实验一 仪器介绍.ppt

　　实验一 仪器介绍

　　紫外可见分光光度计

　　水平板电泳

　　垂直板电泳

　　超声破碎仪

　　组织匀浆机

　　纯化系统

　　高效液相色谱

　　质谱

　　实验二、三、四酵母蔗糖酶的提取及粗分级分离

　　1、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理。 2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层析技术。 本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。

　　一、实验目的

　　自1860年Bertholet从啤酒酵母(Sacchacomyces Cerevisiae)中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶(invertase)(β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶)(EC.3.2.1.26)特异地催化非还原糖中的β-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。

　　二、实验原理

　　本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。 两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。

　　名称 MW 糖含量 亚基 为蔗糖的Km 为棉子糖的Km pI 最适pH 稳定pH 最适温度 外酶 27万 50% 双 26mM 150 mM 5.0 4.9 3.0-7.5 60℃ 内酶13.5万 <3% 双 25mM 150 mM 5.0 4.5 6.0-9.0 60℃

　　实验中，用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。

　　两种酶的性质对照表如下：

　　一、蔗糖酶的提取与部分纯化(3次); 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 (1次); 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定(2次)。

　　本实验共有三个分实验：

　　细胞破壁的几种方法： 1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

　　(一)蔗糖酶的提取与部分纯化

　　细胞破壁的几种方法：

　　4、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 6、有机溶剂沉淀法：即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低溶质的溶解度使其沉淀被析出。

　　(1)准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 (2)称取2g干啤酒酵母，称10mg蜗牛酶及适量(约4g)二氧化硅，放入研钵中。二氧化硅要预先研细。 (3)量取预冷的蒸馏水12ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需30 min。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。

　　三、操作步骤

　　1. 破壁提取

　　(4)缓慢加入预冷的20ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用10 min。以便将蔗糖酶充分转入水相。 (5)将混合物转入1个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，4℃，4700rpm，10 min。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。 (6)用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，4700rpm，离心10 min。 (7)将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中，标记为“粗级分I”。

　　2. 热处理

　　(1)用广泛pH试纸检查上清液pH，用1M乙酸将pH调至5.0左右。 (2)预先将恒温水浴调到50℃，将盛有调好pH值上清液的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30 min，在保温过程中不断轻摇离心管。 (3)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，4700rpm，离心15 min。 (4)将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量(称为“热级分II”)。

　　3. 乙醇沉淀

　　(1)将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴(没有水的碎冰撒入少量食盐)，逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30 min，再在冰浴中放置10 min，以沉淀完全。 (2)转入离心管中，于4℃，4700rpm，离心15 min，量出体积，留出1.5ml(下次实验测定酶活力)后倾去上清，沉淀用2ml 0.02M pH 7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解，保存于离心管中，盖上盖子，然后将其放入冰箱中冷冻保存(称为“醇级分Ⅲ”)。

　　四、结果预测

　　蛋白质样品进一步除去杂质; 浓缩蛋白样品。

　　实验报告 预习离子交换层析的原理及方法

　　实验五、六 植物组织总DNA的提取及DNA的浓度测定

　　1.掌握CTAB法提取植物总DNA的基本原理和方法。 2.学习紫外分光光度法测定DNA溶液的浓度。

　　一、实验目的

　　二、实验原理

　　通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB, SDS等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

　　再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得植物总DNA溶液。之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到较纯的DNA制剂。

　　DNA的吸收光谱峰在260 nm处，据计算，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50 μg/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。 由于蛋白质的吸收峰在280 nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值为1.8-2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。

　　萝卜子叶

　　三、实验材料

　　四、实验器具、药品试剂

　　水浴锅，研钵，微量移液器，枪头，离心管，台式离心机，液氮，恒温箱，标签纸，紫外分光光度计，磁力搅拌机，剪刀等。

　　2% CTAB抽提缓冲溶液，异丙醇, 氯仿-异戊醇等

　　(Gp:) 10ul

　　(Gp:) 20ul

　　(Gp:) 100ul

　　(Gp:) 1000ul

　　(Gp:) 5ml

　　(Gp:) 1000ul

　　(Gp:) 200ul 100ul 20ul

　　(Gp:) 10ul 2.5ul

　　旋钮，调整刻度

　　量程范围，不能超量程

　　正确握枪姿势

　　注意事项：

　　1.不能超量程使用，不能硬拧移液器; 2.选择合适的吸头，扎取吸头不可用力过大; 3.吸取液体时，应缓慢松开按钮，让液体缓慢上升，用一档; 释放液体时用力达到二档; 3.正确的姿势握移液器，不能倒置，以防有机试剂腐蚀移液器; 4.用完后，应调至最大刻度。

　　五、实验方法

　　(1) 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。 (2) 取少量叶片(5-6片)置于研钵中，磨至匀浆(叶子蒸馏水洗滤纸吸干，酒精棉球擦拭研钵); (3) 加入700 μl的2%CTAB抽提缓冲液混匀; (4) 将磨碎液倒入1.5 ml的灭菌离心管中; (5) 置于65℃的水浴槽中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出;

　　1. DNA的提取

　　注意移液器的正确使用!!

