医学免疫学 实验课.ppt

　　按学号入座

　　(Gp:) 讲台

　　医学免疫学 实验课 Xxx 免疫学教研室

　　实验课占总成绩15%，包括实验报告(10分)及课堂表现 (5分)。 准时，注意课堂纪律 穿白大衣 贵重物品随身携带 爱惜实验室设备和器材 注意水、电 课后恢复实验台初始状态 分组值日(生活垃圾自行带走，实验垃圾放入黄色垃圾袋，利器(包括针头、玻片)放入利器盒内)

　　课程要求

　　1.移液器的使用 2.异种抗原免疫(小鼠腹腔免疫) 3.ELISA实验原理介绍 4.玻片法凝集实验检测血型 5.双向免疫扩散实验

　　实验安排

　　重点： 掌握凝集反应和沉淀反应的原理 掌握抗原抗体反应特点 难点： ELISA实验原理

　　实验内容

　　1、选择适当量程的加样器 P10： 0.5～10 μl 白色 P200： 20～200 μl 黄色 P1000：200～1000 μl 蓝色 2、转动旋钮，调整量取体积 顺时针旋转减少体积 逆时针旋转增加体积 禁止超出量程范围，否则会损坏加样器

　　加样器使用方法及注意事项

　　3、拇指操作加样器芯，其它四指弯曲握住加样器 4、按加样器芯时会遇到两个阻力点 吸取液体时只需按到第一个阻力点; 完全排出液体时才按到第二个阻力点;

　　5、实验完成之后，将加样器调至最大量程。

　　试剂与材料 包被液(绵羊红细胞裂解液) 封闭液(1% BSA/PBS 溶液) 洗涤液(PBS+Tween20，pH7.4)

　　实验1 ELISA实验准备(包被、封闭)

　　Y

　　Y

　　Y

　　Y

　　Y

　　Y

　　Y

　　(Gp:) Y

　　(Gp:) Y

　　(Gp:) Y

　　(Gp:) Y

　　(Gp:) Y

　　(Gp:) Y

　　SRBC碎片—Ag

　　Y

　　待测血清-Ab

　　(Gp:) Y

　　酶标二抗

　　底物

　　产物

　　酶联免疫吸附实验 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)

　　即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测抗原和特异性抗体等。

　　实验步骤

　　(Gp:) 加包被液(SRBC)

　　(Gp:) 每孔100μl, 37℃ 孵育 50min

　　(Gp:) 洗板2次，弃上清，加封闭液，每孔200μl

　　(Gp:) 37℃，30min

　　(Gp:) 弃去孔中液体，洗板1次

　　每2名同学1条反应板

　　拍干板条， 4 ℃保存备用

　　注意标记!

　　4人一组 2人一只小鼠 实验组：腹腔注射2%的SRBC 1ml 对照组：腹腔注射生理盐水 1ml

　　实验二 小鼠腹腔免疫

　　昆明鼠(6-8周，雌性) 绵羊红细胞悬液(2%) 生理盐水 5ml注射器(把针头带着针头套一起放入利器盒)

　　实验材料：

　　用右手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部，放在铁笼上，小鼠自然向前挣扎 用左手食指和拇指捏住小鼠头部两边疏松的皮肤提起小鼠 用左手小指和无名指压住小鼠尾部，固定小鼠 注意：小鼠尾巴的尾端容易断裂，抓小鼠应抓尾巴中部或根部

　　小鼠抓取固定方法：

　　小鼠的抓取及固定

　　左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上 右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两侧进行穿刺，针头刺入皮肤后进针3mm左右 使注射针头与皮肤呈45°角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后阻力消失，有落空感 固定针头，保持针尖不动后即可注射

　　腹腔注射:

　　腹腔免疫

　　注射之前排空注射器中的空气 SRBC使用之前要混匀 小鼠会咬人，一定固定好头部 最好一次成功，否则老鼠会受到惊吓 进针后的落空感 记住小鼠的标记，做好记录

　　注意事项

　　血型测定(玻片法凝集反应)

　　实验三

　　抗原抗体反应

　　即体外进行的Ag-Ab反应，抗原抗体在体外发生的特异性结合反应后出现凝集、沉淀等现象来检测相应的抗体或抗原，由于机体绝大部分抗体存在于血清中，故又叫血清学反应。 常用于疾病诊断、病原微生物鉴定、流行病学调查以及科学研究工作。

　　特点：

　　(1)特异性：高度专一性; (2)可逆性：分子表面的可逆性结合; (3)比例性：Ag、Ab比例合适才会出现肉眼可见的反应; (4)阶段性。

　　概念：

　　1.特异性--抗原与抗体结合反应的专一性

　　抗原抗体反应特异性示意图

　　分子基础: 抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性

　　2.可逆性

　　抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性。

　　影响因素： 抗体对相应抗原的亲合力 pH、离子强度

　　反应的最适条件：

　　(Gp:) 电解质：0.85% NaCl

　　(Gp:) 酸碱度：pH6～8(7.0)

　　(Gp:) 温度：15～400C(370C 是抗原抗体反应的最适温度)。

　　结合力：

　　静电引力 范德华力 氢键 疏水作用力

　　3.比例性--抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系

　　前带(prezone)：抗体过量 后带(postzone)：抗原过量 等价带(equivalence zone)： 抗原抗体比例合适

　　抗原抗体反应比例性示意图

　　4.阶段性

　　第一阶段： 特异性结合阶段，反应快，不可见 第二阶段： 可见反应阶段，反应慢，出现凝集、 沉淀和细胞溶解等现象

　　1.颗粒性抗原与相应抗体结合所产生的凝集反应 2.可溶性抗原与相应抗体结合所产生的沉淀反应 3.抗原抗体结合后激活补体所致的细胞溶解反应 4.细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应 5.免疫标记的抗原抗体反应

