第六章：放线菌遗传.ppt

　　第六章：放线菌遗传

　　在放线菌遗传学研究中，以链霉菌属(Streptomyces)为主要研究对象。 链霉菌属是革兰氏阳性、丝状土壤细菌。具有复杂的形态分化周期，包括孢子萌发产生分枝状的基质菌丝，基质菌丝再发育成气生菌丝和孢子。 链霉菌属的最显著特征是产生广泛的、具有重要价值的次级代谢产物：如抗生素、水解酶、酶的抑制剂、免疫调节剂和色素等。

　　在自然界已发现的近万种抗生素中，约70%是由链霉菌产生的。在目前已知的约12 000 种抗生素中, 一半以上来源于链霉菌，如链霉素、红霉素、四环素、利福霉素、多氧霉素、阿维菌素、井冈霉素等，这些抗生素已广泛用于医药、农业和畜牧业。

　　1955年塞蒙梯(Semonti)夫妇首先发现天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)可通过遗传交换产生重组体。Hopwood随后也在 S. coelicolor A3(2)菌株中证实了这一重组作用。 20世纪70年代早期，所有研究都集中在描述遗传特征和染色体特性上，1973～1978年研究重点转移到放线菌的性别体系和遗传重组方面。同期，还利用遗传方法对抗生素合成、形态分化、噬菌体等开展了全方位的研究。 20世纪80年代，将重组DNA技术和原生质体融合技术应用在该属的研究中。 20世纪90年代，用分子生物学方法开展了对放线菌的基因组、形态分化的分子机制等方面的研究。

　　放线菌遗传的研究历程：

　　光学显微镜和电镜观察表明，像其他细菌的染色体一样，天蓝色链霉菌A3(2)的染色体 DNA在细胞中以致密的、拟核状态存在。 链霉菌的染色体DNA也是形成许多超螺旋区域，并与蛋白质和RNA分子结合在一起。染色体在菌丝中以多拷贝形式存在，而在孢子中以单拷贝形式存在。

　　第一节 链霉菌的染色体

　　一、链霉菌的染色体DNA

　　几乎所有链霉菌的染色体都为线性而非环状，链霉菌只有一条染色体，基因内部无内含子。 染色体大约均为 8Mb，几乎是大肠杆菌染色体的2倍，少数链霉菌的染色体小于8Mb。链霉菌基因组G+C含量为73%～75%，重复DNA序列为4%-11%。

　　天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)染色体的基本特征

　　线性染色体具有两个结构特征： 1、染色体的两个末端具有长度为24-600kb的反向重复序列，简称TIR (terminal inverted repeat)。 如：天蓝色链霉菌的TIR为61kb 变铅青链霉菌的TIR为30kb 灰色链霉菌 (S.grlseus)的TIR为24kb 2、每个DNA链的5’末端都有共价结合蛋白，简称 TP (terminal protein)。

　　天蓝色链霉菌A3 M145菌株基因组全长8,667,507bp，含有7825个编码基因，是迄今为止拥有最多基因的细菌。其中调控基因有965个，占整个基因组的12.3%。编码次级代谢产物(包括抗生素)合成酶基因大约占基因组的5%，平均每个基因编码区的长度为1.14kb。 天蓝色链霉菌A3 M145和变铅青链霉菌的染色体中央有复制起点oriC，一般认为链霉菌线性染色体的复制通过oriC复制原点进行双向复制，末端蛋白作为引物(TP-primesed)引导染色体末端及冈崎片段的合成。

　　1997年8月英国开始对天蓝色链霉菌A3(2)M145菌株的基因组进行全序列测定，并于2001年7月在英国剑桥Sanger中心完成。这是放线菌中第一个完成全基因组测序的种。

　　链霉菌染色体的“ 一区两臂”结构 链霉菌线性染色体和质粒具有相似的结构，一般分为核心区和两臂区。 “ 核心区”约5Mb， “ 左臂”大约1.5Mb ， “ 右臂”2.3Mb。两“ 臂”长度不等被认为是进化过程中由于缺失、插入或复制不平衡的结果。在较长的右“ 臂”上存在大量转移因子，导致其基因信息量的扩增。 核心区是遗传相对稳定区域，生命活动的必需基因均位于此。两臂区位于染色体的两个线性末端，长度有一定差异，富含小的回文重复序列，5’-端与蛋白质共价结合，并受其保护。链霉菌“ 核心区”富含行使重要细胞功能的基因，不对称分布在复制起点oriC周围，其基因和基因次序具有很高的保守性，而两“ 臂”主要含“ 次重要”基因，保守性较弱。