　　(6)冷却1 min后，加入600 μl氯仿-异戊醇(24：1)，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀; (7)放入离心机中10 000 rpm离心10 min,用移液器轻轻地吸取600 μl左右上清液至新离心管中。 (8)将等体积的预冷的异丙醇和80 μl 5 M的醋酸钠加入上清液中。将离心管慢慢上下摇动30 s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物;

　　(9)10000 rpm离心5 min后，立即倒掉上清液，注意勿将白色DNA沉淀倒出; (10)加入700 μl的75%乙醇，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中; (11) 10000 rpm离心1 min后，倒掉上清液，再加入800 μl 75%的乙醇，弹管尖使DNA悬浮;

　　(12)10000 rpm离心30s后，立即倒掉上清液，将离心管倒立于铺开的滤纸上;数分钟后，直立离心管，干燥DNA(自然风干); (13)加入50 μl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解; (14)置于-20℃保存、备用(交给老师)。

　　(1)植物的次生代谢物(主要是胞质内的多酚类或色素类化合物)对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。叶片磨得越细越好。 (2)移液器的使用。 (3)防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。

　　注意事项

　　二、实验基本原理 　　核酸——DNA和RNA所含碱基的苯环结构(嘌呤环和嘧啶环)的共轭双键具有紫外吸收的性质，它们在260nm处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长进行核酸含量的测定。 对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260=0.02。 当OD260=1时，双链DNA含量约为50μg / ml ?????????　　　　　　单链DNA含量约为37μg / ml ?????????

　　当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。由于 DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。所以，一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。 核酸样品纯度判断的一般标准： 　　DNA纯度：OD260/OD280≈1.8，表示为纯的DNA; 　　　　OD260/OD280 >1.9，表示有RNA污染; 　　　　OD260/OD280 <1.6，表示有蛋白质、酚等污染。 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量;同时也会影响酶切和PCR的效果。

　　对照：3ml蒸馏水+10 μl TE 　　　　(每台分光光度计用1个即可) 处理：3ml蒸馏水+10 μl DNA溶液 　　测定260 nm及280 nm的光吸收值，计算DNA浓度及纯度。计算公式如下: dsDNA浓度　=　50 ?g /ml ×(OD260) × 稀释倍数 　DNA纯度： 　OD260/OD280

　　2. DNA浓度的测定

　　实验七 蔗糖酶的柱层析

　　一、蔗糖酶的提取与部分纯化(3次); 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 (1次); 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定(2次)。

　　本实验共有三个分实验：

　　层析

　　层析法的基本原理

　　利用混合物中各组分物理化学性质的差异(如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等)，使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。 Mobile phase：携带样品流过整个系统的流体; Stationary phase：静止不动的一相。

　　层析法的分类

　　流动相有两种状态： *液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相 按两相所处的状态分类： 液相层析 液-固层析 液-液层析 气相层析 气-固层析 气-液层析

　　按层析过程的机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。

　　吸附层析

　　按操作形式不同分类： 柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离; 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的; 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。

　　Column Chromatography

　　离子交换层析原理

　　离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。

　　在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基(Dicthylaminoethyl，DEAE)。 当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基(Carboxymethy，CM)纤维素。

　　离子交换剂(离子交换树脂)： 离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。

　　如羧甲基纤维素离子交换剂组成 纤维素—O—CH2—COO-—Na+ 载体 电荷基团 反离子

　　在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附;当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。

　　蛋白质的电荷性质

　　交换剂对胶体离子(如蛋白质)和无机盐离子(如NaCl)都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl-浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。 在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度(低盐结合、高盐洗脱)，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。

　　离子交换层析过程

　　利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶电荷 不同，因而与离子交换树脂有不同的吸附力 而分离 改变溶液的pH值和盐离子浓度，结合力最小 的蛋白质先洗脱下来。

　　阴离子交换剂分离蛋白质的过程

　　平衡

　　吸附

　　去吸附

　　分离结束

　　再生

　　+

　　低盐

　　高盐

　　利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　Cl-

　　层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备: 层析柱、蠕动泵(恒流泵)、紫外检测仪、部分收集器、梯度洗脱器。