　　抗原抗体反应类型

　　(antigen-antibody reaction)

　　概念 在颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原(或抗体)中加入相应的抗体(或抗原)，在电解质存在的条件下出现凝集物的现象，称凝集反应。 分类 直接凝集反应：试管法和玻片法 间接凝集反应 间接凝集抑制试验 协同凝集反应

　　1. 凝集反应

　　直接凝集反应： 颗粒性抗原在有电解参与下，直接与相应抗体结合出现的凝集现象。常用于抗原鉴定或抗体检测。

　　分类： 1.玻片凝集反应 2.试管凝集反应

　　血型抗原测定-玻片凝集反应

　　人外周血红细胞 抗-A及抗-B标准血清 载玻片、采血针、消毒棉球等

　　试剂与器材:

　　取清洁玻片一张，两侧各加一滴抗A及抗B血清 采血针刺破指尖或耳垂，用灭菌玻片的两个角分别取血，与抗体混合 轻轻摇动玻片，经1～2 分钟后肉眼观察结果 出现红细胞凝集颗粒者即为阳性反应，仍为均匀混悬液者为阴性反应

　　操作方法:

　　(Gp:) Anti-A

　　(Gp:) Anti-B

　　拍照留取实验结果

　　血型与性格

　　可溶性抗原(如细菌培养滤液、外毒素、血清蛋白等)与相应的抗体结合，在一定条件(适量的电解质，合适的酸碱度和温度)下，形成肉眼可见的沉淀现象，这个过程称为沉淀反应。反应中的抗原称为沉淀原(precipitinogen)，其相应抗体称为沉淀素(precipitin)。

　　2、沉淀反应

　　可溶性抗原和抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在二者比例适当的地方形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 包括：1.单向扩散试验 2.双向免疫扩散试验

　　凝胶内沉淀试验

　　琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，冷却后凝固，内部形成网状结构，可以作为大分子化合物分离扩散的载体。

　　将抗体预先混入琼脂中，铺板，然后在板上打孔，孔中加入抗原。因为抗原能在琼脂中扩散，所以在抗原抗体比例适宜处形成白色沉淀环。环的直径与抗原量成正相关。

　　单向免疫扩散

　　原理:

　　(Gp:) Ab

　　(Gp:) 18

　　(Gp:) 36

　　(Gp:) 72

　　(Gp:) 144

　　(Gp:) 288

　　(Gp:) N

　　(Gp:) S

　　当抗原和抗体加入含有适量电解质的琼脂凝胶的相邻的孔中，它们向四周扩散，若两者相互对应，分子比例适合，在扩散一定时间后在两孔之间相遇并结合生成白色沉淀线。

　　双向免疫扩散

　　浓度：抗原浓度越高，形成的沉淀线距离抗原孔越远，抗体浓度越高，形成的沉淀线距抗体孔越远; 抗原或抗体相对分子量：抗原或抗体在琼脂内的扩散受分子量影响，分子量大者扩散速度慢，扩散圈小，局部浓度高，因此形成的沉淀圈弯向分子量大的一方，若二者分子量相等，则沉淀线呈直线;

　　Ab

　　Ag

　　抗原或抗体是否存在; 抗原或抗体的纯度;若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，就能产生相应数量的分离的沉淀线。

　　结果分析

　　A：Ag、Ab浓度及扩散率近似;B ： Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag> Ab ; C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag< Ab ; D： 扩散率近似，浓度Ag > Ab ; E：浓度Ag > Ab，扩散率Ag > Ab ;F：浓度Ag < Ab，扩散率Ag < Ab

　　沉淀线特征(数量，形状、位置)判定抗原或抗体的扩散率及浓度。

　　1、一种抗原抗体复合物只出现一条沉淀线; 2、距离沉淀线越远的浓度越高; 3、对打孔时，沉淀线弯向的一方扩散率低;

　　(1) 沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相同。 (2) 沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。 (3) 沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。 (4) 沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。

　　A1：待检抗原;A2：标准抗原

　　根据沉淀线出现的数目、位置以及相邻二条沉淀线之间的融合、交叉、分枝等情况，就可了解抗原的组成。

　　1

　　2

　　3

　　4

　　双向免疫扩散实验

　　目的 定性检测人血清甲胎蛋白(AFP) 试剂与器材 1.5%琼脂 人血清样品1和样品2 阳性对照血清 抗人AFP抗体 琼脂板、打孔器，微量加样器，湿盒，温箱

　　称取一定量的琼脂粉，按1.5%的比例加入生理盐水或缓冲液，煮沸融化。

　　1.将4ml琼脂倒入琼脂板中

　　2.将融化的琼脂倒入琼脂板，使厚度2mm～3mm。自然冷却。 3.根据要求(孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径7mm)打成梅花形孔图(7个孔)。

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) P

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) Ab

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) P

　　(Gp:) 7mm

　　4.挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。 5.吸取样品加入孔内(约15ul)，，以加满为度。 6.盖上琼脂板盖，置湿盘中，37℃自由扩散24h～48h。

　　阳性对照

　　结果分析： 阳性对照孔和样品孔分别与抗体小孔之间出现白色沉淀线。两条沉淀线相会后融合在一起，说明样品孔与阳性对照孔为相同成分。

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) P

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) Ab

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) P

　　(Gp:) 7mm

　　实验注意事项与小结

　　1.腹腔免疫过程中注意小鼠抓取要牢固 2.血型检测实验结果的判读 3.抗原抗体反应是ELISA实验，凝集反应，沉淀反应的基础原理。 其特点包括：特异性，可逆性，比例性，阶段性