第4章 细胞因子药物.ppt

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　　第4章 细胞因子药物

　　细胞因子,cytokine 是指有机体细胞合成和分泌的小分子多肽，可调节机体的生理功能，参与各种细胞的增殖、分化、凋亡和行使各种功能。 细胞因子在某些情况下还可产生病理作用，参与自身免疫病、肿瘤、移植排斥、休克等疾病的发生和发展。

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　　许多细胞因子是由血细胞产生的

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　　(Gp:) 巨核细胞

　　(Gp:) 进入组织称巨噬细胞

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　　单核细胞进入组织称巨噬细胞

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　　血细胞

　　单核细胞进入组织称巨噬细胞

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　　第一节 干扰素，interferon， IFN

　　干扰素是最早发现、研究最多、第一个被克隆、第一个用于临床治疗疾病的细胞因子。 干扰素在生物中普遍存在, 是一组多功能细胞因子，在正常个体的脾脏、肝脏、肾脏、外周血淋巴细胞和骨髓中都可以检出。

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　　根据来源和结构，干扰素可分为： IFN-?，由白细胞产生，有25种不同的亚型 IFN-?， 成纤维细胞产生，4种亚型 IFN-?， 活化的T细胞、NK细胞产生，4种亚型

　　干扰素

　　I 型干扰素，耐受pH 2 处理，或60℃1h

　　II 型干扰素， 被上述处理灭活

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　　α干扰素

　　IFN-α基因表达产物为188—189个氨基酸的前体，N端23个氨基酸残基是亲水信号肽，分泌出细胞时被切除，活性产物为165—166个氨基酸。

　　human interferon-alpha 2b

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　　IFN-β

　　IFN-α和IFN-β 具有许多相似的生物学和生物化学性质，核苷酸序列的同源性高达80%，氨基酸水平的同源性约为25一30 % 。 成熟IFN-β有20%糖基。有3个Cys，形成1个二硫键，与分子的正确折叠和功能有关。

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　　γ干扰素

　　IFN-γ虽然基因序列、氨基酸组成和来源与INF-α和IFN-β完全不同、但生物学活性有许多相似之处。 N端23个氨基酸为信号肽，在分泌出细胞时被切除，活性产物由143个氨基酸组成，分子质量为16 kD。

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　　天然IFN-γ是一种糖蛋白，而大肠杆菌表达的IFN-γ无糖基化，仍有生物学活性。 IFN-γ分子中没有形成二硫键的半胱氨酸，其活性形式是牢固的二聚体或四聚体，单体没有活性。

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　　IFN的生物学功能

　　抗病毒 抑制细胞生长 抗肿瘤 免疫调节 是多种疾病的治疗手段

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　　干扰素作用机理

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　　IFN治疗能使相当一部分的乙肝患者体内 病毒减少，肝功能恢复正常。 IFN-?在治疗造血系统肿瘤和淋巴瘤方面疗效肯定。如慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤、皮肤T细胞淋巴瘤。

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　　IFN的改造

　　在体内易被降解，体内半衰期约1.5-2.8 h 为提高半衰期，Schgring公司制备出一种长效的PEG化的IFN,商品名PEG Intron。一次肌内注射1.5μg/kg 可维持血液浓度l周。

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　　提高IFN的疗效 重组甲硫氨酸组合干扰素(r-med IFN-consenseus Interferon)，商品名为Intergen。 它是根据已知的11种IFN-α亚型的氨基酸序列，筛选各序列等位点上出现频率最高的氨基酸，设计合成氨基酸序列有高度同源性的新型IFN蛋白。 这种新型干扰素较之单一亚型的干扰素有更明显的抗病毒、抗细胞增殖、激活NK细胞和诱导多种细胞因子生成的作用。

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　　IFN联合用药

　　IFN联合病毒唑(ribavirin)，商品名为Rebetol，提高IFN的疗效。 IFN-γ单独使用治疗肿瘤无效。但与一些细胞因子联合使用有协同作用，如IFN和TNF，以及化疗药物联合使用，对治疗胃肠道肿瘤、黑色素瘤和肉瘤有一定的作用。

