的乙胺，在茶树中进一步如何代谢，研究还不够。不过从植物生化的研究表明，植物体内存在有胺氧化酶，使乙胺氧化生成乙醛。乙醛一般可氧化变成乙酸，乙酸可进入三羧循环，或进行其他转化。如乙酸可进行烯醇化产生乙烯醇。三分子乙烯醇聚合(脱氢……)可生成间苯三酚和邻苯二酚，再进一步转化生成儿茶素和没食子儿茶素。

　　四 茶氨酸的规模化发酵生产

　　茶氨酸虽然为茶树独有的氨基酸，而利用微生物发酵方法大规模合成L-茶氨酸已成为现实。1993年，日本报道了用k-甲叉菜胶固定一种硝酸还原假单胞z细菌IF012694(Pseudomonas nitroreducens)大规模生产茶氨酸。

　　具体方法是将浸泡在0.9%NaCl中的4.5%k-甲叉菜胶在80℃下溶化，冷却至45℃后与细胞混合，使其固定为直径3 mm左右的颗粒，再填充于四根1.7×40 cm的柱状反应器中。在30℃下，50 mM硼酸缓冲液(pH 9.5)中，以0.3 M L-谷氨酰胺和0.7 M乙胺为底物,以0.3个床体积每小时的流速通过反应器。 采用这种方法固定的细胞，其合成反应活性可维持几个星期，反应器的半寿期预计可达120次反应，第51次合成反应时，茶氨酸产量仍达到40 mmol/h。

　　用于合成茶氨酸的硝酸还原假单胞Z细菌的细胞固定化

　　① L-谷氨酰胺， ② 乙胺， ③送液泵，*1 恒温循环水

　　利用固定化细胞填装的反应器生产茶氨酸

　　茶细胞培养生物合成茶氨酸

　　利用植物细胞发酵生产各种天然次级代谢产物是近代生物技术细胞工程研究和开发的领域,自20世纪90年代以来,有不少资料报道了利用茶树细胞培养生产茶氨酸。结果表明MS培养基为茶氨酸积累的最适培养基,外加适量IAA、6 BA或IBA等,同时,添加盐酸乙胺、谷氨酸等前体可以明显促进茶氨酸的合成。另外普遍认为暗培养利于茶氨酸的生成。但是,由于产量低(最高达194±16mg/g干细胞重),产品分离纯化过程复杂及生产工艺的控制难度大等限制了该方法的工业化。

　　构建工程菌生物合成茶氨酸

　　随着现代基因工程操作技术的发展,通过构建茶氨酸合成酶基因转化的工程菌可以实现微生物发酵直接生产茶氨酸,但需要对茶氨酸合成酶有深入的研究,而目前茶氨酸合成酶基因的研究仍为空白,有关茶氨酸合成酶的研究,国内、国外报道甚少。 由工程菌合成茶氨酸, 要解决构建ATP再生系统的问题。TakashiTachiki等用微生物发酵法合成茶氨酸时是以细菌谷氨酰胺合成酶匹配酵母的ATP再生系统,但是由于反应体系复杂,茶氨酸产量不高。而工程菌可以实现茶氨酸合成酶基因的表达及ATP再生系统的构建于同一菌株。进而开辟茶氨酸生物合成的新途径。

　　本节小结

　　茶氨酸是茶叶的特征性成分之一，占茶叶整个游离氨基酸的70%以上。在茶树中芽叶含量最高，第二、三及四五叶的含量依次下降。同时，以春茶中的含量最高，夏茶和秋茶依次减少。在冬季茶树休眠期间茶氨酸逐步积累，以供来年春梢萌发之用。 施用铵态氮肥有利于茶氨酸的积累。

　　茶树体内茶氨酸的分布

　　茶氨酸是在茶树根部由茶氨酸合成酶催化L-谷氨酸和乙胺合成而来。

　　茶氨酸的生物合成

　　茶氨酸的前体谷氨酸主要是在谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶(GS/GOGAT)体系中生物合成而来。

　　谷氨酸的来源还存在一个次要合成途径，即在谷氨酸脱氢酶作用下，由α-酮戊二酸加氨合成。 茶氨酸的另一前体乙胺是在丙氨酸脱羧酶作用下由丙氨酸脱羧反应而成。由于丙氨酸脱羧酶只存在于茶树根部，尽管茶氨酸合成酶分布在各个组织，但茶氨酸只能在根部合成。

