扫描电镜样品制备技术.ppt

　　扫描电镜样品制备技术

　　生物样品主要的特点是： 1、含水分较多，质地柔软，干燥脱水后即干瘪、皱缩、变形; 2、一些幼嫩材料的形态，结构极易受渗透压、PH值等环境变化的影响; 3、机械强度低，不能耐受电子束的轰击; 4、多数生物组织主要是由碳、氢、氧、氮、磷、钾等原子序数较低的元素组成，不易被激发产生二次电子。

　　在进行样品制备时,应掌握以下原则:

　　一、每一过程，都应注意防止对样品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能地保持原有的外貌及微细结构; 二、去除样品内水份，以利于维持SEM的真空度防止对镜筒的污染，但在脱水和干燥处理时，要尽量减少和避免样品体积变小及收缩变形等人工损伤; 三、降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适当的反差和减少样品的充放电效应。

　　高真空二次电子观察模式下，被观察的样品必须具备下述条件：

　　样品必须干燥，不含水分或其他可挥发性物质， 在一定程度上能耐受电子束轰击，具有一定的机械强度， 被激发时能产生二次电子，具有一定的导电性能。

　　扫描电镜样品制备流程图

　　一般制样步骤

　　一 取材 二 清洗 三 2.5%戊二醛固定 四 清洗 五 乙醇梯度脱水 50%、70%、80%、90%、100%两次 临界点干燥或是叔丁醇真空干燥 离子溅射仪喷金 扫描电镜观察拍照

　　一、取材： 迅速、准确 不挤压牵拉 小 (5立方毫米以内，便于快速固定和脱水) 防尘 适当的量(同一样品，3块即可) 分清观察面(宜切长方形，观察面左上角切去)

　　前期制样注意事项

　　清洗(对于扫描电镜来说，固定前的清洗十分重要 )

　　1、组织表面的血液、粘液和其他分泌物，可选用等渗的生理盐水、5%碳酸钠溶液或与固定液相应的缓冲液进行冲洗 2、游离细胞，以及处于悬浮液的微生物、寄生虫等细小的样品，可选用缓冲液或等渗的溶液进行清洗 3、组织培养细胞的清洗一般以选用相应的组织培养液为宜。

　　清洗液的选择

　　清洗方法:

　　1、轻轻摇晃或用振荡器 2、注射器冲洗 3、超声清洗 4、多个烧杯清洗法 用等渗溶液放入3个100ml烧杯中，用镊子夹住样品的边缘，每个烧杯中震荡清洗20次。

　　清洗时注意事项：

　　往容器内添加和更换清洗液时，应沿瓶壁缓缓滴加，尽量避免冲击和夹持样品可能出现的损伤。需用喷射、超声或作用较强的溶剂清洗样品时，要严格控制强度和时间，密切观察样品的变化。 扫描电镜样品制备时常用磷酸盐缓冲液，它是效仿细胞外液的成分而配制的，因其对培养细胞无毒性作用，故最富有生理学功能，适合各种固定液的配制。这种缓冲液在4度下可保存数周，但长期保存会出现沉淀，最好按需要临时配制新鲜缓冲液。

　　固定需要在4℃完成 常用的固定剂是2.5%戊二醛，固定时间一般为1-3小时。对于游离细胞或是培养细胞可缩短至10分钟。 如果用饿酸进行后固定，一般固定时间不超过2小时。

　　固定

　　戊二醛和四氧化锇与细胞主要成分的固定作用比较 —————————————————————————— 固定剂 蛋白质 核蛋白 脂质 糖原 核酸 渗透 电子染 戊二醛 尚好 很好 很差 很好 较好 大 无 四氧化锇 好 很好 良好 很差 很差 小 有 ———————————————————————————

　　用脱水剂取代样品中的游离水以便进行干燥处理. 常用的是酒精和丙酮，方法是递度系列脱水。脱水时间的长短根据样品大小和渗透能力。脱水过程要彻底，100%过程可以重复1-2次。