　　层析设备

　　层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器

　　柱上操作 (1)交换剂装柱最简单的交换层析柱可用碱式滴定管代替。处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。 (2)上样向层析柱内倾入样品液 (3) 洗涤杂蛋白 (4)洗脱与收集  不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。

　　离子交换柱层析纯化蔗糖酶 操作步骤： 1. 离子交换剂的处理： DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换剂保存在20%乙醇中，使用前去除乙醇后，用去离子水洗涤3～5次。DEAE-Sepharose Fast Flow 层析柱柱料昂贵，用后务必回收，重复操作时，按“1mol/L NaCl 去离子水”的顺序洗即可。如果交换剂过度污染，再生时用0.5 mol/L NaOH浸泡30 min，用蒸馏水洗到中性，再用1mol/L NaCl 浸泡30 min，用蒸馏水洗到中性。最后保存在20%的酒精溶液中。

　　2. 装柱与平衡： 先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗琼脂糖凝胶几次，装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。(一般洗2-3个柱体积)

　　3. 样品处理及上样与洗脱 醇级分Ⅲ溶液若混浊，则10000rpm，5min离心除去不溶物。取1.5ml上清液(即醇级分Ⅲ样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量)。 将剩余的上清液混合小心地加到层析柱上，不要扰动柱床。上样后，然后再用约20ml 0.02M pH7.3 Tris缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A280降到0.1以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入口的细塑料导管放入不含NaCl的低离子强度溶液的小烧杯中，接好层析柱，打开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯中的洗脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余30 ml高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速3.0 ml/3min。

　　上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用30ml 0.02M pH 7.3的Tris-HCl缓冲液(低盐)和30 ml含1M NaCl的0.02 mol/L pH 7.3的Tris-HCl缓冲液(高盐)，进行线性梯度洗脱。取两个相同直径的50 ml量杯，一个装30 ml含NaCl的高离子强度溶液，另一个装入30 ml低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶液的量杯内放入一个小搅拌子，使两杯溶液形成连通，注意两个杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。

　　测定每管洗脱液的A280光吸收值，合并活性最高的2-3管，量出总体积，此即“柱级分IV”。 注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。

　　实验八 DNA的琼脂糖凝胶电泳

　　相关知识

　　电泳：泳动速度决定于? 琼脂糖凝胶 　 天然琼脂(Agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖(Agarose ，约占80%)及琼脂胶(Agaropectin)组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。

　　核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

　　核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

　　不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环超螺旋DNA(cccDNA)>直线DNA(LDNA，2条链发生断裂)>开环的双链环状DNA(ocDNA，1条链发生断裂)。

　　影响迁移率的因素

　　DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压 一般5V/cm、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。

　　常用染料

　　EB:溴化乙锭(3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐Ethidium　Bromide，EB)，EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。 EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min;不会使核酸断裂;灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出;可以加到样品中可胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。 SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。

　　一、实验目的

　　通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

　　二、实验原理

　　DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电;pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 共价闭环超螺旋DNA(cccDNA)>直线DNA(LDNA，2条链发生断裂)>开环的双链环状DNA(ocDNA，1条链发生断裂)。

　　三、操作步骤

　　A.制胶： 100ml TAE缓冲液+ 0.8 g琼脂糖 三角瓶煮胶 溶解，冷却至60℃(不烫手)，加10μl EB，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子。

　　B.点样： 20μlPCR产物+4μl样品缓冲液=24μl混匀，吸取20μl 加入样品槽 20μl质粒+4μl样品缓冲液=24μl混匀，吸取20μl 加入样品槽、10μl Ⅲ Mark DNA (DL2000) C.电泳：电压3-5V/cm，约100-120V，注意电极方向。 D.观察：紫外透射分析仪下观察成像，时间不要太久。

　　四、实验结果

　　实验九 蔗糖酶各级分蛋白含量测定

　　一、蔗糖酶的提取与部分纯化(3次); 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 (1次); 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定(2次)。

　　本实验共有三个分实验：

　　采用考马斯亮兰染料法(Bradford法)的微量法测定蛋白质含量，参见 实验-“蛋白质含量的测定法” 。各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数，并详细记录稀释倍数的计算(使用移液管和量筒稀释)。下列稀释倍数仅供参考： 粗级分 I： 100倍 热级分II： 50倍 醇级分III： 100倍 柱级分IV： 不稀释

