合成生物学导论.ppt

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　　合成生物学导论

　　xxx

　　内容安排

　　(Gp:) 合成生物学概述

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 生物系统的设计与分析

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 经典实例解析

　　合成生物学的定义

　　Synthetic Biology is： A) the design and construction of new biological parts, devices, and systems, and B) the re-design of existing, natural biological systems for useful purposes. http://syntheticbiology.org/

　　合成生物学的学科基础与应用范围

　　(Gp:) 数学

　　(Gp:) 物理学

　　(Gp:) 工程学

　　(Gp:) 生物学

　　(Gp:) 计算机科学

　　(Gp:) 化学

　　(Gp:) 信息学

　　(Gp:) 合成生物学

　　(Gp:) 生物质能

　　(Gp:) 生物医学

　　(Gp:) 环境修复

　　(Gp:) 精细化学品

　　(Gp:) 食品原料

　　(Gp:) 生物材料

　　(Gp:) 生物传感器

　　(Gp:) 生物计算机

　　(Gp:) 应用

　　合成生物学的研究内容

　　生物大分子的合成与模块化生物基因组的合成、简化与重构合成代谢网络遗传/基因线路的设计与构建细胞群体系统及多细胞系统研究数学模拟和功能预测

　　(Gp:) 1

　　(Gp:) 2

　　(Gp:) 3

　　(Gp:) 4

　　(Gp:) 6

　　(Gp:) 5

　　生物大分子的合成与模块化

　　核酸分子的人工合成 DNA从头合成(de novo DNA synthesis)技术 S. A. Benner等人人工制造了两种核苷：K和X，组成了被其称之为AEGIS (An Expanded Genetic Information System)的系统，而且证明了核苷酸的种类可以多达12种之多。斯坦福大学的化学家E. T. Kool在原有的四种碱基上增加苯环，形成新的四种碱基，并制造了加长的双螺旋新分子“xDNA”，增加了DNA双链的间距，使DNA分子双链的氢键断裂温度提高。这段双螺旋能在黑暗的环境中发光并且能在较高的温度下仍然保持稳定。

　　生物基因组的合成、简化与重构

　　人工合成生物全基因组 1979年H. G. Khorana合成了酪氨酸阻遏tRNA基因(207bp); 2002年纽约州立大学石溪分校魏玛(E.Wimmer)小组用了3年的时间合成出了脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)的全基因组，7500bp。 2003年，J. C. Venter 研究小组用了14天时间从头合成了噬菌体Phi X174(5386 bp)基因组。 2004年，人工合成了1918年造成全世界上千万人死亡的“西班牙流感病毒”。 2008年J. C. Venter小组又合成了Mycoplasma genitalium生殖道支原体基因组(582790kb)，这是迄今为止人类在合成生物过程中走得最远的一步。 J. C. Venter小组?的另外一项工作却获得了成功：不久前将关系较近的两株支原体中一株的基因组用另外一株的基因组替换，结果仍能正常“工作”。

　　最小细菌基因组的必要条件

　　●必不可少(或必需)的蛋白质编码基因 (Essential genes); ●必不可少(或必需)的RNA分子编码基因; ●必不可少(或必需)的非编码序列(启动子序列;TFBS; 复制起始原点区 oriC 等); ●………………………………

　　http://tubic.tju.edu.cn/deg/

　　基因组简化(Genome reduction)

　　● 2006年SCIENCE 发表了美国威斯康星大学Blattnerj教授小组的论文：“减少了大肠杆菌基因组所出现的性质”。通过有计划地精确地删除，使所设计的菌种基因组减少高达15%，但却保留了好的生长状态和蛋白质生产。 ● 基因组减少还导致了没有料想到的有益性质：高的电穿孔效率、重组基因和质粒的精确繁殖，而这些质粒在其它菌种中是不稳定的。

　　枯草杆菌(Bacillus subtilis)

　　No. of essential genes 271

　　生殖道支原体(Mycoplasma genitalium)

　　No. of essential genes 381

　　流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)

