双缩脲法测定蛋白质浓度.ppt
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标题: 实验 双缩脲法测定蛋白质浓度
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正文: 实验目的 1.学习蛋白质含量测定的原理和方法 2.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法
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标题: 蛋白质含量测定的原理和方法
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标题: 微量凯氏定氮法
正文: 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨,氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱消化液,使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中,然后再用标准酸溶液进行滴定,滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol),根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。 因为蛋白质含氮量通常在16 %左右,所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25,便得到该样品的蛋白质含量。
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消 化
(Gp:) CO2+SO2+H2O+NH3 ↑
(Gp:) +浓H2SO4
(Gp:) N
(Gp:) NH3+H2SO4
(Gp:) (NH4)2SO4
蒸 馏
(Gp:) H2O+Na2SO4+NH3↑
(Gp:) (NH4)2SO4+NaOH
吸 收
(Gp:) NH3+H3BO3
(Gp:) NH4HB4O7+H2O
滴 定
(Gp:) NH4HB4O7+HCl+H2O
(Gp:) NH4Cl+H3BO3
氮的总量测定—凯氏定氮法
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正文: 原理:当脲加热至180oC时,两分子脲缩合,放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物,即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键,与双缩脲结构相似,故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比,可用来进行蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围为1-10mg
双缩脲法
(Gp:) 540 nm
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标题: Folin-酚试剂法(Lowry法)
正文: Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上,引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂),蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂,生成蓝色物质。在一定条件下,蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高(20-250?g)、较紫外吸收法灵敏10—20倍,较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。
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标题: 紫外分光光度法
正文: 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,因此蛋白质具有吸收紫外线的性质,吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内,蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系,可用作定量测定。 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品,低浓度盐类不干扰测定。
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总蛋白定量分析-BCA(Bicinchoninic acid,二辛可宁酸、二羧基二喹啉)
?准确灵敏:BCA试剂的蛋白质测定范围是20-2000μg/mL;Micro BCA试剂测定范围是0.5-20μg/mL ?快速:45分钟内完成测定,比经典的Lowry法快4倍而且更加方便 ?经济实用:除试管外,测定可在微孔板中进行,大大节约样品和试剂用量 ?不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 ?检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝
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?基本原理: 碱性条件下,蛋白将Cu2+还原为Cu+, Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物,测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。
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标题: 考马斯亮蓝染色法
正文: 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律 ,因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高10-100μg (比Lowry法灵敏4倍)。
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Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
(Gp:) PROTEIN
(Gp:) +
(Gp:) Amax = 595nm
(Gp:) BLUE
(Gp:) Acid
(Gp:) Coomassie G-250
(Gp:) Protein - Dye Complex
(Gp:) O
(Gp:) CH
(Gp:) 2
(Gp:) CH
(Gp:) 3
(Gp:) NH
(Gp:) C
(Gp:) CH
(Gp:) 3
(Gp:) CH
(Gp:) 3
(Gp:) N
(Gp:) CH
(Gp:) 2
(Gp:) SO
(Gp:) 3
(Gp:) -
(Gp:) CH
(Gp:) 3
(Gp:) CH
(Gp:) 2
(Gp:) N
(Gp:) CH
(Gp:) 2
(Gp:) CH
(Gp:) 2
(Gp:) CH
(Gp:) 3
(Gp:) SO
(Gp:) 3
(Gp:) Na
(Gp:) +
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蛋白质含量的测定
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正文: 本次实验采用双缩脲法测定蛋白质含量
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正文: 原理:当脲加热至180oC时,两分子脲缩合,放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合物,即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键,与双缩脲结构相似,故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比,可用来进行蛋白质定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围为1-10mg
双缩脲法
(Gp:) 540 nm
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正文: 一、操作步骤 1.取15支试管,按下表编号、加试剂(做2个平行组)
2.各管混匀后,加入双缩脲试剂3.0mL,37oC反应30min。 3.以0号管调零,测定各管540nm光吸收值。
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正文: 二、结果处理 1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标,OD540为纵坐标,绘制标准曲线。 2.样品的计算 根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量(mg),再根据样品的体积计算出样品的浓度。 三、注意事项 1.须于显色后30min内测定,且各管由显色到比色时间应尽可能一致。 2.样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 3.用坐标纸绘制标准曲线,注明轴名称及单位。 4.比色杯的使用
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