　　遗传不稳定性是链霉菌的主要特征之一，这与其较大的线性染色体直接相关。 线性染色体末端容易丢失，有时可达2Mb(占整个基因组的1/4)，失去部分末端序列并不影响链霉菌的生长，但影响次生代谢，如气生菌丝及孢子形成、抗生素、色素的生成。 线状结构并非染色体不稳定的原因，体内人为环化染色体实验证实，环化染色体比线状染色体更不稳定，末端序列缺失甚至达到100%。 染色体末端的不稳定性是链霉菌基因组的独特性之一，并可能在进化中行使重要作用。

　　链霉菌染色体末端的不稳定性

　　链霉菌染色体富含次生代谢基因簇和调控基因

　　链霉菌中某一特定次生代谢途径相关的基因通常以基因簇(cluster)的形式存在于线状染色体上。链霉菌基因组富含次生代谢物合成基因簇。 S.coelicolor基因组中有23个参与形成次生代谢产物的基因簇，约占基因组总量的5%。 S.avermitilis中则有30个次生代谢基因簇，占全基因组的6%。 链霉菌基因组同样富含编码调控蛋白的基因，如S.coelicolor能编码965种蛋白参与遗传调节，占整个基因组的12.3%。链霉菌这种基因组构成特点与其生存在高度竞争的土壤环境中相适应。

　　链霉菌的染色体具有高度的遗传不稳定性，常发生缺失和扩增，引起染色体重排。染色体缺失的范围可高达2000kb以上。染色体扩增是指某些染色体DNA序列的拷贝数专一地大量增加的现象。 在描述染色体扩增时常用到AUD和ADS术语： AUD (amplified unit of DNA)是指扩增单位，来定义DNA扩增的区域，AUD的长度为5～25kb，两侧是1～2kb的重复序列。 ADS(amplified DNA sequence)是用来定义扩增的 DNA序列，是扩增单位通过串联重复而形成。

　　二、链霉菌染色体的缺失、扩增和重排

　　在基因扩增的突变体中，扩增的DNA序列(ADS)很容易检测，因为在染色体酶切电泳图谱中，ADS呈很强的带型。在有些突变体中，ADS是染色体的重要组成成分，含量可高达染色体DNA的30%。 链霉菌染色体的缺失和扩增引起的自发突变可高达0.1%一1%，用UV照射或生长过程中加入溴化乙锭后，突变率可达10%甚至更高。

　　链霉菌中的扩增主要有I型和II型两种形式： I型：同一个菌不同突变株中的扩增单位(AUD)不同，但是ADS 都位于一个特殊的染色体区域。 II型：在同一个菌的不同突变株中都有相同的AUD，且AUD必须具有两个至少0.8 kb的正向重复序列。目前研究 得最为清楚的II型扩增是变铅青链霉菌中的AUD1。

　　在变铅青链霉菌66和天蓝色链霉菌A3(2)中，最常发生缺失的染色体片段是位于染色体末端的氯霉素抗性基因。末端的氯霉素抗性基因缺失后，缺失末端重组而环化形成环状染色体，因此许多氯霉素敏感突变株具有环状的染色体末端。 在变铅青链霉菌中，约有0.5%的氯霉素敏感突变株Cmls，这种突变株表现更不稳定，约以25%的频率突变为精氨酸缺陷型(Arg-)，这种缺陷型是由于编码精氨酰琥珀酸合成酶argG (argininosuccinate synthetase)的基因缺失造成的。

　　1.变铅青链霉菌(S. lividans)的氯霉素和精氨酸(CmlsArg-)双突变株

　　AUD1是由1kb-4.7kb- 4.7kb-1kb组成。AUD1位于距离线性染色体的末端约800kb。 在Cmls Arg-双突变株中，与 AUD1一起被扩增的还有AUD2，AUD2距离染色体末端约300kb。AUD2携带编码汞离子抗性的基因，大小为70kb。

　　Cmls Arg-双突变株携带着AUD1

　　II型扩增机制

　　灰色链霉菌2247的染色体是7.8Mb的线性染色体。A因子(A factor)是一种细菌激素，对链霉素(Strepotmycin)的产生和孢子形成起着正调节作用，afsA基因产物是A因子生物合成的一个关键酶。afsA基因距离染色体左末端150kb。afsA基因在高温条件下培养或用UV照射后，以高频率丢失。 通过亚硝基胍(NTG)和高温诱变获得了2个afsA-突变株，对这2个突变株进行分子生物学鉴定，发现突变株的染色体(包括afsA位点)发生了缺失： 404-23突变株的染色体左末端180kb和右末端20kb缺失 N2突变株的染色体左末端350kb和右末端130kb缺失