　　各级分蛋白质含量的测定

　　1、蛋白质含量的测定

　　标准蛋白质浓度：1mg/ml

　　标准曲线的绘制

　　2、蛋白含量的计算

　　由样品液的吸光值查标准曲线即可求出蛋白质含量。 样品蛋白浓度(μg/μl)= 式中：M为从标准曲线上查到的蛋白质含量

　　(Gp:) M(μg)

　　(Gp:) 测定的液体体积(μl)

　　实验十 蔗糖酶各级分酶活性测定

　　一、蔗糖酶的提取与部分纯化(3次); 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 (1次); 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定(2次)。

　　本实验共有三个分实验：

　　蔗糖酶各级分活性的测定

　　1. 实验原理

　　测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelson’s试剂法、水杨酸试剂法等，本实验先使用费林试剂法。 费林试剂法灵敏度较高，但数据波动较大，因为反应后溶液的颜色随时间会有变化，因此加样和测定光吸收值时最好能计时。其原理是在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧化，二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与磷钼酸作用，生成兰色溶液，其兰色深度与还原糖的量成正比，于650 nm测定光吸收值。

　　级分I、II、III和IV蔗糖酶活性测定： 用去离子水代替稀释各级分酶液，试测出测酶活合适的稀释倍数： I ： 1000 倍 II ： 1000 倍 III ： 5000 倍 上清：不稀释 IV洗脱峰：10倍 以上稀释倍数仅供参考。

　　加入蔗糖，立即摇匀开始计时，室温反应10min后，立即加碱性铜试剂中止反应。

　　各级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和IV的酶活力测定

　　酶活力单位

　　酶(活力)单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。(U)

　　在最适的反应条件(25℃)下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即 1U=1μmol/min

　　在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位，即 1kat=1mol/s

　　1kat = 6×107 U

　　稀释后酶液的活力(按还原糖计算)： E=A650*0.2*2/ A’650*10*B 式中： A650 ──第2~6管所测A650 A’650──第9管所测A650 0.2 ── 第9管葡萄糖取样量 2 ── 标准葡萄糖浓度2mmol/L = 2μmol/ml 10 ──反应10min B ──每管加入酶液ml数

　　酶的纯度：▲ 总活力=活力单位数/mL酶液×总体积(mL) 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白

　　(Gp:) 纯化倍数 = ——————

　　(Gp:) 每次比活力

　　(Gp:) 第一次比活力

　　(Gp:) 产率%(回收率)= —————— ×100

　　(Gp:) 每次总活力

　　(Gp:) 第一次总活力

　　酶的纯度鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法

　　计算各级分的比活力，纯化倍数及回收率，并将数据列于下表： 级分 I II III IV 记录体积(ml) 蛋白质 (mg/ml) 总蛋白(mg) Units/ml 总Units 比活力Units/mg 纯化倍数 1 回收率% 100

　　纯化倍数=该步的比活力/第一次的比活力 回收率=该步的总活力/第一次的总活力

　　试管用后清洗干净，倒置于试管架上

　　实验十一 植物过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳

　　一、实验目的

　　掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理; 分离过氧化物酶同工酶的电泳过程。

　　二、实验原理

　　同工酶是指生物体中结构和性质不同而能催化相同反应的一类酶。许多酶都具有同工酶(约占已知酶的 40～50% )，凝胶电泳可利用同工酶结构上的差异而将之分离。 过氧化物酶是植物体内常见的氧化还原酶，植物体内的许多生理代谢过程与过氧化物酶及其同工酶的种类有关。利用过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化为蓝色或棕色产物，将经过电泳后的凝胶置于有过氧化氢及联苯胺的溶液中染色，有色部位即为过氧化物酶在凝胶中存在的位置，从而得到过氧化物酶同工酶酶谱。

　　三、操作步骤

　　1 .分离胶的制备 分离胶(浓度7.5%) 重蒸水 　　　　　 6.675 ml 1.5 mol/L Tris-HCl分离胶缓冲液 (pH8.9) 3.75 ml 凝胶贮备液(Acr/Bis) 　　　　　 3.75 ml 10%过硫酸铵 　　　　　 75 μl 1%TEMED 　　　　　 0.75 ml 总体积 　　　　　 15 ml

　　2. 分离胶的灌制

　　混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，留出梳齿的齿高加1cm的空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下约30～60 min，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去干净

　　3.浓缩胶的配制和灌制

　　一般采用3%的浓缩胶，配制方法： 重蒸水 　　　 2.625 ml 0.5 mol/L Tris-HCl浓缩胶缓冲液(pH6.7) 1.25 ml 凝胶贮备液(Acr/Bis) 　　 0.6 ml 10%过硫酸铵 　　 25 μl TEMED 　　 0.5 ml 总体积 　　　　　 5 ml 在烧杯中混匀，灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合(约 20 min)