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　　IFN的副作用

　　全身性反应是最为常见的症状，如畏寒、疲劳、厌食、头痛、呕吐和肌痛。 以低剂量开始给药可以避免过强的副反应，或预先给解热镇痛药可控制这一反应，睡前服用也可减轻反应。全身反应在持续治疗l—2周后可较好耐受。

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　　在疗程的前2—3个月，约25%一30%的病人出现白细胞、血小板和网织红细胞数目减少，与治疗剂量有关，停药后可短期恢复。 IFN-α因其自身的免疫调节作用，虽不能引起自身免疫病，但可加重原有自身免疫疾病。

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　　第二节 白细胞介素 Interleukin， IL

　　IL是一类免疫调节因子。指由各种白细胞产生的、介导细胞之间相互作用的细胞因子。 它们主要由激活的淋巴细胞分泌，作为免疫系统的细胞因子信使发挥作用。

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　　人白细胞介素家族已拥有23个成员，分别命名为人IL-l到IL-23。 迄今为止，只有IL-2利IL-11被开发成功为基因工程药物批准生产上市。IL-6、IL-10、IL-12等正在研究开发中。

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　　IL-2

　　主要由激活的T细胞和NK细胞产生 糖蛋白, 但糖基化与否不影响IL-2的功能 133 aa组成的单链多肽 分子量15-17.5kDa 等电点6.8-8.2 3个Cys, 在Cys58和Cys105间形成二硫键才有活性

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　　interleukin-2 [Homo sapiens].

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　　Cys125形成分子间二硫键,导致二聚体形成,失去生物学活性。 将Cys125突变成丝氨酸或丙氨酸,可以改善其稳定性和活性。 N-端aa对活性影响很大,除去N-端1-20个aa可以使生物活性完全丧失。 对热不稳定，加入白蛋白可以解决。

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　　在4℃可保存1年以上。 在pH2?9溶液中稳定。 冻干制品稳定。

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　　IL-2生物学活性和临床应用

　　IL-2是很重要的免疫调节因子，具有多种生物学活性 IL-2处于调节机体免疫应答的细胞因子网络的中心环节，对机体的免疫监视及抗肿瘤免疫功能有重要意义。

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　　IL-2诱导T淋巴细胞增殖和分化 增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞毒活性 激活NK细胞，增强NK细胞活性

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　　诱导淋巴活性杀伤细胞LAK细胞和激活肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，刺激它们产生细胞因子或其受体 刺激活化的B细胞增殖 高剂量IL-2能诱导单核巨噬细胞增殖和分化，并增强单核巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的活力

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　　诱导产生干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)和细胞集落刺激因子(CSF)，并与其协同增强NK细胞活性 在现知大多数有抗肿瘤活性的免疫活性细胞(或效应细胞)的产生、活化和增殖必须有IL-2参与。

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　　IL-2作用机理

　　IL-2不能直接杀伤肿瘤细胞。 现已知在肿瘤细胞表面存在一种能被免疫活性细胞(如LAK细胞)识别的基因决定簇，免疫活性细胞能通过决定簇有选择地杀伤肿瘤细胞而不损伤正常细胞。 IL-2诱导和激活机体免疫活性细胞，通过激活机体自身抗肿瘤能力间接发挥作用。

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　　临床应用

　　肿瘤 免疫缺陷 感染性疾病 血管肉瘤、肾病。

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　　IL-2对 肾细胞癌、黑色素瘤、恶性血管内皮细胞瘤、皮肤T细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、神经母细胞癌、神经胶质瘤、肺癌、膀胱癌、髓样母细胞白血病、毛细胞白皿病、肝细胞癌、结肠癌以及非霍杰金淋巴瘤、癌性胸腹水等有作用。 但获得批准治疗的只有肾细胞癌、血管肉瘤和黑色素瘤。