　　2.灰色链霉菌(S.griseus)染色体缺失使afsA位点丢失

　　这2个突变株的缺失染色体都再环化形成环状染色体。对环状染色体的接头(junction)进行克隆和序列分析，并与亲本菌株进行比较。 发现接头处并无大范围的同源区，而只有6bp的小同源区，说明染色体的环化是由于非同源重组引起的，属于异常重组。环状染色体在这两个突变株中都能稳定存在。

　　产二素链霉菌遗传极不稳定，在培养过程或菌株保藏中，常发生变异。对不产色素的8个自发性突变株的研究发现，这些突变株的染色体都有不同程度的缺失，可将其归为3种类型：

　　3.产二素链霉菌(S.ambofaciens)中的缺失突变体

　　产二素链霉菌野生型菌株的染色体是8Mb的线性DNA，末端TIR的长度为210kb，与蛋白质共价结合。

　　(Gp:) F 560kb

　　(Gp:) D 950kb

　　(Gp:) G 480kb

　　(Gp:) E 950kb

　　(Gp:) J

　　(Gp:) AUD90

　　(Gp:) AUD6

　　①缺失位于染色体一臂的近末端，包括部分TlR序列，但染色体仍呈线性。

　　②染色体两端的TIR-L和TIR-R完全缺失，然后再环化形成环状染色体。

　　③缺失发生在染色体的一端，并终止在扩增部位，即突变体同时具有缺失和扩增，染色体仍呈线性。

　　对再环化后的子代染色体稳定性研究表明，环化后的染色体并不稳定，又进一步发生缺失。这说明缺失与染色体的环化无直接的相关性。 常发生缺失的部位有2个扩增单位： AUD90和AUD6，长度分别为15kb和1.9kb。由于很多缺失突变体的缺失点位于AUD6附近，因此AUD6被称作染色体重排热点。 AUD6包含2个ORF，它们在野生型中能被正常转录，而在扩增突变体中，只有ORF1的转录水平增高， ORF2并不转录。

　　野生型菌株中有一个8.0kb的AUD序列，该AUD含有对链霉素有微弱抗性的基因。在扩增突变体中，有200-300个拷贝的8.0kb AUD串联重复形成的扩增区域(ADS)，突变体对链霉素具有较强的抗性。伴随着基因扩增，位于ADS附近约10kb DNA缺失。

　　4.不产色链霉菌红迪变种(S.achromogenes subsp. rubradiris)的染色体扩增

　　在弗氏链霉菌(S. fradiae)中，野生型菌株只有一个AUD，由8.3kb和两侧2.2kb正向重复序列组成。 而在它的扩增突变体中，据DNA杂交的动力学表明，有500多个拷贝的10.5kbAUD，即扩增长度达到5000kb。

　　缺失和扩增是链霉菌中的一种普遍现象。不稳定的结构基因常与染色体的扩增单位AUD相连而被缺失掉，缺失终止在ADS附近。 链霉菌染色体重排主要有三种类型： ①线状染色体的两个末端都发生缺失，缺失末端重组后环化形成环状染色体; ②缺失和扩增只发生在染色体的一个末端，另一个末端保持完整，因此染色体仍是线状的; ③在染色体内部发生大范围的缺失，染色体的两个末端仍是完整的。

　　大多数链霉菌都含有质粒，几乎都是自主转移质粒，它们在链霉菌的接合过程中起着重要作用。少数质粒与抗生素的产生、形态分化等有关。链霉菌中的质粒，大小从4kb到600kb，拷贝数从几个到几百个，有线性和环状两种类型。 (1)线性质粒 链霉菌中有很多质粒在形态上是线性的，如SCP1、pSLA2等。链霉菌中的线性质粒与链霉菌的线性染色体一样，在DNA两端具有TIR和5′末端蛋白。

　　第二节 链霉菌的核外遗传因子及线性复制子的复制

　　一、链霉菌中的质粒

　　1.链霉菌中的质粒类型

　　(2)环状质粒： 传统的共价、闭合、环状质粒(cccDNA) ，如：SCP2(31kb)，其拷贝数低;pIJ101(8.9kb)质粒，具有300个拷贝。 有些环状的链霉菌质粒具有像λ噬菌体那样的int和xis，能特异性的整合到宿主染色体上。天蓝色链霉菌的SLP1(17kb)和产二素链霉菌的 pSAM2(11kb)就是这种类型的质粒。 这些质粒正常情况下位于染色体上，当它们切离染色体后，通过接合作用能独立地转移到不含这种质粒的菌株中。