　　浓缩胶的聚合

　　4. 样品的制备

　　称取 0.5g 植物叶片放入研钵中，再加少许石英砂，研磨成浆状，加入1 ml 提取缓冲液。将此匀浆转移至离心管内，10000rpm,离心 5 min，取50μl上清液到另一离心管，加入等体积上样缓冲液，混匀备用。

　　5.电泳

　　(1) 待浓缩胶完全聚合后，小心拔出齿梳，注入电极缓冲液。 (2) 用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样。 (3) 接上电泳仪，上电极接电源的负极，下电极接电源的正极。打开电泳仪电源开关，调节电流至20～30 mA并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1 cm时，停止电泳。

　　6. 染色液配置

　　联苯胺溶液 10ml 1.5M醋酸钠溶液 10ml 1.5M醋酸溶液 10ml 蒸馏水 70ml 加入50 μl 的H2O2 混匀

　　混匀

　　7. 脱胶及染色

　　从电泳槽中取出的凝胶板。脱出的凝胶放入盛有联苯胺染色液的容器中染色至酶带出现。然后倒出染色液，用水冲洗凝胶，使同工酶带从蓝色渐变为棕色。把凝胶放在灌满水的容器中，观察过氧化物同工酶谱。

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳( Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE)

　　一、PAG 的 组成 PAG是由丙烯酰胺(acrylamide，Acr)单体和N，N’-亚甲基甲叉双丙烯酰胺(N，N，N’，N’-methylene bixacrylamide，Bis)交联剂通过自由基聚合而成的一种多孔三维网状结构。 Acr + Bis-----? 多孔三维网状结构

　　多孔三维网状结构

　　二、PAG的聚合

　　需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。

　　(一)化学聚合：AP-TEMED系统

　　过硫酸胺[(NH4)2S2O8](Ammonium persulfate，AP)作为催化剂，四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。

　　AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离的Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。 TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42- 。 注意： ?TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合 ?分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧 ?升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合

　　三、PAG的浓度与孔径的关系

　　PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。 Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性; <10 很脆，易碎，不透明; >100 糊状不成形，易破碎。

　　凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。 T=(a+b)/v×100% T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。

　　1)凝胶层的不连续性 两层凝胶T不同?孔径不同 浓缩胶(3%)孔径大，分离胶(7.5%)孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。

　　四、不连续 PAGE

　　甘氨酸(pI=6.0)在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶(pH6.7)，甘氨酸解离度(?)很小，有效迁移率(M ?)很低，移动速度较慢，称为慢离子。 HCl 是强电解质，?=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。 蛋白质(pI<6.0)带负电荷，有效迁移率介于两者之间。

　　2)缓冲液离子成分的不连续性

　　凝胶缓冲液Tris-HCl 电极缓冲液 Tris-甘氨酸

　　pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液

　　甘氨酸

　　HCl

　　蛋白质

　　样品胶

　　浓缩胶

　　分离胶

　　低电导区

　　快离子很快移动到最前面，原来它停留在那部分地区则形成了低离子浓度区，即低电导区。低电导区有较高的电位梯度，就引起了电位梯度的突变。这种高电位梯度又使蛋白质阴离子和甘氨酸阴离子在此区域加速前进，追赶快离子。当快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立以后，快离子和慢离子之间造成一个不断向正极移动的界面。夹在快、慢离子间的样品蛋白质阴离子的移动界面就在这个追赶中逐渐被压缩，聚集成一条狭窄的区带。浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍

　　3)pH值的不连续性 为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别。

　　3.分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，Gly-成为快离子。分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离

　　凝胶的pH值明显增加,并导致甘氨酸的大量解离,有效泳动率增加.甘氨酸的分子量远小于蛋白质,它将赶上并超过各种蛋白质分子直接在氯离子后移动.这时,由于凝胶孔径变小,使蛋白质分子的迁移率减小,于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH环境中泳动,分子迁移速度与分子量大小和形状密切相关,分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面.

　　凝胶的制备

　　(Gp:) 分离胶聚合之后

　　灌制浓缩胶

　　在浓缩胶里插梳子

　　浓缩胶的聚合

　　上样

　　电泳

　　实验十二 实验设计

　　酵母蔗糖酶提取与纯化大实验的操作流程?分离过程都运用了哪些技术?写出该大实验分离纯化的策略。 生物分离工程的一般流程，每步中都可以运用哪些分离技术? 现根据所学生物分离工程理论和实验知识，列举出你认为该课程应该开设的实验(8-10个)，并简单说明实验目的。