　　茶氨酸的降解

　　茶氨酸降解时，先进行酰胺键水解，产生谷氨酸和乙胺。谷氨酸可进入三羧酸循环进行代谢。而乙胺可在胺氧化酶作用下产生乙醛，再经烯醇化作用产生乙烯醇，再进一步转化生成儿茶素和没食子儿茶素。

　　遮荫条件下，可抑制茶氨酸向儿茶素的转化，茶氨酸得以积累，从而提高茶叶品质。 茶氨酸的规模化发酵生产：已利用微生物发酵中产生的茶氨酸合成酶由L-谷氨酸和乙胺进行合成。

　　作业题

　　不同叶位、不同季节对新梢中茶氨酸含量的影响? 简述茶氨酸及其前体的生物合成途径及涉及的酶系?茶氨酸生物合成的部位? 从茶树中氨基酸代谢途径解释茶树为何有喜铵耐氨的特性。

　　第四节 茶树中多酚类物质代谢

　　一、 多酚类物质在茶树体内的分布 二、茶树体内多酚物质的形成与转化 1. 儿茶素在茶树体内的形成 2. 儿茶素的生物合成途径(莽草酸途径) 莽草酸、苯丙酸盐、儿茶素 三、茶树中多酚类的分解代谢

　　一. 多酚类物质在茶树体内的分布

　　茶叶中含有大量的多酚类化合物，含量一般为干重的15-35%，表现为茶叶的涩味。 黄烷醇类化合物在茶叶中含有12-24%干量，占多酚类总量的80%左右。其中以EGCG为重要成分，含量常占黄烷醇总量的50%。而EC，C，GC和D-GC等含量较少，总共只占黄烷醇类总量的10%左右。

　　多酚类在茶树体内的分布，主要集中在茶树新梢的生长旺盛部分，老叶、茎、根内含量少些，尤其是根中含量极微，并且只含有非酯型儿茶素的L-EC和D，L-C。

　　茶树新梢的不同伸育程度，黄烷醇类化合物的含量与组成差异很大，特别是L-EGCG，L-EGC和L-ECG变化显著。L-EGCG、L-ECG随伸育程度增长含量渐次降低，而L-EGC却有增加的趋势。 黄烷醇类的总量在幼嫩的新梢中含量较高，而粗老的茶梢中含量较低。嫩叶中儿茶素的没食子酰基化作用能力较强，随着伸育而降低，但儿茶素的羟基化作用却随伸育而增强。

　　不同品种的茶树，多酚类含量与组成是有差异的。云南大叶种黄烷醇类含量较高，而小叶种的龙井种含量较低。 一般来说，茶叶中黄烷醇类化合物的组成中以L-EGCG含量最高，其次是L-ECG和L-EGC，但在云南大叶种中L-ECG含量较多,几乎接近 L-EGCG的含量，而且L-EC和D，L-C的含量却超过了L-EGC。云南大叶种的芽叶中黄烷醇类的含量与组成异于别的品种，被认为是它保持了原始特性的关系，这对鉴别茶树品种的原始性方面是有意义的。

　　茶叶中黄烷醇类化合物的含量也随不同季节而有变化，夏梢中黄烷醇类含量最高，秋梢次之，春梢最少。从其组成来看：L-EGCG含量能反映出不同季节新梢嫩度或品质。

　　茶叶中多酚类的含量与组成和茶树栽培的环境条件与技术措施密切相关。 栽培在不同海拔高度的茶树新梢中黄烷醇类以及黄酮苷的含量不同。一般超过一定海拔高度(约500米)时，多酚类的含量随海拔增加而降低。

　　干旱季节进行灌溉能提高茶叶中多酚类的含量。 适当增施磷肥或有机肥料均能提高茶叶中多酚类含量。 夏季光照过强时适度遮荫不仅能使茶树生长势好，“持嫩性”强，而且能使多酚类含量保持一定水平(过度遮荫会使其含量降低)。

　　植物中类黄酮物质的形成受外界环境条件的影响，特别是光的影响较大。遮荫减少光照而直接影响到L-EC的形成，但对儿茶素的没食子酸酯化作用影响较小。

　　茶叶色泽不同，黄烷醇类的含量与组成则有差异。紫色芽叶中黄烷醇类含量较高，黄绿色芽叶次之，深绿色芽叶含量较低。

　　总之，茶叶中多酚类的含量与组成是和外界环境条件矛盾统一的集中表现，它随品种、老嫩、自然环境条件、施肥、采摘等不同而有差异。 因而，弄清茶树中多酚类物质相互转化与分解代谢，在茶树的生理生化研究中有重要意义，对提高茶叶产量及质量，改良茶树品种和茶多酚人工合成与利用有重要作用。

