大学测试中心质谱仪器介绍——生物质谱平台.ppt

　　大学测试中心质谱仪器介绍 生物质谱平台

　　色质谱机组 xxx

　　2014年03月15日

　　生物质谱 —— 蛋白质组研究的关键技术

　　基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI) LC MALDI TOF/TOF分析与AB SCIEX TOF/TOF? 5800 系统 电喷雾电离(electrospray ionization, ESI) UHR-TOF maXis 超高分辨飞行时间质谱仪

　　LC MALDI TOF/TOF分析与AB SCIEX TOF/TOF? 5800 系统

　　5800 MALDI TOF/TOF 串联飞行时间质谱主机

　　Tempo LC MALDI 点样系统

　　Mascot 2.3 结合Mascot Deamon搜索引擎

　　ProteinPilot 4.0 蛋白分析工具

　　MALDI 的原理 待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。

　　常用的 MALDI 基质

　　MALDI 基质应具有的特性 能够嵌入样品分子间并能起到隔离样品分子之间的相互作用(如形成共结晶); 能溶解于可溶解样品分子的溶剂; 在真空状态下是稳定的; 可吸收激光,既与激光形成共振吸收; 可激发样品分子离子化.

　　是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比 (m/z) 与离子的飞行时间成正比。

　　反射飞行时间质量检测器

　　飞行时间分析器

　　MALDI-TOF/TOF

　　MALDI 源可以电离分子质量为102～106 Da 的生物分子并用于质谱分析。MALDI产生的离子采用飞行时间质量分析器(TOF)来检测，因此适用于蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的测定。 通过第一级TOF选择特定多肽和蛋白，而后送入碰撞池进行裂解，再进入第二级TOF进行序列和修饰等结构解析，完成蛋白质的精确鉴定。 根据测定蛋白质酶解后的肽质量指纹图谱、肽序列标签以及一级质谱(MS)结合串联质谱(MS/MS)法去检索核酸或蛋白质序列库，可达到对蛋白质的快速鉴定和高通量筛选。

　　Tempo LC MALDI 点样系统

　　数据库检索

　　Mascot 2.3 结合Mascot Deamon搜索引擎 ProteinPilot 4.0 蛋白分析工具

　　基于凝胶分离的蛋白质点或者条带的鉴定 (2-DE,DIGE,Co-IP, GST pull down...) 运用质谱进行定量的蛋白质组分析技术 (iTRAQ,SILAC,ICAT...) 生物大分子的分子量分析(<200,000) 蛋白质的序列分析 蛋白质翻译后修饰的分析 有机小分子(>1000)与高聚物分子(基质合适)分析

　　MALDI 源生物质谱技术平台的应用

　　(Gp:) 双向电泳

　　(Gp:) 切胶

　　(Gp:) 酶解

　　(Gp:) 肽提取

　　(Gp:) 点靶

　　(Gp:) 5800数据采集

　　(Gp:) 进靶

　　(Gp:) 一级图谱

　　(Gp:) 二级图谱

　　(Gp:) 二级匹配图谱

　　(Gp:) 数据库检索

　　(Gp:) FEFAPVDTIDEEGTNTVK 115/114=1.0502

　　(Gp:) 匹配肽

　　(Gp:) Glutathione S-transferase 　　　115/114=1.0054

　　(Gp:) 鉴定的蛋白质

　　(Gp:) Western-bloting 验证

　　(Gp:) ProteinPilot? Software / MASCOT

　　2-DE 路线

　　适用于质谱的染色方法

　　荧光染色(SYPRO? Ruby protein gel stain) 考马斯亮兰染色(Bio-Safe? Coomassie? colloidal 250 stain) 银染(Silver Stain Plus? stain)

　　一级图谱

　　二级图谱

　　Mascot Deamon

　　Trypsin digestion

　　LC-MALDI

　　SDS-PAGE

　　免疫共沉淀(Co-IP)

　　GST pull down

　　蛋白质与核酸相互作用鉴定

　　iTRAQ 路线

　　iTRAQ + LC-MALDI + 5800 + ProteinPilot

　　样品标记试剂

　　数据分析软件

　　数据采集质谱

　　液相分离点靶系统

　　iTRAQ试剂

　　LC-MALDI液相点靶系统

　　AB SCIEX TOF/TOF 5800

　　同位素相对标记与绝对定量技术

　　ProteinPilot

　　使用Paragon算法同时搜索几百种种生物修饰及其它修饰、遗传变异、以及未预期的裂解方式，不会增加出现假阳性的几率，也不会延长搜索时间或是增加多级分析的复杂性。 使用嵌入式Pro GroupTM 算法进行蛋白group分析，可区分蛋白异构体，蛋白子集，并抑制假阳性。 定量工作流程 - 为iTRAQTM、ICAT?和 SILACTM试剂工作流程提供优化支持，包括4标(4plex)、8标(8plex)试剂，和用于生物标志物发现及验证的新型试剂mTRAQ。 使用反库(decoy)搜索进行自动化且严密的假阳性率(False Discovery Rate，FDR)分析，可为您的结果提供高级别的质量控制。