　　No. of essential genes 642

　　Database of Essential Genes5210 (DEG 4.0)

　　http://tubic.tju.edu.cn

　　重构(Refactoring)T7噬菌体基因组

　　第一步是重新注释野生型噬菌体T7基因组。第二步是将含有39977个碱基对的T7噬菌体基因组划分为73个单元，每个单元包含一个或多个元件。

　　增加了1424个碱基对

　　合成生物学的研究内容

　　合成代谢网络利用转录和翻译控制单元调控酶的表达以合成或分解代谢物。主要以代谢物浓度作为控制元件的输入信号。例如：利用酿酒酵母和大肠杆菌合成抗疟疾药物青蒿素的前体物质。遗传/基因线路的设计与构建 1961年F. Jacob和J. Monod提出的乳糖操纵子模型第一次明确提出了基因表达的调控概念，被认为是分子生物学发展的第二个里程碑。细胞群体系统及多细胞系统研究基于细胞间交流的细胞群体系统及多细胞系统的开发，主要是研究细胞群体间的同步基因表达、信号交流、异步功能配合等。数学模拟和功能预测一种科学只有在成功地运用了数学时，才算真正达到完善的地步。 --卡尔.马克思

　　合成生物学的工程本质

　　合成生物学区别现有生物学其它学科的主要特点:

　　“工程化”

　　(Gp:) GTTTCTT……TCTAGA G

　　(Gp:) Part1

　　(Gp:) GTTTCCT……TCTAGTG

　　(Gp:) Part2

　　(Gp:) GTTTCCT……TCTAGTG

　　(Gp:) Part n

　　········

　　(Gp:) Device1

　　(Gp:) Device2

　　(Gp:) Device m

　　········

　　(Gp:) System

　　(Gp:) 逆向工程

　　(Gp:) 正向工程

　　标准化

　　解耦

　　抽提

　　合成生物学的工程本质

　　标准化(Standardization)：

　　为了实现元件的“即插即用”性能，不同部件之间的连接需要进行标准化定义。只有这种标准化定义被广泛采用，才能保证不同公司和组织的研究人员设计和构建的单元能够相互匹配。

　　合成生物学的工程本质

　　解耦(Decoupling) 将一个复杂问题分解成许多相对简单的可以独立处理的问题，最终整合成具有特定功能的统一整体。

　　合成生物学的工程本质

　　抽提(Abstraction) 利用抽象的层次模型以不同水平的复杂程度组织描述生物功能的信息。在每一个水平的工作不需要考虑任何其它水平的细节;不同水平间原则上只允许有限的信息交流。组成生物系统的部件和装置应该重新设计和构建，进行适当简化以方便模拟和组合。例如：天然转录启动子、核糖体结合位点和开放阅读框(ORF)的崭新组合等。

　　2.1合成生物学的模块化设计

　　模块(Module)，必须具有以下几种基本属性：接口、功能、逻辑、状态。接口、功能与状态反映模块的外部特性，逻辑反映模块的内部特性。

　　模块化(Block-based design)系统设计：首先利用“解耦”的思想，将整个系统按照某一标准(功能、时间等)进行分割，分割成相对独立的子系统; 以“标准化”的思想定义和验证各子系统之间的输入、输出连接关系; 利用逐步细化的“抽提”方法得到一系列以功能块(子系统)为单位的算法描述。

　　功能相对独立

　　2.2标准化生物模块—生物积块“Biobrick”

　　经过标准化处理，具有标准的酶切位点的功能DNA序列。

　　(Gp:) 功能片段

　　(Gp:) 载体

　　(Gp:) E

　　(Gp:) X

　　(Gp:) S

　　(Gp:) P

　　标准化生物模块—生物积块“Biobrick”

　　生物积块是标准化的生物模块，种类多，相互之间容易连接，可供选择的余地大。相当多的生物积块经过基因工程手段改造和实验检验，在模式菌等菌种中具有很好的生物功能，消除了直接从自然生物中克隆基因造成的异源表达问题。标准化的酶切位点，省去寻找和优化内切酶、连接酶等DNA重组工具的繁琐，节省时间，提高效率。标准化的描述文件和分类方法，为使用者迅速找到理想的模块提供了便利。标准化的动力学参数模拟和标准化的载体、宿主背景，为模块的功能预测奠定参考、比较和优化平台。 iGEM Registry提供的交流平台和文献资料中有许多使用者对于生物积块的宝贵经验共享，可以互相取长补短

