第一章 蛋白质的结构与功能概述.ppt

　　第一章 蛋白质的结构与功能 Chemistry of Protein

　　蛋白质

　　什么是蛋白质?

　　蛋白质(protein)是由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。

　　Protein

　　蛋白质研究的历史

　　1833年，Payen和Persoz分离出淀粉酶。 1838年，荷兰科学家 G. J. Mulder引入“protein”(源自希腊字proteios，意为primary)一词 1864年，Hoppe-Seyler从血液分离出血红蛋白，并将其制成结晶。 19世纪末，Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成的，并将氨基酸合成了多种短肽 。

　　1951年, Pauling采用X(射)线晶体衍射发现了蛋白质的二级结构——α-螺旋(α-helix)。 1953年，Frederick Sanger完成胰岛素一级序列测定。 1962年，John Kendrew和Max Perutz确定了血红蛋白的四级结构。 20世纪90年代以后，随着人类基因组计划实施，功能基因组与蛋白质组计划的展开 ，使蛋白质结构与功能的研究达到新的高峰 。

　　蛋白质的生理功能

　　蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。

　　二、催化和调节

　　三、运动和支持

　　一、构成组织和细胞的重要成分

　　肌动蛋白、肌球蛋白

　　胶原蛋白、弹性蛋白

　　酶、激素

　　四、免疫保护

　　蛇毒、蝎毒、蜂毒的溶血蛋白和神经毒蛋 白以及植物毒蛋白和细菌毒素

　　抗体

　　南极鱼和北极鱼含有抗冻蛋白

　　血红蛋白、转铁蛋白

　　五、转运

　　六、基因表达和信号转导功能

　　七、其它功能 卵清蛋白为鸟类的胚胎发育提供氮源; 乳汁中的酪蛋白是哺乳动物幼子的主要氮源; 贝类分泌胶质蛋白，能将贝壳牢固地粘在岩石上

　　正因为蛋白质具有多种多样的生物学功能， 有人把蛋白质称为“功能大分子”。

　　第一节 蛋白质的分子组成

　　一、蛋白质的元素组成

　　碳 52%(50%-55%) 氢 7%(6.9% -7.7%) 氧 23%(21% -24%) 氮 16%(15% -17%) 硫 0-3% 其他 微量

　　蛋白质含量=蛋白质含氮量×6.25 6.25常常被称为蛋白质系数

　　二、蛋白质的基本组成单位

　　蛋白质 (protein)

　　酸解

　　碱解

　　酶解

　　肽 (peptide)

　　氨基酸 (amino acid)

　　(一)氨基酸结构

　　组成蛋白质

　　300多种

　　氨基酸

　　标准氨基酸

　　20种(1种亚氨基酸：脯氨酸)

　　天然 ?

　　基本氨基酸：

　　?

　　?

　　特点：

　　1.α-氨基酸(Pro： α-亚氨基酸) 2.侧链基团R决定氨基酸的种类和性质 3. L-氨基酸(Gly)

　　(Gp:) H

　　(Gp:) 甘氨酸

　　(Gp:) CH3

　　(Gp:) 丙氨酸

　　(Gp:) L-氨基酸的通式

　　(Gp:) R

　　C

　　+

　　N

　　H

　　3

　　C

　　O

　　O

　　-

　　H

　　除甘氨酸外，所有天然α-氨基酸都有不对称碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性

　　氨基酸修饰：

　　4种最常见稀有氨基酸：

　　(Gp:) 据营养学分类

　　(Gp:) 必需AA

　　(Gp:) 非必需AA

　　据R基团化学结构分类

　　芳香族AA(Phe、Tyr、Trp)

　　杂环AA(His、Pro)

　　据氨基、羧基数分类

　　一氨基一羧基AA

　　一氨基二羧基AA(Glu、Asp)

　　二氨基一羧基AA(Lys、His、Arg)

　　脂肪族AA(中性、含羟基或巯基、酸性、碱性)

