高效液相色谱化学发光检测法.ppt

　　高效液相色谱化学发光检测法

　　一.概述

　　高效液相色谱是一种非常有效的分离手段。 它已被广泛用于各种复杂混合物的分离和定量分析。高效液相色谱所用的检测器可分为以下几类： 1. 紫外-可见(UV-VIS)Detector (选择性) 2. 荧光(FL)Detector (选择性) 3. 化学发光 (CL) Detector (选择性) 4. 示差折光检测器 (通用) 每一种物质都有不同的 折射选择性

　　5.电化学检测器 6.放射性检测器 选择性

　　化学发光分析具有灵敏度高、线性范围宽、仪器简单的优点，但选择性较差。而高效液相色谱是非常有效的分离手段，将两者联用，可克服化学发光分析选择性差的缺点。而化学发光检测器又为高效液相色谱提供了高灵敏度的检测手段。

　　安培法 选择性

　　电导法 通用

　　2.仪器

　　Pump

　　Pump

　　Pump

　　Mobile phase

　　LC column

　　CL reagents

　　mixer

　　Observation cell

　　waste

　　inject

　　3. CL检测法需要考虑的问题

　　化学发光反应必须对某类物质响应,如果仅与某一种物质有关,在HPLC中将有限制的应用。 化学发光强度对各种环境因素是敏感的.如温度、溶剂、离子强度、pH和其它物质的存在。在发展HPLC分离操作时，这些因素也须加以控制。因此，分离条件和探测条件可能是不兼容的或两者须相互妥协。 化学发光反应的发射强度不是常数，而是随时间而变化。发射强度ICL随时间衰变曲线不同的CL反应，有不同的衰变曲线。即使同一反应，在不同的条件其衰变曲线也不同。

　　在流动体系中，整个发射强度随时间的衰变曲线将不被观察，被探测的ICL是反应物流经检测池所需时间间隔内对发光强度的积分。 在流动体系中，t由流速和池体积所控制，若V不变， 通过调节流速和流路的设计使Imax与时间窗口相吻合。如下图：

　　ICL

　　ICL

　　t

　　t

　　Lucigenin

　　Luminol

　　cell

　　A

　　B

　　ICL

　　flow

　　time

　　二.过氧草酸酯化学发光反应 在HPLC中的应用

　　1.荧光分析物的测定 多环芳烃(PAHS) polycyclic aromatic hydrocarbons 氨基多环芳烃(Amino-PAHS) 蒽、芘、苯并芘、氨基蒽、氨基芘 2.荧光衍生分析物的测定 一些分析物本身没有荧光，因此必须进行荧光衍生反应，一般衍生在柱前完成。

　　(1)丹磺酰氯及其衍生物 丹磺酰氯是一种非常灵敏的荧光标记试剂，它的分子体积小，已广泛采用。主要用于伯、仲胺和酚羟基化合物。如氨基酸、儿茶酚胺、甾二醇以及某些化合物。

　　(2)衍生物 丹磺酰氯的各种衍生物已经被合成，如 下：

　　丹磺酰氯可用来衍生羰基化合物，如醛、酮酮基皮质甾类、氧代甾族化合物和胆质酸。

　　(3)其它衍生物试剂 荧光胺已用于衍生儿茶酚胺。香豆素类试剂可用于衍生含羰基的羧酸、前列腺素、胺和氟代嘧啶类化合物。

　　3.检测由酶反应产生的过氧化氢

　　酶反应产生的过氧化氢在过量的荧光 物质存在下可由PO-CL测定。此反应可在 pH=7完成，接近大多数的酶反应的pH，这 是利用PO-CL测定H2O2优于Luminol、光泽 精之处。 L-amino acid + H2O +O2 2-oxo acid +NH3 +H2O2