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　　IL-2 毒副作用

　　主要有发热、乏力、恶心、头晕等 个别有心肌损伤、低血压、肝功损害、贫血、白细胞减少等较为严重的反应。 在冶疗前或治疗过程中给予地塞米松等药物可减轻副反应。

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　　IL-11

　　IL-11由骨髓基质细胞和成纤维细胞产生 199个aa，N-端有21个aa信号肽 无Cys，不形成二硫键 无糖基化位点 等电点11.7 对热稳定,耐受80 ℃ 在碱性环境中稳定,酸性失活

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　　结构与功能

　　Met59和C-端aa是维持IL-11活性所必需的. Lys42和Lys99突变导致活性降低3倍.

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　　IL-11 生物学功能

　　IL-11对造血细胞和免疫细胞均有刺激效应 与其它细胞因子共同支持造血前体细胞长期生长 促进血小板生成 无明显种属特异性 重组人IL-11明显促进急性放射病人骨髓造血功能

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　　IL-11 临床应用

　　治疗肿瘤病人化疗导致的血小板减少症，一般与G-CSF联合使用。以同时纠正粒细胞减少和血小板减少症 国内也有多家公司研发的重组人IL-11。 IL-11多为大肠杆菌表达，有一家为酵母表达，有一家产品在N端缺失5个或8个氨基酸 重组人IL-Il是目前用于治疗癌症患者放化疗后血小板减少症的惟一的安全、有效药物。

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　　IL研究的主要方向

　　IL-2衍生物(突变体) IL-2与毒素蛋白结合物的临床应用 IL-2的剂型改变(脂质体，PEG化) IL-2与其它细胞因子或抗肿瘤药物联合应用 白喉毒素片段与IL-2融合蛋白(DAB3891L-2,商品名为ONTAK)用于治疗1L-2受体阳性的T细胞淋巴瘤

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　　第三节 集落刺激生长因子 Colony stimulating factor，CSF

　　一组造血生长因子，可以刺激血细胞集落形成

　　粒细胞集落刺激因子 G-CSF

　　粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 GM-CSF

　　巨噬细胞集落刺激因子 M-CSF

　　多能集落因子 multi-CSF

　　红细胞生成素 EPO

　　血小板生成素 TPO

　　干细胞因子 SCF

　　(Gp:) 根据作用特点和范围

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　　1. G-CSF

　　主要由单核(巨噬)细胞、成纤维细胞等多种细胞分泌 用于改善癌症患者放化疗后的中性粒细胞减少症

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　　4℃保存一年,商品化制剂保存在4-8℃ 冻干降低生物学活性 Cys17未配对,可能影响复性,突变后可以减少错配。

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　　2. M-CSF

　　主要由血管内皮、成纤维细胞、巨噬细胞等产生 可刺激巨噬细胞集落形成 522 aa，含32 aa信号肽 有糖基化位点， 但非活性所需 由链间二硫键相连成二聚体

　　膜结合型M-CSF

　　分泌型M-CSF

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　　M-CSF生物学活性和临床应用

　　主要用于肿瘤病人的放化疗后加速造血功能的恢复 增加血液中单核细胞的水平 改善病人的抗感染能力 毒副作用主要有发热、皮疹、头痛、胸痛等。

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　　3. GM-CSF

　　主要由T细胞和巨噬细胞产生 人GM-CSF前体有144 aa，N-端17 aa 为信号肽 分子量18-32 kDa, 2个二硫键 2个N-糖基化位点，多个O-糖基化位点 大肠杆菌表达的GM-CSF没有糖基化，但具有更高的活性、更长的半衰期、更强的受体亲和力

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　　GM-CSF生物学特性

　　4℃稳定6个月 56 ℃10 min不失活 pH 2条件下保持稳定 对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶不敏感