　　二、茶树体内多酚物质的形成与 转化

　　(一). 儿茶素在茶树体内的形成

　　(一) 儿茶素在茶树体内的形成 实验证明，休眠的茶树种子胚中黄烷醇类化合物含量微少，从茶树种子萌发开始，就伴随着黄烷醇类的合成，并一直进行，而且黄烷醇分布于茶树植株的各个部分。 种子萌发中，首先形成的是非酯型儿茶素如D,L-C，L-EC。随后经羟基化，没食子酰基化而形成没食子基儿茶素和儿茶素没食子酸酯等，如：L-EGC，L-EGCG等。

　　具体情况如下： (1)25~30天的幼苗最初形成了D,L-C和L-EC。 (2)40~45天的幼苗已有D,L-C和L-EC，L-ECG，GCG和L-EGCG五种。已能进行羟基化和没食子酰基化，出现了酯型儿茶素。 (3)60~70天的幼苗除上述五种儿茶素外，又增加了L-EGC和D,L-GC，根中只有D,L-GC，D,L-C和L-EC，而幼苗茎部各种儿茶素都含有。 (4)150天的幼苗，根中有D,L-GC，D,L-C和L-EC，木质化茎中有D,L-GC，D,L-C，L-EC，L-EGCG和L-ECG。下部叶中与新梢都含有上述各种儿茶素。

　　综合上述情况可看出：茶籽萌发和幼苗生长过程中，最初形成的是非酯型儿茶素，后经羟基化和没食子酰基化形成了没食子基儿茶素和儿茶素没食子酸酯。生长60—70天的幼苗中便具有成长茶树新梢所含有的各种儿茶素了。酯型儿茶素只有在茶树地上部分才含有，而根部仅有非酯型儿茶素，看来没食子酰基化作用在根部是缺乏的。

　　(二)茶叶中儿茶素的生物合成途径

　　同位素示踪法实验证明：儿茶素分子中的A环来自‘乙酸盐’单位，由三个乙酸分子头尾相接形成;

　　B环与C环上的碳原子则来自莽草酸途径(shikimic acid pathway);然后，A环和B环缩合成查尔酮，进一步形成C6-C3-C6环。 儿茶素的生物合成大致可分为以下三个步骤：1.合成莽草酸;2.形成苯丙酸盐;3.儿茶素的合成。

　　1、莽草酸(shikimic acid)合成途径

　　莽草酸是植物和微生物中芳香氨基酸生物合成的关键中间体，而且莽草酸途径也是高等植物特有的生物合成途径，它本身是碳水化合物代谢产物。

　　莽草酸合成途径如下： (1)磷酸烯醇式丙酮酸(PEP )和D-赤藓糖-4磷酸盐，进行立体专一的缩合反应，形成了3-脱氧-D-7磷酸阿拉伯庚酮糖酸(DAHP);

　　(2)DAHP闭环形成去氢奎尼酸，再经可逆的去氢作用形成去氢莽草酸，再产生莽草酸及其3-磷酸盐;

　　(3)再与一个PEP缩合产生磷酸盐化合物, 经1、4-消除转变为分支酸，然后形成芳香氨基酸。

　　在茶树的枝条中，莽草酸作为儿茶素和黄酮类化合物的前体要比L-苯丙氨酸和肉桂酸更加有效。(zaprometor和Bukhlaeva,1968,1971)，预示着可能存在3,4,5-三羟基肉桂酸可从莽草酸通过更直接的路线越过肉桂酸而形成，也说明由莽草酸形成儿茶素和黄酮类化合物，不一定非经过苯丙氨酸。

　　2、苯丙酸盐的形成

　　苯丙氨酸是苯丙酸盐途径的起始物，也是将植物细胞初级代谢与次级代谢相连接的重要物质。在此途径中，有3个酶将苯丙氨酸转化为对香豆酰CoA，即苯丙氨酸解氨酶(PAL)，桂皮酸(肉桂酸)-4-羟基化酶(C4H)和4-香豆酸、辅酶A连接酶(4CL)。(注：4-羟基桂皮酸又称对-香豆酸) 香豆酰CoA是植物次生代谢中的又一重要中间产物。此物质可用于合成许多的植物次生代谢产物：类黄酮类物质、木质素等。

　　PAL：苯丙氨酸裂解酶 phenylanine ammonia lyase C4H：肉桂酸-4-羟基化酶 cinnamate-4-hydroxylase 4CL：4-香豆酸辅酶A连接酶 4-coumaroyl:CoA-ligase TAL：酪氨酸氨裂解酶 tyrosine ammonia lyase