　　标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”; 细胞处理、裂解、提取蛋白质; 等量混合对照与处理组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色; 割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。

　　细胞代谢标记(SILAC)

　　生物大分子的分子量分析

　　BSA

　　某蛋白聚合体

　　MALDI 样品基本要求

　　磷酸盐缓冲液 < 50 mM 重碳酸铵 < 30 mM Tris buffer < 100 mM 胍 (盐酸盐, 硫酸盐) < 1 M Triton < 0.1% SDS < 0.01% 碱金属盐 < 1 M 甘油 < 1%

　　蛋白样品具体要求

　　挖点或胶内酶解操作过程中不可使用劣质国产枪头和指形管，防止塑料峰污染 样品防止角蛋白污染 胶粒大小：1.5mm3以下 胶内酶解试剂(色谱级) 染色方法：考染/银染(银染试剂中不能含有戊二醛) 种属名称，搜库要求(参数) LC-MALDI的样品中不要含有乙腈，最好进行过除盐步骤

　　UHR-TOF maXis 超高分辨飞行时间质谱仪

　　仪器型号：maXis 制造厂商：德国Bruker公司 质谱类型：四级杆-飞行时间 主要技术指标： 质量范围：m/z 50～2500 质谱功能：MS，MS/MS 分辨率：> 50000 ( ESI+, m/z=1222 );> 45000 ( ESI-, m/z=1334) MS质量准确度： 优于0.8ppm (全扫描，ESI+, m/z=1222，内标校正) 优于2ppm (全扫描，ESI+, m/z=1222，外标校正) MS/MS质量准确度：优于2ppm (外标校正) 同位素丰度比：平均丰度比误差小于2% (调谐标样) 扫描方式：一级质谱全扫描(MS)，二级质谱全扫描(MS/MS)

　　电喷雾源(ESI源) 利用高电场使质谱进样段的毛细管柱流出的液滴带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至产生的库伦斥力与液滴表面张力达到雷利极限，液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈雾滴状，这时的液滴表面电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器。

　　仪器功能及附件： 1) 离子源：配有ESI电喷雾电离源、APCI大气压化学电离源、nanoESI纳升电喷雾电离源 2) 戴安公司U3000高效液相色谱仪，配有DAD二极管阵列检测器，自动进样器，柱温箱 3) EASY-nLC纳升液相色谱仪 　 应用范围： 用于小分子有机化合物的定性分析，可提供精确质荷比和同位素丰度，推算分子的原子组成;用于中等极性和强极性大分子物质的定性分析，进行蛋白质组学等研究。 优点：高采样速率、高分辨率、高质量准确度、高质量数

　　Multiply Charged Ions

　　ESI spectrum of HEW Lysozyme(溶菌酶) MW = 14,305.14

　　大分子样品会生成带多种电荷 (from 2 to 20 )的样品离子

　　A亚型 MW= 18363.5024

　　B亚型 MW=18277.4748

　　A亚型+B亚型

　　ESI图谱可以灵敏地反映蛋白质的构造

　　Native Azurin

　　Denatured Azurin

　　大部分折叠、拼接或复合的蛋白质的质谱是非高斯分布 的，在图谱上只能观察到少量的峰，代表较高的m/z 值。 变性或open form 蛋白质/多肽较容易离子化，其谱图是多个高斯分布的峰。

　　胶和液相杂合分离路线

　　Agilent 1200-6460 QQQ

　　应用范围： 化工产品的纯度分析与杂质分析 食品中农药兽药残留检测(瘦肉精、抗生素……) 环境污染物检测(水中的藻毒素……) 药物的代谢物分析 氨基酸、多肽的定性定量

　　主要技术指标： 质量范围：m/z 5～3000;质量稳定度：+/- 0.1amu / 8hours; 质谱功能：MS，MS/MS 质量准确度：+/- 0.1amu;分辨率：单位质量分辨;动态线性范围：106;扫描速率：10,000amu/sec MRM灵敏度：ESI+ ：1pg (1.6 fmol) 利血平 信噪比 > 1000∶1 扫描方式：多反应监测(MRM)、全扫描(Full Scan)、母离子扫描、子离子扫描、中性丢失扫描、选择离子扫描

　　色质谱机组 仪器一览

　　谢谢!