　　人的必需氨基酸 Lys　Trp　Phe　Val　Met　Leu　Ile　Thr

　　(二)氨基酸的分类

　　非极性脂肪族氨基酸 极性中性氨基酸 芳香族氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸

　　氨基酸可根据侧链结构和理化性质进行分类

　　1.侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族氨基酸

　　(Gp:) 亚氨基

　　2.侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中性氨基酸

　　(甲硫氨酸)

　　3.侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸

　　(Gp:) 吲哚基

　　吲哚基

　　Asp、Glu

　　天

　　4.酸性氨基酸(两个羧基)

　　Lys、Arg、His

　　胍基

　　咪唑基

　　5.碱性氨基酸(两个以上氨基)

　　(三)氨基酸的理化性质

　　1.一般物理性质

　　溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。

　　(2) 熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200℃以上。 (3) 味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。 旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用(-)表示，右旋者用(+)表示。

　　2.氨基酸的紫外吸收特征

　　光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。

　　色氨酸 ?max=280nm 酪氨酸 ?max=275nm 苯丙氨酸 ?max=257nm

　　(1)两性解离及等电点

　　3.化学性质

　　34

　　氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。

　　等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，在电场中既不向阳极也不向阴极移动此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。

　　pH = pI 净电荷=0

　　pH< pI 净电荷为正

　　pH > pI 净电荷为负

　　(Gp:) CH

　　(Gp:) R

　　(Gp:) COOH

　　(Gp:) NH3+

　　(Gp:) CH

　　(Gp:) R

　　(Gp:) COO

　　(Gp:) NH2

　　(Gp:) CH

　　(Gp:) R

　　(Gp:) COO

　　(Gp:) NH3+

　　(Gp:) + H+

　　(Gp:) + OH-

　　(Gp:) + H+

　　(Gp:) + OH-

　　(pK1)

　　(pK2)

　　氨基酸的兼性离子

　　阳离子

　　阴离子

　　(2)茚三酮(ninhydrin)反应

　　氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。

　　+

　　(Gp:) 3H20

　　水合茚三酮(无色)

　　(Gp:) NH3 CO2 RCHO

　　(Gp:) +

　　(Gp:) 还原性茚三酮

　　(Gp:) 紫色化合物

　　(Gp:) (弱酸)

　　(Gp:) 加热

　　水合茚三酮

　　(Gp:) + 2NH3 +

　　(Gp:) 还原性茚三酮

　　37

　　第二节 蛋白质的分子结构

　　蛋白质结构的主要层次

　　一级结构

　　四级结构

　　二级结构

　　三级结构

　　primary structure

　　secondary structure

　　Tertiary structure

　　quariernary structure

　　(Gp:) 超二级结构

　　(Gp:) 结构域

　　(Gp:) supersecondary structure

　　(Gp:) Structure domain

　　一、肽键和肽

　　氨基酸之间通过肽键相连的化合物称为肽

　　两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……

　　肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。

　　由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。

　　(一)肽键

　　共价键是化学键的一种，两个或多个原子共同使用它们的外层电子，在理想情况下达到电子饱和的状态，由此组成比较稳定和坚固的化学结构叫做共价键

　　N C

　　N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端

　　多肽链有两端

　　(二)生物活性肽

　　1.谷胱甘肽(glutachione,简写GSH)

　　谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累

　　2.多肽类激素

　　3.神经肽

　　+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Met-脑啡肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Leu-脑啡肽

　　在神经传导过程中起信号转导作用。

　　二、蛋白质的一级结构 (primary structure)

　　(一)概念

　　蛋白质的一级结构(primary structure) 有时也称为共价结构，是指不同种类、不同数量的氨基酸在多肽链中的连接方式和排列顺序。

　　这是蛋白质最基本的结构，它内寓着决定蛋白质高级结构和生物功能的信息

　　例：牛胰岛素的一级结构

　　(二)结合力

　　蛋白质的一级结构中主要的化学键是肽键， 有些还含有少量的二硫键。

　　三、蛋白质的二级结构 (secondary structure)