　　自然条件下，链霉菌的遗传重组主要是通过自主转移质粒介导的接合作用而进行的。 大多数链霉菌的自主转移质粒都具有致死接合反应的特征，在表型上产生“麻点”(pock)。 麻点：指将含有自主转移质粒的菌株，接种到不含该质粒的菌株的“菌丝坪”上培养时，产生环状晕圈的现象。

　　2.质粒与致死接合反应 (lethal zygosis，lez+)

　　SCP2* determined 'lethal zygosis' in S. coelicolor

　　麻点的形成：是由于SCP2质粒转移到SCP2-菌株后，导致SCP2-菌株暂时发育迟缓而造成的，这种现象也叫致死接合反应。 研究表明，链霉菌所有的接合质粒，都能产生致死接合反应。通过致死接合反应，已在其他链霉菌中发现了一系列接合质粒。

　　Pocks produced on a plasmid-free lawn of S. lividans 66 by Ltz +plasmid pIJ303 (left) and Ltz +/- plasmid pIJ224 (right)

　　Pock formation following mating of S. lividans strains on solid medium.

　　除SCP1外，大多数链霉菌的自主转移质粒都较小。如：pIJ101这样的小质粒，它本身含有自主转移机制能进行自我转移，而不依靠大质粒进行转移。 大多数链霉菌的质粒的接合效率能达到100%。

　　3.几种重要的自主转移质粒

　　1971年，通过遗传研究证明，SCP1质粒控制着寄主天蓝色链霉菌的致育性，但由于它是一种巨大质粒，难于分离和进行深入研究。直到20世纪80年代末和90年代初，才对它的分子结构有了深入了解。

　　(1)天蓝色链霉菌SCP1质粒

　　SCP1：线性双链DNA、363kb，携带次甲基霉素生物合成基因。质粒DNA两端有长末端反向重复序列(TIR)。左末端重复序列(TIR-L)和右末端重复序列 (TIR-R)长度均为80kb，而且TIR-R内侧含有插入因子IS466。

　　SCP1质粒具有下列特征： ①编码几种与产孢有关的蛋白质。 ②携带合成次甲基霉素的基因簇。 ③在天蓝色链霉菌中有下列几种存在形式： a.自主复制质粒(SCP1); b.整合到寄主染色体上的整合型(SCP1-NF); c.带有染色体片段的自主复制质粒 (SCP1′-cysB和 SCP1′-argA uraB)。

　　SCP2：是共价、闭合的环状双链DNA ，31kb，拷贝数是1-2个/细胞。 SCP2中有一个高致育突变体，被定名为SCP2*，引起的重组率可高达10-3。依据酶切图谱可区分SCP2*和SCP2。 在经过一个“孢子-孢子”循环后，99.5%子代孢子都保留SCP2质粒，能促进染色体从供体向受体的转移。

　　(2)天蓝色链霉菌SCP2质粒

　　1975年通过遗传鉴定发现，天蓝色链霉菌中存在第二种致育质粒。

　　改造后的 SCP2*作为链霉菌的克隆载体和链霉菌与大肠杆菌间的穿梭载体而被广泛应用。

　　pIJ101：8.9kb、拷贝数高达 300个的环状质粒，属于自主转移质粒，能高频率转移到受体菌中。该质粒携带的6个基因与质粒的转移和麻点的形成有关。 其中kilA和kilB是致死基因，与质粒的接合致死反应有关，这两个基因突变，则不能形成麻点。 korA和 korB是致死抑制基因(kill override)，抑制致死基因kilA和kilB的过量表达。 tra基因负责质粒在菌丝间的转移，而spd基因负责质粒在菌丝内的转移。tra 和spd 突变后，也不能产生麻点。

　　(3)变铅青链霉菌pIJ101质粒

　　kilA、kilB、tra、spd四个基因与质粒转移和致死接合反应有关，而korA和korB对kilA和kilB的作用进行调控。 因此，麻点的形成是质粒转移至受体细胞后，由于kil基因的暂时表达而使细胞生长受到抑制的结果。

　　(4)变铅青链霉菌SLP2质粒

　　SLP2是变铅青链霉菌66的一个重要的接合质粒，线性，50kb，低拷贝。 变铅青链霉菌66 1326中带有SLP2和SLP3两种质粒，它们都是接合质粒，都能产生致死接合反应。 SLP2也可在种间进行转移，在天蓝色链霉菌和微小链霉菌(Streptomyces parvulus) 中的转移率分别是7%~38% 和4%~59%，而且SLP2能促进染色体的转移，SLP3不能带动染色体转移。

