第六章 DNA重组的操作.ppt
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标题： 第六章 DNA重组的操作
第一节 DNA的体外重组 第二节 重组体导入受体细胞的原理与技术 第三节 重组子的筛选和鉴定
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外源DNA
载体DNA
重组分子
原核细胞
真核细胞
扩增或表达
表达
连接
转化或转导
电穿孔或显微注射
受体细胞
标题： 第一节 DNA的体外重组
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标题： 第一节 DNA的体外重组
正文： 一、黏性末端的连接 二、平末端的连接 三、PCR产物的连接 四、Gateway载体构建系统
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标题： 第一节 DNA的体外重组
重组DNA
重组DNA是来源不同的DNA在体外结合在一起从而形成的新的DNA分子Recombinant DNA 形成重组DNA的目的有三个： (i)形成新的蛋白产物 (ii)形成多拷贝的基因 (iii) 插入外源基因片段到新的物种中从而赋予其新的特性
一、重组DNA的概念和目的
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标题： 第一节 DNA的体外重组
正文： 二、外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接(由同一种酶或同尾酶产生末端)
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标题： 第一节 DNA的体外重组
二、外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 (1)具有相同粘末端的DNA分子之间的连接
使用碱性磷酸酶处理载体DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化 。
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标题： 第一节 DNA的体外重组
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标题： 第一节 DNA的体外重组
正文： 二、外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 (2)具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接
(Gp:) HindIII
(Gp:) EcoRI
(Gp:) HindIII
(Gp:) EcoRI
(Gp:) 对载体酶切
(Gp:) HindIII
(Gp:) EcoRI
(Gp:) 对基因酶切
质粒载体的定向重组
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标题： 第一节 DNA的体外重组
正文： 二、外源基因与载体的连接 2. 平头末端连接 (1) 直接连接 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
-OH
-OH
-P
-P
P-
P-
HO-
HO-
5’
3’
-OH
-P
P-
HO-
5’
3’
3’
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标题： 第一节 DNA的体外重组
非酶切位点
二、外源基因与载体的连接 2. 平头末端连接 (2) 人工加尾形成 “粘性末端” a)同聚加尾 法
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标题： 第一节 DNA的体外重组
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标题： 第一节 DNA的体外重组
正文： 二、外源基因与载体的连接 2. 平头末端连接 (2) 人工加尾形成 “粘性末端” b)衔接物(linker)连接 Linker:用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。 linker的作用：用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。
GGAATTCC CCTTAAGG
EcoRI linker：
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标题： 第一节 DNA的体外重组
衔接物(linker)连接
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标题： 第一节 DNA的体外重组
衔接物(linker)连接
优点： 1)可以用内切酶把插入片段切下来。 2)能给载体连接上Polylinker 缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段
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标题： 第一节 DNA的体外重组
正文： 二、外源基因与载体的连接 2. 平头末端连接 (2) 人工加尾形成 “粘性末端” c) DNA接头 (adapter)连接法 adapter: 有单链，也有双链。双链的一头平末端、另一头粘性末端(某种酶切位点序列)。 adapter的作用:用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。
5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’
BamHI adapter
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标题： 第一节 DNA的体外重组
缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。 防止自我连接：先用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 (以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。)
c) DNA接头 (adapter)连接法
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正文： 二、外源基因与载体的连接 3.PCR产物的连接 (1)在引物的5’端设计酶切位点
GCAGAATTC
互补序列
3’端15~20bp与模板互补; 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列
(5’端多余的3~5bp属保护碱基)
第一节 DNA的体外重组
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标题： 第一节 DNA的体外重组
引物1
GCAGAATTC
互补序列
模板
EcoRI位点
5’-
-3’
GCAGAATTC
互补序列
5’-
-3’
3’
模板
GCAGAATTC
互补序列 PCR产物
5’-
-3’
3’
复性
延伸
模板
模板
3’
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标题： 第一节 DNA的体外重组
GCTAGCCGG
互补序列
模板
BamH I 位点
-5’
3-’
复性
延伸
模板
模板
3’
3’
GCTAGCCGG
互补序列
3’-
模板
GCTAGCCGG
PCR产物 互补序列
引物2
3’
3’
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标题： 第一节 DNA的体外重组
正文： 二、外源基因与载体的连接 3. PCR产物的连接 (2)与T载体直接连接 Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸(优先加A),因此PCR产物两个3’端一般都有一个A T载体的两个3’端人为地各加一个T：利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T!
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标题： 第一节 DNA的体外重组
A
A
dNTP
T
T
dTTP
Taq DNA聚合酶
载体
PCR产物
T A
T A
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标题： 第一节 DNA的体外重组
T载体图
二、外源基因与载体的连接 3. PCR产物的连接 (2)与T载体直接连接
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标题： 第一节 DNA的体外重组
二、外源基因与载体的连接 传统方法
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标题： 第一节 DNA的体外重组
正文： 二、外源基因与载体的连接 4.Gateway 载体构建系统 利用λ噬菌体的位点特异性重组系统，在不进行酶切和连接的基础上实现基因快速克隆及载体间平行转移，有利于保持正确的开放阅读框和插入方向。
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标题： 第一节 DNA的体外重组
二、外源基因与载体的连接 4.Gateway 载体构建系统
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标题： 第一节 DNA的体外重组
二、外源基因与载体的连接 4.Gateway 载体构建系统
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4、Gateway 载体构建系统
?噬菌体位点特异性重组系统; 高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。
入门克隆
改造过的各种表达载体
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4、Gateway 载体构建系统
(1)创建入门克隆 BP反应：attB+attP attL+attR，产物：入门克隆
入门克隆
改造过的各种表达载体
√
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4、Gateway 载体构建系统
(2)构建表达克隆 LR反应：attL+attR attB+attP，产物：表达克隆
入门克隆
改造过的各种表达载体
√
√
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标题： 第一节 DNA的体外重组
正文： 三、DNA体外连接应注意的事项 1.插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。 决不能进行非粘性末端连接。
EcoRI
EcoRI
EcoRI
(1)用相同的酶切
(2)用同尾酶切
BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。
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标题： 第一节 DNA的体外重组
正文： 三、DNA体外连接应注意的事项 2. DNA插入的方向正确
由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。
用双酶切
EcoRI
BamHI
EcoRI
BamHI
EcoRI
BamHI
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标题： 第一节 DNA的体外重组
正文： 三、DNA体外连接应注意的事项 3. 插入基因的开放阅读框(ORF)正确 (1)DNA定向插入 (2)起始密码 尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。
ATGGAATTC
载体
ATGCGGAATTCT
插入片断
EcoRI
EcoRI
ATGGAATTC T
重组
但移码突变!
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标题： 第一节 DNA的体外重组
正文： 三、DNA体外连接应注意的事项 4. 防止载体自身环化连接 (1)提高插入片断的用量 连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。 (2)用碱性磷酸酶处理载体 载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。
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标题： 第一节 DNA的体外重组
正文： 四、载体和外源DNA插入片段的连接结果
1. 载体自身环化连接(能存活)
2. 载体之间互相连接(能存活)
3. 插入片段互相连接(不能存活)
4. 一个载体与几个插入片段重组(能存活)
5. 几个载体与一个插入片段重组(能存活)
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标题： 第一节 DNA的体外重组
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