　　“Biobrick”的连接

　　(Gp:) X

　　(Gp:) S

　　(Gp:) P

　　(Gp:) E

　　(Gp:) X

　　(Gp:) S

　　BioBrick 命名归则

　　http://partsregistry.org

　　合成生物学的工程本质

　　合成生物学区别现有生物学其它学科的主要特点:

　　“工程化”

　　(Gp:) GTTTCTT……TCTAGA G

　　(Gp:) Part1

　　(Gp:) GTTTCCT……TCTAGTG

　　(Gp:) Part2

　　(Gp:) GTTTCCT……TCTAGTG

　　(Gp:) Part n

　　········

　　(Gp:) Device1

　　(Gp:) Device2

　　(Gp:) Device m

　　········

　　(Gp:) System

　　(Gp:) 逆向工程

　　(Gp:) 正向工程

　　标准化

　　解耦

　　抽提

　　生物部件“Part”

　　基因线路中最简单、最基本的生物积块称为生物部件—“Part”。“Part”是指具有特定功能的核苷或者DNA序列，能够通过标准化组装方法与其它“Part”组装成具有更复杂功能的模块。

　　启动子

　　终止子

　　RBS

　　生物装置“Device”

　　生物设备通过调控信息流、代谢作用、生物合成功能以及与其它设备和环境进行交流等方式处理“输入”产生“输出”。

　　监测器(Reporter) 翻转器(Inverter) 信号传递装置(Singaling) 蛋白发生装置(Protein generator)

　　生物系统“System”

　　群体效应(Quorum sensing，QS)机制是微生物的一种交流系统，在该系统内微生物通过自身产生的一种化学信号来感受群体的浓度，从而表现出某些特殊行为。

　　注意多路通讯彼此的绝缘和干扰。

　　只有在微生物密度达到一定阈值后才会发生，也称为细胞密度依赖的基因表达(cell density dependent control of gene expression)。

　　群体效应

　　luxR

　　luxI

　　luxC

　　luxD

　　luxA

　　luxB

　　luxE

　　luxG

　　LuxPL

　　LuxPR

　　LuxR

　　LuxI

　　低细胞浓度

　　高细胞浓度

　　LuxR

　　荧光素酶

　　(Gp:) 荧光

　　第二部分合成生物系统的逻辑拓扑结构

　　串联：从概念上讲，串联是指上游模块的输出信号作为下游模块的输入信号的连接形式。

　　(Gp:) Module1

　　(Gp:) Module2

　　(Gp:) Module N

　　第二部分合成生物系统的逻辑拓扑结构

　　单输入(Single Input Module, SIM)

　　Module N

　　Main Module

　　Module 2

　　Module1

　　可实现模块的时序控制。

　　第二部分合成生物系统的逻辑拓扑结构

　　单输入(Single Input Module, SIM)

　　argA

　　argCBH

　　argD

　　argE

　　argR

　　复杂调控结构

　　第二部分合成生物系统的逻辑拓扑结构

　　第三章、合成生物系统的数学模拟与性能分析

　　合成生物学导论

　　3.1常微分方程(Ordinary differential equation ODE)

　　常微分方程(Ordinary differential equation ODE)：如果在一个微分方程中出现的未知函数只含一个自变量，这个方程就叫做常微分方程。

　　对于反应

　　由质量守恒定律能够推导出平衡反应方程：

　　其中A是B和C反应的产物，[*]表示物质的浓度，p是这些分子的亲和力常数。

　　(3-1)

　　3.1.2米氏方程(Michaelis-Menten equation)

　　描述酶促反应的起始速度V与底物浓度[S]之间关系的速度方程

　　3.1.3希尔方程(Hill equation)