　　无论是从链霉菌、酵母菌或其他真菌还是从玉米中发现的线性质粒都具有两个共同特征： 第一是线性DNA的两个末端具有反向重复序列; 第二是DNA的5′端结合着末端蛋白(TPs， terminal proteins )。

　　二. 线性复制子的复制

　　1. 线性复制子的末端结构

　　链霉菌线性复制子单链末端结构： 3’-端开始的约180bp高度报上，形成7个回文结构; Palindrome I在大多数链霉菌中保守，被认为可以形成两种二级结构; Palindromes II and III包含Tap结合位点。

　　TPs：185aa，由tpg编码，染色体上序列和大小高度保守，但是在线性质粒上TPs及其结合的端粒序列差异较大。 Tap：tap (telomere-associated protein)编码，与tpg位于同一操纵子，同为线性染色体合成所需。

　　Locations of the six (I to VI) DNA fragments of pSLA2 used for 2D gel analysis

　　链霉菌线性复制子的复制分为两步： 第一步，从中央复制起点oriC 开始双向复制，最后留下单链末端;

　　2. 线性复制子的复制

　　Model of telomere repair and priming by Tap.

　　链霉菌线性复制子的复制分为两步： 第二步，末端修复，分为两个阶段： Tpg和 Tap 分别作为引物和特殊的DNA引物酶(primase)，合成最初13bp DNA; 13bp DNA 为引物，继续合成DNA，填补单链缺口。

　　疏螺旋体线性染色体的复制

　　链霉菌中的转座因子包括插入序列(IS)、转座子及可转座的噬菌体。在已经发现的转座因子中，都不含天然选择标记。这些转座因子有的位于染色体上，有的位于质粒上。

　　三、链霉菌中的转座因子

　　天蓝色链霉菌的IS117是2.5kb的“mini-circle”，能整合在染色体的特异位点上，具有环状的转座中间体，其具有抗性标记的衍生物被用做整合型载体。 变铅青链霉菌的IS493和弗氏链霉菌的Tn4556是两个随机整合的转座因子，被改造后用来进行转座诱变。 从分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)中分离到的IS6100有时也用来对链霉菌进行转座诱变。

　　天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌中的转座因子

　　链霉菌中既有温和性噬菌体也有烈性噬菌体，有些噬菌体的寄主范围窄，而有些噬菌体的寄主范围广泛。 由于链霉菌属于土壤细菌，因此链霉菌的噬菌体最容易从土壤中分离而得到。已经从很多链霉菌中分离到噬菌体：

　　四、链霉菌中的噬菌体

　　天蓝色链霉菌中的фC31噬菌体 委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae)中的фSV1噬菌体 龟裂链霉菌中的RP2和RP3噬菌体 这些噬菌体在链霉菌的基因交换中起重要作用

　　фSV1噬菌体经过改造后被用来进行普遍性转导，能介导对许多营养缺陷型菌株转导产生原养型菌落。 фC31是链霉菌的广寄主范围的温和噬菌体，在形态和其他特征上与大肠杆菌λ噬菌体类似。фC31既能溶源又能裂解，噬菌体通过att位点整合到宿主染色体的特异位点上而形成原噬菌体。 其DNA长度为41.4kb，G+C含量为63%，具有黏性末端，全序列已被测定。通过对фC31的一系列改造，已经构建了一系列克隆载体，被广泛地应用在链霉菌的基因克隆中。

　　链霉菌在适宜的培养基上生长时，形成基质菌丝和气生菌丝，在气生菌丝上形成排列和形态各异的分生孢子。

　　第三节 链霉菌的接合作用

　　自然条件下，链霉菌间的遗传重组主要通过质粒介导的接合作用进行，如天蓝色链霉菌A3(2)、变铅青链霉菌66、龟裂链霉菌、庆丰链霉菌等都能进行接合作用，其中对天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌的研究较为深入。

　　一、链霉菌基因重组的发现

　　1955年塞蒙梯(Sermonti)夫妇首先发现天蓝色链霉菌可通过遗传重组交换产生重组体。霍普伍德(Hopwood)也在天蓝色链霉菌A3(2)菌株中证实了这一现象。他们的实验过程大致可以分为以下三个阶段。

　　① 将两个不同的营养缺陷型菌株混合培养，使基质菌丝相融合。 ② 一个菌丝的部分染色体通过菌丝间的连接而进入另一菌丝形成局部杂合核。杂合核具有两套染色体，其中作为受体的染色体是完整的，而作为供体的染色体是不完整的，只是一个染色体区段。 ③ 局部杂合核在分裂过程中发生染色体交换和减数，结果在同一菌丝体上形成各种单倍重组体孢子。