　　α-螺旋、β-折叠、β-转角 氢键为主要次级键 主链原子的相对构象，不涉及侧链的构象。

　　(一)肽单位(peptide unit)

　　肽键与相邻的两个α-碳原子所组成的平面， 就称为肽单位。

　　肽单位的特性：

　　1.肽键中-C-N-键的性质介于单、双键之间

　　2.肽单位的六个原子基本上同处于一个平面

　　3.肽平面是肽链折叠的基本单位

　　N C

　　(二)?-螺旋(?-helix)

　　Pauling等人对α-角蛋白(α-keratin)进行了X射线衍射分析，推测蛋白质分子中有重复性结构，并认为这种重复性结构为α-螺旋。

　　α-螺旋的结构特点：

　　1.多态性：多数为右手(较稳定)，亦有少数左手螺旋存在(不稳定);存在尺寸不同的螺旋。

　　2.主链呈螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm

　　3.每一个氨基酸残基中的NH和前面相隔三个残基的C=O之间形成氢键，这是稳定α-螺旋的主要键,肽链上所有的肽键都参与氢键的形成。

　　氢键:与电负性大的原子(氟、氯、氧、氮等)共价结合的氢

　　(三)β-折叠 (β-片层)(?-pleated sheet)

　　结构特点：

　　肽平面之间折叠成锯齿状，相邻肽平面间呈 110°角。 2.依靠C=O与H形成氢键，使构象稳定。

　　3.两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的。

　　4.氨基酸残基的R侧链分布在片层的上方或下方。

　　(四)β-转角(β-turn) β-折角(β-blend)

　　蛋白质分子中，肽链经常会出现180°的回折

　　β-转角中，第一个氨基酸残基的C=O 与第四个残基的N-H形成氢键，从而使结构 稳定。

　　第二个氨基酸常为： 脯氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺

　　(五)无规卷曲 (random coil)

　　又称无规线团或卷曲，它们受侧链相互作用的影响很大。经常构成酶活性部位和其它蛋白质特异的功能部位。

　　无规则卷曲

　　细胞色素C的三级结构

　　在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。

　　(六)模序(motif) 超二级结构(super-secondary structure)

　　A、钙离子结合模体 B、锌指结构

　　四、蛋白质的三级结构(tertiary structure)

　　(一)概念

　　蛋白质的三级结构是指多肽链中所有原子 或基团的空间排列，也就是多肽链在二级结构 的基础上，由氨基酸残基侧链基团的相互作用 使多肽链进一步盘旋或折叠，导致整个分子形 成不规则的特定构象。

　　肌红蛋白的三级结构和 丙糖磷酸异构酶的三级结构图

　　(二)结合力

　　蛋白质三级结构的稳定主要靠非共价键，包括氢键、疏水键、盐键以及范德华力(Vander Waals)等。

　　盐键是蛋白质分子中正、负电荷的侧链基团互相接近，通过静电吸引而形成的，如羧基和氨基、胍基、咪唑基等基团之间的作用力

　　范德华力也叫分子间力，分子型物质能由气态转变为液态，由液态转变为固态，这说明分子间存在着相互作用力，这种作用力称为分子间力或范德华力，它比化学键弱得多。

　　维持蛋白质分子构象的作用力a.盐键 b.氢键 c.疏水键 d.范德华力 e.二硫键

　　(三)结构域

　　共价键

　　大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain) 。

　　五、蛋白质的四级结构 (quaternary structure)

　　(一)概念

　　蛋白质的四级结构是由两个或两个以上 的亚基之间相互作用，彼此以非共价键相连 而形成的更复杂的构象。

　　亚基 (subunit)

