ING4真核表达载体的构建及对胶质瘤细胞U87MG增殖的影响.ppt

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　　ING4真核表达载体的构建及对胶质瘤 细胞U87MG增殖的影响

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　　研究背景

　　INGs(INhibitor of Growth肿瘤生长抑制因子)是近些年发现一个肿瘤抑制基因家族，包括ING1、ING2/ING12L、ING3、ING4 、ING5和三种酿酒酵母INGs(Yng1、Yng2、及Pho23), 它们彼此之间保持较高的同源性。ING4基因是新近发现的ING基因家族的新成员，定位于人12q13-32，由8个外显子和7个内含子组成，编码248个氨基酸分子。其功能可能与负性调节细胞生长和接触抑制及血管生成有关。

　　国外研究发现，多种肿瘤中可发现存在ING4基因的异常或ING4蛋白表达的降低，如乳腺癌、直肠癌、宫颈癌、小细胞肺癌、恶性胶质瘤及头颈部鳞状细胞癌等。

　　研究证实ING4 基因编码蛋白的表达水平随着脑胶质瘤恶性程度的增高而降低。ING4 基因在正常脑胶质细胞中比低度恶性脑胶质瘤中的表达水平高2～3倍，比高度恶性脑胶质瘤中的表达水平高6倍。我们有理由推测ING4基因的异常及蛋白表达降低与胶质瘤发生发展有关。

　　已研究证实，该因子对神经胶质瘤的基因治疗具有潜在的重要价值。为了进一步研究该因子对胶质瘤的治疗价值，我们首先构建真核表达载体pcDNA3.1-ING4,并利用脂质体Lipofectamine2000将其转入U87MG细胞，通过检测ING4基因的表达的改变及胶质瘤细胞U87MG细胞增殖所发生的改变，推测证实ING4对U87MG细胞增殖的影响，并进一步探讨ING4抑制肿瘤细胞增殖的机制是否与p53及cyclinB1有关。

　　材料与方法

　　ING4基因的克隆、序列测定和真核表达载体的构建 。 引物设计 →扩增目的基因片段→目的基因ING4克隆及真核载体pcDNA3.1-ING4的构建→重组质粒的抽提纯化、测序和鉴定 。 2. U87MG细胞培养、ING4基因转染、筛选和表达。 U87MG细胞采用DMEM10%进口小牛血清培养→用Lipofectamine2000将pcDNA3.1-ING4质粒和空载pcDNA3.1质粒分别转染U87MG细胞→在G418压力下筛选，建立稳定表达ING4细胞模型→ 提取转染ING4克隆细胞基因及总蛋白，挑选高表达ING4蛋白的U87MG细胞。

　　3. ING4对U87MG细胞增殖影响的多方面研究。 ①细胞计数及生长曲线绘制 ②细胞集落形成计数 ③MTT法检测细胞生长情况 ④观察ING4对胶质瘤细胞U87MG放射治疗的是否有增 敏作用 ※以上实验均以转染空载质粒的细胞作为对照。 实验④ 给予6000GY γ射线下连续照射。 4. ING4抑制U87MG细胞增殖的机制的研究。 设计P53及cyclinB1 的引物，采用PCR进行基因扩增;应用Western-blot方法 提取细胞中的总蛋白，检测分别转染目的基因ING4质粒及空载质粒U87MG细胞中ING4、P53及cyclinB1基因蛋白表达情况，均以GAPDH为内参照。

　　结 果

　　1.经测序成功扩增出未发生基因突变 的正确的ING4功能片段，大小为750bp。 2. ING4在转染目的基因质粒U87MG细胞中的表达增高。

　　3.绘制生长曲线、集落形成试验、MTT检测显示转染ING4的瘤细胞生长受抑。见图1.2.3 4. ING4增强U87MG细胞对放射治疗的敏感性.见图4 .

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　　图4

　　5.转染ING4的U87MG细胞P53(图1)及cyclinB1(图2.3) 的表达降低。

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　　图2

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　　讨 论

　　Gong等在2004年发现ING4是一种信号分子，可以调节细胞的存活、生长。ING4的表达在人神经胶质瘤组织中与正常脑组织比较是降低的，其表达水平由低级别肿瘤到高级别肿瘤是逐渐下调的，提示ING4表达下降可能与胶质肿瘤的发生有一定关系 。

　　我们构建ING4真核表达载体，转染低表达ING4的U87MG细胞，并通过与转染空载质粒的瘤细胞进行对照，发现无论是在基因水平还是蛋白水平转染ING4质粒的U87MG细胞能够稳定高表达ING4蛋白。同时我们进行了几种反映肿瘤细胞生长增殖速度的实验，实验结果表明转染ING4的瘤细胞生长受到了明显的抑制，同时发现转染ING4瘤细胞在射线照射下致死率明显高于空载细胞，说明ING4能够抑制胶质瘤细胞的生长，可以提高瘤细胞对射线的敏感性。

　　ING4是一种核蛋白，其C端具有核定位信号与p53复合定位于细胞核内。p53是一种多功能蛋白，它的基本功能是作为转录反式作用因子调节转录活性。研究表明ING4功能的发挥是P53依赖的，在我们的研究中发现转染ING4质粒后瘤细胞中P53的表达没有增加，是降低的，这说明ING4不是P53的上游基因，ING4表达增强并不引起P53水平增高，可能通过调节P53下游某种基因的表达来抑制瘤细胞增殖

　　Shiseki等发现在转染ING4的RKO细胞株48小时后ING4基因的高表达引起S期细胞数量减少，以及G1/S和G2/M期细胞数量增加，说明抑癌基因ING4可能引起瘤细胞G1/S期和G2/M期发生阻滞 细胞的分裂是由一组称为细胞周期素cyclin的蛋白和一组依赖于cyclin的蛋白激酶CDK及其抑制物CDKI所调控的。其中，cyclinB1是细胞周期G2/M检测点关键的调控因子。人类多种肿瘤发现有cyclinB1过表达，高表达的cyclinB1不断促进肿瘤细胞分裂和增殖，是肿瘤细胞增殖的重要因素。

　　我们用RT-PCR及Western-blot方法分别检测稳定转染ING4瘤细胞和转染空载质粒瘤细胞中cyclinB1的基因转录及翻译情况，结果显示稳定转染ING4的细胞cyclinB1明显降低，也就是可能由于瘤细胞高表达的ING4蛋白抑制了cyclinB1基因的转录和翻译，从而提示高表达ING4蛋白抑制细胞生长，可能是由于降低P53下游的cyclinB1的表达来实现的。

　　综上所述，我们的研究结果显示，高表达ING4蛋白可抑制胶质瘤细胞的生长，它与P53相互协同并抑制P53的下游基因cyclinB1转录和翻译，使cyclinB1蛋白表达降低，使胶质瘤U87MG细胞发生G2/M期阻滞，抑制瘤细胞增殖。同时我们发现ING4还可以提高胶质瘤细胞对放射线的敏感性。 ING4对神经胶质瘤的基因治疗具有潜在的重要价值。

　　谢谢