　　SCP1是在链霉菌中最早发现的第一个与遗传重组有关的性因子。SCP1控制着寄主天蓝色链霉菌的各种致育状态。 不含SCP1质粒的菌株：UF(Ultrafertility，超致育型) 携带SCP1质粒的菌株：IF(Initial Fertility，原始致育型); SCP1整合在寄主染色体上的菌株：NF (Normal Fertility，正常致育型)。 UF、IF、NF分别相当于大肠杆菌的F-、F+和Hfr。 SCP1’：携带有染色体基因，相当于F’。

　　二、天蓝色链霉菌中的性别体制和遗传重组

　　1.天蓝色链霉菌A3(2)的性别体制

　　天蓝色链霉菌致育类型与大肠杆菌致育类型类似，但是二者之间也有区别： ①在大肠杆菌中F-×F-是不育的，在天蓝色链霉菌中可以从UF×UF杂交中得到少数的重组子，表明它们是可育的。说明还有另外的致育因子，后来发现在天蓝色链霉菌中除SCP1外，还有另一种致育因子(SCP2)。 ②在大肠杆菌中F+×F+或 Hfr×Hfr杂交一般是不可育的，而在天蓝色链霉菌中，NF×NF和IF×IF杂交都是高度可育的。 ③在大肠杆菌中，F+×F-杂交都是F+，Hfr×F-杂交绝大多数都是F-。在天蓝色链霉菌中，则IF×UF杂交子代是IF，而NF×UF杂交子代是NF。说明虽然NF中的致育因子和染色体整合，但每次染色体的转移都必须包括致育因子，所以二者杂交子代的基因型是有区别的。

　　SCP1的这三种存在形式是根据其所表现的遗传特征而鉴定出来的。 1993年，用脉冲电泳方法对早期鉴定的一系列天蓝色链霉菌A3(2)菌株的SCP1质粒状况进行了分析，证明了SCP1的存在状态与早期遗传鉴定的特征相吻合。

　　SCP1与SCP2(或SCP2*)这两种不同的致育因子，在天蓝色链霉菌的遗传重组中的相互关系? SCP1与SCP2或SCP2*在质粒转移方面是独立的，即SCP1的转移不依赖于SCP2的作用，反之亦然。 在致育性方面，它们的作用也是独立的，相互之间无干扰作用。当SCP1和SCP2或SCP2*共同存在时，在促进染色体重组方面的作用是累加的。

　　2.SCP1和SCP2(或SCP2*)与遗传重组

　　表：含有SCP1、SCP2(SCP2*)两个亲本杂交后代的重 组频率： A：proA1 argA1 cysD18 × B：hisA1 uraA1 strA1

　　A

　　B

　　由于许多链霉菌天然携带自主转移质粒，因此常常以较高的频率产生重组子。然而，有些菌株之间的重组频率较低，其原因是质粒“进入劣势”，即两个亲本都带有同一种质粒时，重组频率低(<10-6);当只有一个亲本带有这种质粒时，重组率就会提高。

　　三. 链霉菌独特的接合转移机制

　　1. 环状质粒的转移

　　(1)与接合相关的重要基因或位点

　　traB：编码一个膜定位的成孔蛋白(pore-forming protein)质粒及染色体的转移所需，特别是DNA在受体与供体菌丝间的转移;与麻点形成有关。 spd (spread)：质粒在菌丝内的移动所需;与麻点大小有关。 clt (for cis-acting locus of transfer)：质粒上与TraB结合的非编码序列，但并不为TraB介导的染色体转移所必需。 clc (clt-like chromosomal): 染色体上能与TraB相互作用的序列，与clt 不同，clc 在编码区内;主要存在于Streptomyces的染色体上，在亲缘关系较远的放线菌如Mycobacterium or Corynebacterium 的基因组上并未发现，可能与链霉菌样质粒的宿主范围有关。

　　(2)DNA以双链形式进行转移

　　SalI restriction-modification (RM) system 证实链霉菌接合过程中的双链DNA转移

　　(3)接合转移发生在侧壁而非菌丝顶端，且并非供体与 受体菌丝间的完全融合

　　Detection of conjugative plasmid transfer by time lapse ?uorescence microscopy.

　　(4)质粒在受体菌丝体内的扩散 ---TraB-Spd protein complex介导

　　(5)链霉菌中环状质粒的接合转移模式

　　Model of conjugative DNA transfer and spread in Streptomyces spp.