　　启动能力与调控因子量之间的关系

　　3.2 Logistic模型

　　细胞的生长与繁殖

　　3.4 随机微分方程

　　基因表达过程中会由于以下原因不可避免的带有随机性。阻遏蛋白与启动子不同位点的结合; 阻遏蛋白从启动子上某个位点脱落; 从未结合阻遏蛋白的启动子上进行转录; 从被蛋白阻遏的启动子上进行转录、翻译; 蛋白质以及mRNA的降解等。

　　3.4 随机微分方程

　　Repressilator确定性模型和随机模型仿真结果图

　　蒙特卡罗(Monte-Carlo)模拟、Gillespi模拟、τ-算法等

　　第二部分合成生物系统性能分析

　　第三章、合成生物系统的数学模拟与性能分析

　　合成生物系统性能分析

　　稳定性(Stability) 系统在任何足够小的初始偏差的作用下，对于暂态扰动的时间响应随着时间的推移而逐渐衰减并趋向于零，则该系统是稳定的;否则，该系统是不稳定的。

　　稳定性是相对而言的，再稳定的系统所能承受的外界干扰也是有限的。

　　反映在暂态扰动消失后的时间响应性质上。

　　合成生物系统性能分析

　　鲁棒性(Robustness)系统的健壮性。系统在一定(结构、大小)的参数摄动下，维持某些性能的特性。

　　它是在异常和危险情况下系统生存的关键。

　　合成生物系统性能分析

　　鲁棒性侧重扰动导致模块自身结构参数变化时维持原来状态的能力; 稳定性则侧重模块受到外界扰动后维持稳定的能力，细胞也许会从原来的稳定状态过渡到新的稳定状态，但仍然维持稳定的能力。

　　合成生物系统性能分析

　　响应快速性处于稳定状态的系统对于外部环境改变的快速反应能力，也是系统在受到扰动后迅速进入稳态的能力。

　　稳定性

　　鲁棒性

　　合成生物学导论

　　第四章、合成生物学的基础研究 ksong@tju.edu.cn

　　中心法则

　　转录水平调控

　　翻译水平调控

　　DNA

　　(Gp:) R

　　(Gp:) NA

　　(Gp:)

　　蛋白质

　　转录

　　翻译

　　复制

　　逆转录

　　调控

　　遗传线路(Genetic circuit)，俗称“基因线路”(gene circuit)。在合成生物学中由各种调节元件和被调节的基因组合成的遗传装置(genetic device)，可以在给定条件下可调、可定时定量地表达基因产物。

　　4.1逻辑门功能遗传线路

　　逻辑门

　　启动子2

　　启动子1

　　lacI

　　GFP

　　tetR

　　荧光

　　IPTG

　　aTc

　　IPTG aTc GFP 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1

　　与门

　　IPTG

　　aTc

　　4.1逻辑门功能遗传线路

　　逻辑门

　　启动子2

　　启动子1

　　lacI

　　tetR

　　GFP

　　启动子3

　　IPTG

　　aTc

　　荧光

　　IPTG

　　aTc

　　IPTG aTc GFP 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1

　　或门

　　4.2基因调控开关——双稳态开关

　　也称“拨动开关”，可通过人为调控实现基因线路在两种不同稳定状态间的切换。经典的双稳态开关由两个启动子组成， “开”和“关”状态之间界限明显。只有瞬态的诱导因素变化才能切换，移除输入激励后仍会维持原状态。状态需要时间转换，具有滞后性，起始状态为“开”或“关”时会得到不同的响应曲线。具有“记忆”的功能。