　　亚基也叫做亚单位，也有人称之为原聚体 或单体。亚基是具有独立三级结构的多肽链单位。

　　血红蛋白四级结构

　　(二)结合力

　　主要是疏水键，由亚基间氨基酸残基的 疏水基相互作用而形成的。氢键、范德华力、 盐键等在维持四级结构中也起了一定的作用。

　　第三节 蛋白质结构与功能的关系

　　一、一级结构与功能的关系

　　(一)一级结构是空间构象的基础

　　蛋白质的功能与其三级结构密切相关，而特定的三级结构是以氨基酸序列为基础的。

　　(二)一级结构与功能的关系

　　1.一级结构不同生物功能各异

　　加压素：Cys-Tyr-Phe-Glu-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly 催产素：Cys-Tyr-Ile --Glu-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly 加压素：促进血管收缩，升高血压，促进肾小管对 水的重吸收，表现为抗利尿的功能。 催产素：刺激子宫平滑肌收缩，表现为催产的功能。

　　2.一级结构中“关键”部分相同，功能也相同

　　促肾上腺皮质激素(ACTH) 1-24位氨基酸是活性所必需的关键部分。若切去25~39位氨基酸仍具有全部活性。不同动物来源的ACTH其1-24位氨基酸顺序相同，表现出相同的生化功能。差异主要在25-33位上。

　　31-AA 33-AA 人 Ser Glu 猪 Leu Glu 牛 Ser Gln

　　3. 一级结构中“关键”部分发生变化，其生物 活性也改变

　　蛋白质工程 (protein engineering)

　　4. 一级结构的变化与疾病的关系

　　(1) 胰岛素分子病是由于胰岛素分子中B链第二十四位的Phe被Leu取代，使胰岛素成为活性很低的分子，不能降血糖。

　　(2)镰刀状红细胞性贫血

　　血红蛋白β亚基N端的第6号氨基酸残基发生了变异

　　不同生物与人的细胞色素 C 的AA差异数目

　　生物 与人不同的AA数目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊、狗 11 马 12 鸡、火鸡 13 响尾蛇 14 海龟 15 金枪鱼 21 小蝇 25 蛾 31 小麦 35 粗早链孢霉 43 酵母 44

　　5.一级结构与进化

　　二、蛋白质的构象与功能的关系

　　蛋白质的变构现象

　　在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称为蛋白质的变构效应(allosteric effect)。

　　血红蛋白的变构

　　(三)蛋白质构象改变可引起疾病

　　蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。

　　蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。

　　这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨廷顿舞蹈病、疯牛病等。

　　疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrPsc)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。 PrPc在朊病毒蛋白(PrPsc)的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。

　　(Gp:) PrPc α-螺旋

　　(Gp:) PrPsc β-折叠

　　(Gp:) 正常

　　(Gp:) 疯牛病

　　疯牛病中的蛋白质构象改变

　　PrPsc

　　疯牛病中的蛋白质构象改变

　　(Gp:) PrPc α-螺旋

　　(Gp:) PrPsc β-折叠!!

　　(Gp:) 慢性进行性致死性神经变性病

　　(Gp:) 朊蛋白病(蛋白构象病)

　　第四节 蛋白质的理化性质

　　蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物， 其理化性质一部分与氨基酸相似，如两性电 离、等电点、呈色反应、成盐反应等，也有 一部分又不同于氨基酸，如高分子量、胶体 性、变性等。

　　一、蛋白质的两性电离与等电点

　　(Gp:) pH = pI 净电荷=0

　　(Gp:) pH< pI 净电荷为正

　　(Gp:) pH > pI 净电荷为负

　　(Gp:) Pr

　　(Gp:) COOH

　　(Gp:) NH3+

　　(Gp:) + H+

　　(Gp:) + OH-

　　(Gp:) + H+

　　(Gp:) + OH-

　　(Gp:) Pr

　　(Gp:) COO-

　　(Gp:) NH2

　　(Gp:) Pr

　　(Gp:) COO-

　　(Gp:) NH3+

　　当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相等，即成为两性离子 (zwitterion,净电荷为0)，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(isoelectric point，简写pI)。

　　人体体液中许多蛋白质的等电点在pH5.0左右，所以在体液中以负离子形式存在。

　　二、蛋白质的呈色反应

　　(一)茚三酮反应(Ninhydrin Reaction)