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　　3儿茶素合成途径

　　在儿茶素的生物合成中目前比较清楚的是(+)-儿茶素的合成，在茶树中占主导地位的表儿茶素和儿茶素没食子酸酯的生物合成途径还不是非常清楚。 根据现有的研究资料，推测表儿茶素的合成需要一个表异构化酶的作用，在二氢槲皮素或其稍后的阶段改变中间产物的立体构型，再经特异的酶作用形成表儿茶素，但目前还没有关于儿茶素没食子酸酯的形成的研究报道。

　　Flavonoid biosynthesis in the tea plant Camellia sinensis: properties of enzymes of the prominent epicatechin and catechin pathway P.A.N. Punyasiri, I.S.B. Abeysinghe, V. Kumar, D. Treutter, D. Duy, C. Gosch, S. Martens, G. Forkmann, T.C. Fischer (Biochemistry Division, Tea Research Institute of Sri Lanka, Talawakelle, Sri Lanka)

　　Archives of Biochemistry and Biophysics 431 (2004) 22–30

　　三、茶树中多酚类的分解代谢

　　高等植物中，黄酮类化合物的分解代谢，苯甲酸是主要降解产物之一 。

　　扎普罗米托夫利用光合作用制备14C-儿茶素渗入离体的茶树新梢中，发现不论在光或黑暗情况下，由呼吸作用可形成14 CO2 ，在70小时后80%的放射性出现在CO2中。

　　用含14C的(-)-EC，(-)-EGC，(-)-ECG和(-)-EGCG渗入茶树新梢，经55小时后，发现14C分布在CO2(15%)，有机酸 (20%，主要是莽草酸、金鸡纳酸等)，碳水化合物(5%)，蛋白质(2%)，叶绿素和萜类化合物(3%)，酚性化合物(10%)和多聚物(40%木素等)中。且证实儿茶素巳完全分解。儿茶素的氧化聚合或分解代谢反应是根据茶新梢细胞的生理状态和酶的作用来决定的。

　　儿茶素生物合成的细胞定位

　　早期曾假定类黄酮物质是在液泡中合成的;近些年来，证实了黄酮类化合物可以在细胞质内合成。某些组分再运输到液泡里去。 此外，叶绿体可能与黄酮类化合物合成有关，在叶绿体中已发现若干与酚性物质代谢有关的酶。

　　本节小结

　　多酚类物质主要集中在茶树新梢的旺盛部分，且随新梢伸育度的提高，其含量逐渐下降。 茶叶中多酚类物质的组成中以L-EGCG含量最高，其次是L-ECG和L-EGC。随着新梢伸育程度增长，L-EGCG和L-ECG的含量逐次降低，L-EGC有所增加。 云南大叶种的儿茶素总量高于小叶种，其中L-EGCG较高外，L-ECG、L-EC+D，L-C增加更为显著。

　　多酚类物质在茶树体内的分布

　　儿茶素在不同季节的变化中含量上有差异。其中以夏茶中含量最高，秋茶次之，春茶最少。 此外，多酚类的含量随着海拔增加含量降低。

　　茶树体内多酚物质的形成与转化

　　儿茶素在体内形成过程 在茶籽萌发和幼苗生长过程中，最初形成的是非酯型儿茶素，如D,L-C和L-EC等，然后再经羟基化和没食子酰基化形成没食子儿茶素(如L-EGC和D,L-GC)和儿茶素没食子酸酯(如L-EGCG和L-ECG)。

　　茶叶中儿茶素的生物合成途径 以磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤藓糖为起始物经莽草酸途径合成苯丙氨酸;苯丙氨酸在苯丙氨酸脱羧酶等的作用下经肉桂酸等系列反应生成香豆酰CoA;香豆酰CoA和丙酮酰CoA在查尔酮合成酶等的作用合成黄烷酮、黄烷酮醇、羟基[4]黄烷酮醇，最后合成黄烷醇即儿茶素类。

　　多酚类的分解代谢 儿茶素的主要降解产物之一为苯甲酸 。 此外，儿茶素的降解产物除可进一步分解成为CO2(15%)外，还可参与其他物质如多聚物(40%木素等)、有机酸 (20%，主要是莽草酸、金鸡纳酸等)，酚性化合物(10%)、碳水化合物(5%)、叶绿素和萜类化合物(3%)、蛋白质(2%)等的合成。

　　作业题

　　不同叶位、不同季节、不同品种、不同海拔对多酚类物质含量的影响? 简述儿茶素的生物合成途径?