　　4.2基因调控开关——双稳态开关

　　启动子2

　　抑制子1

　　启动子1

　　抑制子2

　　gfp

　　诱导子1

　　诱导子2

　　4.2基因调控开关——双稳态开关

　　4.3 Repressilator

　　PLlacO1

　　tetR-lite

　　PLtetO1

　　cI-lite

　　lacI-lite

　　TetR

　　(Gp:) LacI

　　gfp

　　PLtetO1

　　(Gp:) CI

　　Continue…

　　4.3 Repressilator

　　4.6人工细胞群体图案系统

　　gfp

　　luxI

　　PLtetO-1

　　lacIM1

　　gfp

　　信号发生细胞

　　高浓度

　　中浓度

　　lacI

　　lacIM1

　　gfp

　　低浓度

　　lacIM1

　　lacI

　　基因线路的空间响应

　　4.6人工细胞群体图案系统

　　合成青蒿酸的微生物工厂

　　1)将大肠杆菌中常见的化学物质乙酰辅酶A转变成甲羟戊酸; 2)将甲羟戊酸转化成异戊烯焦磷酸酯(IPP) 或者二甲(基)丙烯焦磷酸酯(DMAPP); 3)将IPP或者DMAPP转化成法尼基环焦磷酸酯(FPP); 4)利用ADS基因，将FPP转化成Amorphadiene。

　　IPP和DMAPP是所有类异戊二烯的通用前体物

　　合成青蒿酸的微生物工厂

　　1、净化大肠杆菌中的代谢内环境引入ispC基因，利用其产物将大肠杆菌原有的DXP途径切断 2、合成和优化编码Amorphadiene 合成酶的基因ADS，克服植物基因在大肠杆菌中表达的困难。 3、将酿酒酵母中的甲羟戊酸途径转入大肠杆菌。 4、协调IPP有关的基因以平衡其合成与消耗，确保在其能够杀伤大肠杆菌以前及时转化为Amorphadiene。

　　合成青蒿酸的微生物工厂

　　ERG10

　　ERG13

　　tHMGR

　　乙酰辅酶 A

　　甲羟戊酸

　　ERG12

　　ERG8

　　ERG19

　　idi

　　IPP

　　DMAPP

　　Amorphadiene

　　ADS

　　DPP

　　FPP

　　ERG20

　　青蒿酸

　　CYP71AV1/CPR

　　1)优化FPP生物合成途径提高FPP的产量; 2)从黄花蒿中引入紫穗槐二烯合成酶(ADS)基因，其表达的产物将FPP转化为Amorphadiene; 3)通过比较基因组学分析得到来自于A.annua 的细胞色素P450氧化还原酶- CYP71AV1/CPR，克隆表达后实现Amorphadiene到青蒿酸的三步氧化还原反应而得到青蒿酸。

　　合成青蒿酸的微生物工厂

　　优化青蒿酸产量： 1)过量表达tHMGR，有效限制FPP向固醇的转化。 2)通过甲硫氨酸可抑制启动子(PMET3)下调ERG9编码角鲨烯(squalene)合成酶，阻断FPP 向下合成固醇的支路，避免FPP在其他方面的不必要消耗; 3)过表达upc2-1并结合ERG9的下调时; 4)所有被修饰基因都整合到染色体上确保稳定性; 5)降低细胞密度，避免不必要的互相干扰和确保养分充足。

　　153mg/l，提高了近500倍

　　大肠杆菌成像系统

　　合成生物学在其他方面的应用

　　大肠杆菌呈像系统

　　1)光感应器的构建将取自Synechocystis的藻胆青素合成基因(ho1和pcyA)构建在质粒上引入大肠杆菌，将血红素转化为藻胆青素(PCB)使E coli.能够产生光敏色素感光。

　　大肠杆菌呈像系统

　　2)应答调节子将PCB双组份系统的胞外部分与E coli. EnvZ-OmpR双组份系统的胞内部分进行交联，将光反应传递给EnvZ-OmpR。

　　大肠杆菌呈像系统

　　呈像部分将lacZ基因与大肠杆菌染色体上的ompC基因做成融合基因，由OmpR蛋白控制这个融合基因的表达。 lacZ基因编码的LacZ蛋白能够催化S-Gal (一种稳定的可溶于水的DNA染色剂)产生黑色化合物。

　　大肠杆菌呈像系统

　　当有外界光照刺激时，感光蛋白刺激并抑制EnvZ蛋白的自磷酸化过程，EnvZ蛋白通过使OmpR蛋白也无法磷酸化, 将其启动子关闭，作为融合基因的lacZ基因无法表达，此区域中无黑色化合物产生为菌苔原有的颜色;

　　omp