　　脱水

　　干燥 临界点干燥法 原理：利用物质在临界状态时，气相与液相的界面消失，它们之间的转换没有表面张力。液态CO2置换脱水剂，又在没有表面张力的情况下变为气体，填充样品内部空间。 步骤：脱水 置换(醋酸异戊酯) 预冷 放入样品 注入液态CO2 CO2置换 CO2加温气化 排除CO2

　　叔丁醇干燥法 (1)乙醇梯度脱水至100﹪(70﹪、 80﹪、 90﹪、95﹪和 100﹪/ 2次)5 - 10min/次。 (2) 叔丁醇与乙醇混合液置换至100%叔丁醇。 (3)将标本置于4℃以下使样品快速固化。 叔丁醇溶点约23.5 ℃，约10 ℃以下就变为固态。 (4)移入真空膜机肿罩内让样品在真空下升华干燥。

　　喷金

　　本实验室采用离子溅射镀膜法 目的:防止或减轻放电;防止或减轻电子束损伤;增强图像的亮度和反差;把扫描电镜的信息来源限定于样品表面。平均厚度3~30纳米。

　　放电时对观察电镜有以下影响：

　　1、扫描电子束被不规则地地偏转，其结果使会造成扫描电镜图像的畸形，或出现阶段差; 2、二次电子的发生受到不规则的抑制，或使发生的二次电子偏转，造成扫描电镜图像的一部分或全部变暗; 3、不带导电性的样品常常发生不规则放电，其结果，扫描电镜图像中出现不规则的亮点和亮线; 4、出现象散：其结果为电子束难于聚焦，或使得象散方向发生变化，以致无法消除。

　　操作时注意事项：

　　如果样品干燥不充分，金属颗粒不但不以附着，反而引起样品的损伤，特别是能够放出有机气体的样品，有机气体由于放电而分解，再附着于样品上就会引起样品黑化污染。 经过临界点干燥的样品，如果样品内尚残留醋酸异酯时，则需经较长时间的抽气才能加上高压，当加高压时，若出现样品被白色光柱包围的现象，应立即停止加高压，继续抽气。

　　粘样品:1、导电胶：银粉或石墨粉+低电阻树脂液。 2、导电胶带：双面导电胶带，单面导电胶带。3、观察样品面朝上，注意防尘、防潮和防止易飞散样品的互相混合。4、粉末状样品用吸尔球吹打几次，确保粘牢固。5、有一定厚度的样品，搭接导电条带，将电荷导出。

　　常规制样方法

　　步骤： 取样——清洗——前固定—— 清洗——后固定——清洗——脱水——置换——干燥——镀膜——观察。 适用样品：各种生物材料，如组织样品块。 可以用青霉素小瓶装。

　　直接观察法

　　步骤：取材——自然干燥——常压、低压观察或是可变真空下观察 适用样品：植物干标本、干种子、干果、果壳、牙齿、土壤、岩石等。

　　活体观察法：

　　步骤：取样——清洗或不清洗——胶带粘贴或不粘样——高真空低电压或低真空观察。 适用样品：螟、蚊、蚁、蜂、螨、线虫等昆虫。

　　熏蒸固定观察法

　　步骤：取样——熏蒸固定——镀膜或不镀膜——常压或低压观察。 适用样品：固定基上的培养物如培养细胞的生长繁殖过程，菌落的自然状态，菌丝的生长，孢子的形成等。

　　游离细胞的样品制备

　　在悬浮液中培养的细胞或细菌 贴壁培养的细胞 清洗(用不含牛血清的培养液清洗) ——固定(时间5-10min) ——梯度脱水——自然干燥或利用抽真空的过程干燥——喷金——观察。

　　游离细胞的样品制备

　　培养板中培养的细胞：清洗、固定和脱水步骤都在板内进行。用滴管滴加试剂时注意不要正冲样品，从孔壁一侧温和滴加，另一侧吸出。

　　悬浮培养的细菌或细胞：首先要在盖玻片上造膜，然后滴加适宜浓度的培养液，稍等片刻使其吸附于膜上。清洗、固定和脱水过程都在盖玻片上进行，利用液体的表面张力，每次加液体都使其饱满的覆盖在整个盖玻片上。