　　2. 线状质粒的转移

　　链霉菌杂交：把两个带有不同遗传性状的营养缺陷型亲本菌株混合培养在琼脂平板上，在培养过程中就会发生接合作用，并伴随着遗传重组。然后将混合培养后产物涂布在选择性培养基上，筛选重组子并进行遗传分析。

　　四、链霉菌的遗传分析方法和基因连锁图的制作

　　在天蓝色链霉菌及其他链霉菌的基因定位中，常用的方法是： “4×4杂交”法 异质系克隆 平板杂交

　　将各含有2个缺陷型的两个亲本进行杂交，杂交后的孢子通过稀释并涂布到含有抗生素或缺乏某些生长因子的4种选择性培养基上。 这些培养基能使重组子生长而亲本不能生长，然后通过对不同的培养基上进行菌落计数，即可计算各种重组或转移所发生的频率。

　　1.“4×4杂交”方法(four-on-four cross)

　　通过对杂交子代重组体的定量分析，是链霉菌属绘制基因连锁图谱的主要方法。 最常用的方法为“4×4”方法：由于此法包括4因子杂交，平行涂布在4种选择性培养基上，被称作“4×4”方法。

　　1972年由Hopwood发明，现广泛应用于链霉菌的杂交分析

　　基因型为ade his + +菌株孢子 基因型为+ + arg Lys菌株孢子 混合接种于完全培养基中 25℃下培养3～4天 待形成孢子后，把单位体积的孢子悬浮液涂布 在下列4种选择性培养基上： ①腺嘌呤+精氨酸 ②腺嘌呤+赖氨酸 ③精氨酸+组氨酸 ④组氨酸+赖氨酸

　　每种培养基上所长出的菌落(全部或抽样)就可参照于那种培养基上的非选择性标记而归类。 这样在每一种培养基上即可有4种可能的基因型。根据那种培养基上的菌落总数，就可计算出单位体积中每个基因型的数目，进而分析出它们彼此间的排列位置。

　　异质系克隆：是指在某些放线菌中，两个多重标记的营养缺陷型亲本杂交时，供体染色体片段进入受体细胞后形成的局部杂合核在分裂过程中发生染色体交换和减数，结果在同一菌丝体上形成各种单倍重组体孢子。由一个杂合核演化繁殖形成的菌落叫异质系克隆(heteroclone)。

　　2.异质系克隆(heteroclone)

　　由于异质系克隆产生的孢子大多不能在基本培养基上生长，采用不同的选择性培养基可以鉴别出不同类型的单倍重组体，根据其频率就可用来做链霉菌的遗传图谱。

　　异质系是放线菌基因重组所特有的现象，它是由供体染色体的片段进入受体细胞后，并不经过双交换而整合到染色体上，而是通过两次不同的单交换形成的。

　　当要将许多菌株与同一个亲本进行杂交，以测定染色体重组或质粒转移的频率时，“平板杂交技术”就很适用。 此方法通常包括两个步骤： 第一步 把长有一系列待测菌株的母平板影印到接种有同一亲本且已长成孢子“坪”的非选择培养基(完全培养基或R2YE)平板上进行杂交。 第二步 杂交平板长好孢子后，再影印到一种或多种选择培养基上，回收重组子。在一个平板上，常常可以测定多至20个菌株。这就开辟了利用平板杂交迅速定位基因位点的可能性。

　　3.平板杂交

　　影印

　　培养

　　影印

　　不同SM培养基

　　长有一系列待测菌株的母平板

　　接种有同一亲本且已长成孢子“坪”的完全培养基平板上

　　进行杂交

　　杂交平板长好孢子后，再影印到一种或多种选择培养基上，回收重组子。

　　平板杂交法示意图

　　1、制作连锁图 2、构建染色体新组合的菌株(杂交育种) 3、构建携带不同质粒组合的菌株 4、研究质粒接合性，即待测菌株与已鉴定菌株接合 如无质粒变铅青链霉菌66衍生物菌株之间的杂交，可用来检测新的 具有形成麻点特性质粒的存在 5、用来确定接合时质粒转移的能力以及促进寄主染色体标 记重组的能力。

　　放线菌杂交的应用

　　五、链霉菌与大肠杆菌之间的接合作用

　　许多链霉菌天然地携带接合质粒，在实验室内只要将两个带有不同遗传型的亲本菌株在琼脂平板上混合培养即杂交，就会发生遗传重组。 与大肠杆菌进行接合作用时，需要首先人工构建能在大肠杆菌和链霉菌中都能进行复制的双功能载体(即穿梭载体)，将外源基因连接在该载体上。 然后通过大肠杆菌与链霉菌间的接合作用，就可将外源基因导入链霉菌中，这是进行种间杂交的一种有效方法。

