实验六 转化及重组子的筛选.ppt

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　　标题： 实验六 转化及重组子的筛选

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　　实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果与讨论

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　　标题： 实验目的

　　正文： 了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义; 学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化子的方法。

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　　标题： 实验原理

　　正文： 转化(transformation)是将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。其原理是细菌处于0℃， CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

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　　正文： 转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体(transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。

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　　(Gp:) 基因导入方法: 1)电击法 (Gene transfer by electroporation)

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　　(Gp:) 基因导入方法: 2)基因枪法(Biolistic-bombardment)(植物细胞)

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　　Transfer of T-DNA from Agrobacterium into a plant cell

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　　Regeneration of leaf disks infected by Agrobacterium

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　　DNA重组

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　　正文： 外源基因插入与否可通过载体上的Lac Z基因进行初步的筛选。有外源基因插入的细菌呈白斑，无外源基因插入的细菌呈蓝斑。

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　　Alfa互补

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　　标题： 实验仪器、材料与试剂

　　正文： (一)仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 恒温水浴锅 4. 恒温箱 5. 微量取液器

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　　正文： (二)材料 1. 实验四所得连接产物 2. 实验五制备的大肠杆菌感受态细胞

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　　正文： (三)试剂 1. LB固体培养基 2. 氨苄青霉素(Amp) 100mg/ml

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　　标题： 实验步骤

　　正文： 转化: 1.取适量连接产物加到分装的200 μL感受态细胞中，冰上混匀，冰浴30min;此过程中，需倒含氨苄的LB平板。 2.42℃热激90s，迅速在冰浴中冷3-5min; 3.上述管中加入600μL LB培养基，于37℃振荡培养45min;此过程中，在LB平板上涂布X-Gal 40 μL和IPTG 20 μL 。

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　　正文： 4.取适量菌液涂布LB平板(含Amp 50μg/ml)，室温涂布均匀后(至菌液完全被吸干)，于37℃倒置，过夜培养; 5.观察菌落，筛选阳性克隆。

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　　标题： 实验结果与讨论

　　正文： 经抗生素初筛长出的细菌常出现假阳性的现象，为确定外源基因已转化入细菌，需另外的酶切和PCR验证。

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