活细胞成像系统介绍.ppt

　　API DeltaVision Elite活细胞成像系统介绍

　　医药研究中心 xxx

　　Deltavision OM0

　　Deltavision Spectris

　　Deltavision Core

　　Deltavision OMX V4

　　Deltavision Elite

　　DeltaVision 历史发展

　　2002年

　　2006年

　　2011年

　　2011年

　　1986年

　　2

　　Robert Horvitz 线虫细胞程序性凋亡研究 2002年诺贝尔生理与医学奖

　　Elizabeth Blackburn 端粒与细胞衰老的研究 2009年诺贝尔生理与医学奖

　　DeltaVision产出众多国际顶级科研成果

　　逾2000篇文献 200余篇封面文章 300余篇Cell , Nature, Science

　　3

　　为什么要做活细胞实验?

　　固定细胞观察仅能提供固定瞬间细胞的静态信息，无法反映细胞在正常生理生化条件下的状态 只有观察活细胞,才能深刻了解生命最基本单元CELL ”从形态到功能”到底发生了什么样的变化,才能最深刻地理解生命本质性的东西 只有通过活细胞实验得到的结果，才能更适合人类的需要

　　活细胞成像是趋势

　　以“live cell”为主题搜索SCI文章

　　DeltaVision成像系统的基础原理

　　快速去卷积(deconvolution)技术

　　(Gp:) object

　　PSF(Point Spread Function,点扩散方程)与镜头NA、介质等光路信息相关

　　DeltaVision成像系统的基础原理

　　快速去卷积(deconvolution)技术

　　(Gp:) 5mm

　　(Gp:) 原始图像

　　(Gp:) 5mm

　　(Gp:) 去卷积后

　　7

　　DV vs. Confocal

　　(Gp:) Confocal (100x/1.4)

　　(Gp:) DV (100x/1.4)

　　(Gp:) TRITC

　　(Gp:) FITC

　　(Gp:) DAPI

　　(Gp:) Merge

　　(Gp:) 10mm

　　8

　　DV vs. Confocal

　　9

　　5mm

　　DV vs. 转盘共聚焦

　　10

　　10mm

　　DeltaVision Elite

　　活细胞培养装置：自动控温(RT~50℃)、预混5%CO2供给 倒置显微镜，使用玻底皿或腔室盖玻片 配有40×,60×,100×高数值孔径物镜 七色固态照明光源 电动高精度载物台 自动化控制台

　　活细胞工作站细胞培养系统

　　CO2流量 控制器

　　温度控制器

　　湿度控制器

　　13

　　培养环境对细胞的影响——温度

　　不同样品需要不同的温度： 注意事项

　　植物实验不能高于28 ℃ 酵母要求30 ℃ ，heat shock后蛋白聚合 普通动物细胞37 ℃ 斑马鱼实验要求40 ℃ 大肠杆菌44℃时死亡

　　避免温差导致的气流扰动 避免温度变化引起的凝胶变形 避免高温引起的水分蒸发

　　目镜

　　10X air, 0.4NA 20X air, 0.75NA 40X air, 0.95NA 60X Oil, 1.42NA 100X Oil, 1.4NA

　　InsightSSI固态照明光源

　　冷光源，对细胞伤害小 光强稳定，光线均匀 波长选择范围广：从紫外到近红外 快速开关及不同波长快速切换：10ms 寿命长：1万小时

　　15

　　InsightSSI固态照明光源

　　Standard：DAPI, FITC, TRITC, CY5 Live cell：CFP, GFP, YFP, mCherry Alexa：DAPI, FITC, A594, CY5

　　NanoMotion全自动3D载物台

　　17

　　softWoRx图像获取软件

　　支持多达四个荧光通道和一个透射光通道同时采集 高速离子成像 3D光学切片 多点拍摄、细胞跟踪 自动对焦 延时拍摄 多视野拼接

　　18

　　活细胞长时间动态/多维观察成像

　　目前可以做到六维(XYZ 三维，时间，不同点，不同波长)成像。

　　XYZ XYZ XYZ XYZλ

　　高速离子成像 结合高速 CCD 和高效的光路，对于快速的离子浓度的变化，最快可以50-100 帧/秒的速度获取图像。 细胞间钙信号的传递，使用Fluo‐3 标记胞内的钙离子