　　L-amino acid

　　oxidase

　　D-glucose +H2O +O2 gluconic acid +H2O2

　　Acetylcholine acetate +choline

　　Choline betaine +H2O2

　　Glucose oxidase

　　acetylcholinesterase

　　Choline oxidose

　　乙酰胆碱

　　胆碱

　　这种柱后反应器一般采用固态酶反应器。

　　Analyte

　　Enzyme

　　Detection limit

　　Cholesterol

　　Lactose

　　Formaldehyde

　　L-Amino acid

　　Cholesterol oxidase

　　半乳糖甙酶

　　β-Galactosidase

　　Aldehyde oxidase

　　L-amino acid oxidase

　　0.1pmol

　　12ng

　　1pmol

　　2pmol

　　Analyte

　　Enzyme

　　Detection limit

　　Acetyl choline

　　Glucose

　　L-Amino acids

　　polyamines

　　胆碱酯酶

　　Glucose oxidase

　　L-Amino acid oxidase

　　Polyamines oxidase

　　1pmol

　　2pmol

　　1pmol

　　5pmol

　　4. 检测能熄灭过氧草酸酯化学发光的物质

　　过氧草酸酯的化学发光反应可被某些物质熄灭，使发光强度大大降低。基于此原理，已研究过HPLC-熄灭化学发光检测器，可用于溴化物、碘化物、硫化物、亚硫酸盐、苯胺类及某些有机硫化合物。 PO-CL detection of hydrogen peroxide produced by enzymatic reaction

　　PO-CL的特点：

　　1. 与荧光检测法相比，PO-CL检测通常可使灵敏度提高30-100%，在酶参加的反应中该方法的选择性也大为提高。 2. 与激光诱导的荧光检测法相比，PO-CL对衍生试剂有较宽的选择范围，而LIF仪器价格昂贵。

　　三. Luminol CL体系在HPLC中的应用

　　1.催化剂 (1)金属离子的测定 金属离子可催化Luminol CL，因此，金 属离子用离子交换柱分离后，可用Luminol CL测定。 如：Cu2+、Co2+、Ni2+ (2)利用抑制剂对Luminol CL产生抑制作用。

　　a. 氨基酸 b. 药物(儿茶酚胺、氨基糖苷抗菌素、庆大霉素C c. 蛋白质(球蛋白、白蛋白)

　　2. 卷入H2O2的测定 利用分析物定量转化为H2O2，主要用于 光氧化的CL体系中。如脂肪族的含氧化合 物：醇、醚、醛、糖类，经HPLC分离后， 经光氧化器产生 H2O2，可用Co2+催化的 Luminol CL体系测定。

　　3. 用Luminol作为标记试剂 Luminol isoluminol和aminobutylehyliso- luminol 通过-NH2与分析物反应，测定luminol 及衍生物的浓度已用于羧酸、胺、甲基睾酮、 氨基酸、核苷、地谷新、人血清中脱氧麻黄碱 等的测定。 四、 Lucigenin 在HPLC中的应用 利用血液及尿液中有机还原剂(还原性糖、 抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、尿酸等)与光泽精 的化学发光反应。通过HPLC分离后，用光泽 精体系检测这些还原性物质。

　　五、生物发光反应在HPLC中的应用  可测ATP、胆酸、肌醇磷酸酯异构体

　　六、 其它化学发光反应在HPLC中的应用 (1)钌试剂CL 钌试剂和还原剂作用可产生CL，发现脂 肪胺与试剂反应产生CL的次序： 叔胺>仲胺>伯胺，芳香胺几乎不发生反应。 钌试剂作为柱后CL衍生试剂，用于脂肪叔胺 的HPLC CL检测，该检测系统也曾用于抗生素、 氨基酸、肽和蛋白质的检测。

　　(2) 邻菲咯啉-H2O2-Cu2+体系 测定蛋白质

　　结论： 以过氧草酸酯CL和Luminol CL体系使用较多。 化学发光检测法是最灵敏的方法之一，其灵敏度比普通荧光法一般高两个数量级。 但CL和HPLC相偶合的条件需要进一步研究和优化。 为了拓宽分析物的范围，衍生化技术的深入研究仍是很重要。