　　这种载体一般是含有革兰阴性菌质粒RP4的oriT位点的可移动质粒，利用大肠杆菌供体提供的转移功能，能介导大肠杆菌和链霉菌杂交。常用的大肠杆菌是S17-1(含有整合的RP4质粒)。

　　① 方法简单，不需要制备原生质体; ② 能够利用许多通用的oriT载体，进行位点专一性或定 向插入并与染色体整合; ③ 由于这些载体能在大肠杆菌中复制，容易构建所需要 的重组物。

　　利用大肠杆菌进行的接合作用将外源DNA转移到链霉菌或其他放线菌有下列优点：

　　通过原生质体融合而进行的遗传重组，是一种能使染色体基因发生高频重组的有效方法。 将两个亲本株分别用酶法脱去细胞壁，在高渗介质中形成由细胞膜包裹的原生质体。 等量相混，在聚乙二醇(PEG)存在下诱导融合，经过DNA交换、重组而产生重组子。 融合后的原生质体在适宜的再生培养基中再生细胞壁回复成细胞形态。

　　第四节 链霉菌的转化和原生质体融合

　　一、原生质体融合

　　在最适条件下，种内融合重组效率可达再生菌落的20%，种间融合重组率一般为10-5~10-6。

　　原生质体融合引起的遗传重组不依赖于质粒。 原生质体融合可用来做图，适用于紧密连锁的遗传标记。因为重组率太高，反而在后代的分析中有一定的困难。 特别适宜于重组菌株的构建。 原生质体融合也能引起质粒在菌株间转移。

　　放线菌菌丝体很少能呈现感受态而吸收DNA，但是当放线菌细胞用酶法脱壁形成原生质体，在PEG存在下，质粒、噬菌体DNA或染色体DNA很容易进入细胞得到转化子或转染子。 在天蓝色链霉菌或变铅青链霉菌中： 每微克ccc质粒DNA，能产生106-107转化子 开环或有互补末端的线性质粒转化率比ccc质粒降低10-100倍 每微克噬菌体DNA能产生5×105的转染子

　　二、转化和转染

　　1.质粒或噬菌体DNA通过原生质体进行转化或转染

　　利用上述的转化/转染技术，并以链霉菌的质粒或噬菌体DNA做载体，已建立了链霉菌的基因克隆系统。 从pIJ101衍生出来的高拷贝、宿主范围广泛的载体成为特别有用的通用载体。 фC31是天蓝色链霉菌A3(2)的温和性噬菌体，对它作了详尽的研究，并构建了具有广泛宿主范围的衍生载体。 这些载体都具有在大肠杆菌和链霉菌中表达的功能。

　　链霉菌克隆载体 1. 质粒载体 质粒名称 大小(kb) 　 来源　　　　 宿主范围 拷贝数 SLP1.2 14.5 天兰色链霉菌 窄谱,变青链霉菌 　 4-5 SCP2(性因子) ″ ″ ″ 1-3 pIJ101　　 8.9 变青链霉菌 广谱(各种载体构建) 40-300 pFJ103 20 S.granulorubor 生二素,金霉素,弗氏链霉菌 pUC6 9.2 S.cepinosue 广谱 30-40 2. 噬菌体载体 ΦC31-天兰色链霉菌的温和噬菌体，长41 kb，其中32 kb是必须的, 具粘性末端的线状DNA分子，可插入约10 kb外源DNA，可裂解和溶源化生长。

　　电转化：是将细胞和DNA悬浮液进行电击，导致瞬间的细胞膜穿孔而使细胞吸收DNA。 一般用链霉菌菌丝进行电转化，这种方法的优点是不需要制备原生质体和进行原生质体的再生。 另外，随着分子生物学方法的飞速发展，还有很多新的转化方法不断涌现出来。如将环状或线状质粒制备成单链，可提高近100倍的转化频率。

　　2.电转化

　　1、在链霉菌中，线性染色体和质粒具有何种特征? 2、试述引起链霉菌遗传不稳定性的主要因素? 3、在链霉菌中，DNA扩增单位(AUD)、扩增DNA序列(ADS)用来描述什么?有何结构特点? 4、链霉菌染色体重排主要有哪几种类型? 5、何谓麻点(pock)?麻点是如何产生的? 6、链霉菌中的接合转移机制? 7、链霉菌线性复制子结构特点及其复制过程?TP有何功能? 8、在链霉菌基因定位中，常用的方法有哪些?分别叙述其原理?

　　思 考 题