　　Point Visiting(多点观察)

　　Point List记录各点三维坐标

　　22

　　Point Visiting(多点观察)

　　23

　　Cell Tracking(细胞跟踪)

　　智能化的系统：细胞跟踪、自动对焦

　　24

　　Cell Tracking(细胞跟踪)

　　25

　　延时拍摄 通过软件精确的控制，拍摄的时间间隔从数秒到数小时不等，根据实验需求的不同，无论单一层面还是三维结构，都可以获得良好的效果。 正在分裂的Hela 细胞，其中绿色标记微管蛋白，红色标记染色体

　　图像拼接

　　27

　　softWoRx软件图像处理功能

　　自动去卷积运算 支持批量化、队列化图像处理 交互式3D重构 图像数据统计 几何学和强度自动测量 物体运动轨迹分析 FRET分析 共定位分析

　　28

　　3D 还原型去卷积处理 API 将显微镜的硬件设计和后期软件处理完美的结合在一起，通过对光学信号的3D 还原型去卷积处理，大大提高了显微镜的灵敏度和分辨率。 原始图像和经过3D 去卷积处理后图像的对比 A，B 为处理前，C，D 为处理后。

　　荧光共振能量转移(FRET) FRET就是采用非放射方法，在供体和受体相互靠得很近(1-10 nm)时，将光子能从一个受激发的荧光团(供体)转移到另一个荧光团(受体)。可以在活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间的相互作用 记录CFP/YFP，GFP/mcherry(RFP)的荧光强度，进一步计算出蛋白对之间精确的能量转移系数。

　　FRET的一种应用—检测细胞内Ca2+的浓度变化 将CFP和YFP分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一个细胞内。当细胞内具有高的Ca2+浓度时，钙调蛋白和钙调蛋白结合肽结合，可诱发FRET，使受体蛋白YFP发出黄色荧光，细胞呈黄色。当细胞内Ca2+浓度低时，FRET几乎不发生，因此检测时CFP被激发，发出绿色荧光，细胞呈绿色。 细胞内Ca2+浓度通过荧光比率法测定：Ratio=I530/I490

　　细胞荧光测钙方法

　　非比例法测钙 没有光谱位移，只有荧光强度变化发生，不利于定量测定，但是激发光在可见光范围内，单激发单发射适合采集快速/高速细胞钙活动，有利于进行Ca2+ sparks(marks)等测定。 常用探针: Fluo-3，Fluo-4，Calcium Green等 比例法(Ratio)测钙 光谱发生位移、有利于对浓度进行定量的测定，但是需要用紫外光来激发。 常用探针: Indo-1、Fura-2等

　　荧光共定位分析 通过比较多个荧光通道的定位情况，即可知道他们在空间上和时间上的分布信息，进而得到相应的荧光信号是否存在相互作用、协同运动、定向运输等。 体外重组的病毒颗粒侵染细胞，绿色标记病毒的壳蛋白，红色标记病毒的RNA结合蛋白。病毒入侵前，由于病毒颗粒完整，绿色信号和红色信号共定位。病毒入侵细胞后，脱掉表面的壳蛋白，绿色信号和红色信号分离。

　　典型应用：细胞周期/细胞分裂

　　细胞骨架体系研究

　　微管

　　微丝

　　中间丝

　　主要应用领域

　　1)细胞迁移与细胞骨架; 2)细胞分裂与细胞周期; 3)细胞信号转导; 4)组织分化与发育; 5)囊泡和蛋白运输; 6)生理学和神经科学; 7)钙离子信号研究; 8)蛋白质与DNA 的相互作用; 9)宿主与病原体相互作用; 10)癌症研究; 11)药理研究; 12)生物物理研究。