　　在弱酸条件下，蛋白质或氨基酸与 茚三酮共热，可产生蓝紫色缩合物。

　　(二)双缩脲反应(Biuret Reaction)

　　蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物

　　(碱性溶液)

　　Cu2+

　　红紫色络合物

　　三、蛋白质的高分子性质

　　(一)蛋白质的胶体性质

　　由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。

　　1.蛋白质表面具有水化层

　　稳定因素：

　　2.蛋白质表面具有同性电荷

　　相互隔开

　　相互排斥

　　S=

　　dx/dt

　　ω2x

　　╳ 1013

　　沉降系数

　　(二)蛋白质的扩散与沉降

　　(三)粘度大

　　与低分子物质比较，蛋白质分子扩散速度慢，粘度大，主要与分子形状，即与分子的不对称性有关。

　　(四)不透过性

　　不能通过半透膜 体内： 生物膜，毛细血管壁 蛋白质可保留在细胞、血管内 体外： 纯化蛋白质

　　透析

　　透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析(dialysis)。

　　(Gp:)

　　(Gp:)

　　(五)蛋白质沉淀

　　蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀(precipitation)

　　变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。

　　(Gp:)

　　(Gp:)

　　加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固(coagulation) 因此，凝固的蛋白质一定发生变性。

　　(Gp:)

　　(Gp:)

　　蛋白质在溶液中稳 定因素

　　析出因素(沉淀)

　　电荷(同性)

　　中和电荷

　　脱水

　　水化膜 (0.3～0.5gH2O/g，pr)

　　常见蛋白质沉淀方法：

　　1.盐析 2.有机溶剂沉淀法 3.加热 4.重金属盐沉淀法 5.生物碱试剂沉淀法

　　1.盐析

　　不变性可逆

　　(NH4)2SO4、NaCl、Na2SO4

　　沉淀 变性

　　盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层,同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析(salting out)。

　　2.有机溶剂(与水互溶)

　　有时变性

　　失去水化层

　　等电点更易沉淀

　　3.加热

　　等电点易沉淀

　　偏酸、偏碱变性但不易沉淀

　　变性

　　4.重金属盐沉淀

　　pH>pI 负离子 与Cu2+ 、Ag+ 、Hg2+ 、Pb2+ 沉淀

　　变性

　　5.生物碱试剂沉淀

　　pH

　　四、蛋白质的变性(denaturation)

　　某些物理和化学因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变，这种现象称为蛋白质的变性作用。

　　(一)定义

　　(二)本质

　　形成空间构象的次级键

　　一级结构、肽键、分子量

　　不变

　　破坏

　　(三)特征

　　1.生物活性丧失 主要

　　2.某些理化性质改变

　　物理：高温、紫外线、X-射线、超声波、 剧烈振荡 化学：强酸、强碱、尿素、去污剂、 重金属离子、生物碱试剂

　　(四)变性因素

　　变性程度：

　　可逆变性 不可逆变性

　　(五)变性作用的意义

　　1.细菌蛋白、杂蛋白应变性除去。

　　2.在制备有生物活性的酶、蛋白质、激素或 其他制品时，要防止变性。

　　避免变性

　　利用变性

　　(六)复性(renaturation)

　　若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素 后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有 的构象和功能，称为复性。

　　重点： 1.氨基酸分类和主要性质、在肽链中氨基酸的连接方式。 2. 蛋白质的分子结构概念和维持键。 3. 蛋白质理化性质：紫外吸收特征、呈色反应、两性电离及等电点、沉淀和变性作用。

　　1.大多数氨基酸与茚三酮反应呈色是什么，有何 例外?双缩脲反应出现在什么化合物中，该反应有何作用? 2.肽键有哪些结构特点? 3.维持蛋白质的一、二、三、四级结构的化学键有哪些? 4.α-螺旋、β-折叠结构有什么特点? 5.何谓蛋白质的变性?变性蛋白质有什么特点?具有三级或四级结构的蛋白质变性后结构上有何变化? 6.蛋白质的沉淀方法有哪些?

　　思考题：