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　　GM-CSF功能及临床应用

　　GM-CSF主要作用是对粒细胞系和单核细胞系的维持存活、促进生长、诱导分化和增强功能。 有种属特异性

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　　第4节 红细胞生成素 Erythropoietin EPO

　　193 aa前体，其中27 aa是信号肽 成熟的人EPO由165个氨基酸组成 高度糖基化 去糖基化不影响rhEPO的体内活性，但缩短了在体内的半衰期，使其完全丧失了在体内的活性。因此不能用原核表达系统表达EPO,只能用CHO表达。

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　　EPO的生物学活性和临床应用

　　EPO没有种属特异性 主要功能是维持红细胞造血前体的存活，并促进其分化。

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　　美国Amgen公司生产的Epogen在全世界销售数十亿美圆，成为最成功的基因工程药物之一。 国内有多家公司生产，商品名为：益比奥、宁红欣、依普定等。 临床上主要用于： 肾功能衰竭导致的贫血 化疗导致的贫血 以及其它各种贫血

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　　第5节 干细胞因子 Stem cell factor， SCF

　　又被称为干细胞生长因子(stem cell growth factor，SCGF) 肥大细胞生长因子(mast cell growth factor，MGF) 是1990年发现的一种重要的造血细胞因子。

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　　它在造血及维持肥大细胞、黑色素细胞和精原细胞的存活、增殖和分化过程中起着重要作用。 尤其是在干细胞移植、干细胞生物工程研究和应用迅速的今天，SCF在这一领域将占有其他细胞因子不可替代的重要地位，越来越受到生物学家、临床学家的重视。

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　　SCF的性质

　　人体内存在两种类型SCF，膜结合型和可溶型 完整的SCF是由273个 aa组成的糖蛋白，包括N端25个氨基酸信号肽、189氨基酸胞外区和36个氨基酸的胞内区。 有糖基化位点，但不影响功能，可以用大肠杆菌生产SCF。

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　　临床应用

　　美国Amgen公司研制开发的人重组SCF是由大肠杆菌表达的，而且是非糖基化的，主要用于治疗放化疗肿瘤患者的骨髓衰竭。 在我国，有多个实验室进行表达研究，已完成临床前药学、药效和药理鉴定。

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　　第6节 表皮生长因子 Epidermal growth factor, EGF

　　EGF是20世纪60年代从小鼠颌下腺中发现的一种活性多肽，它由53个氨基酸组成，含3对二硫键，分子质量约 6 kDa。

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　　人表皮生长因子(hEGF)，因其可以抑制胃酸的分泌，故又称抑胃素。 人EGF亦由颌下腺和十二指肠Brunner氏腺合成, 在人体的绝大多数体液中均已发现EGF，在乳汁、尿液、精液中的含量特异性地增高。

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　　EGF结构与功能

　　人EGF的20—3l 位氨基酸残基是EGF受体的结合部位 N端和C端的氨基酸对结合部位的构型稳定性十分重要 在-20℃中能长期稳定。

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　　6个保守的Cys

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　　EGF的生物学活性

　　EGF在体液、组织中广泛分布。 血液中的EGF主要来源于颌下腺。 组织中也表达EGF，例如脑、肾上腺、唾液腺、 十二指肠腺和胃幽门腺等。 EGF的作用没有种属特异性。

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　　EGF 的临床应用

　　促进外科手术伤口及创面(包括烧伤等)愈合。 对胃肠道溃疡的治疗作用。 EGF的抗肿瘤作用 一系列的肿瘤细胞有着高水平的EGF受体，用EGF受体的单抗或EGF与细胞毒素的融合物进行治疗。

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　　EGF的生物学作用广泛，对外胚层和内胚层来源的一些组织有促分裂和刺激合成的作用。 EGF有促进细胞增殖分化的能力。 一些肿瘤细胞能以自分泌EGF的方法增殖。 因此， 存在内用安全性问题，rhEGF至今未能批准临床应用(?)。

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　　第7节 碱性成纤维细胞生长因子 Fibroblast growth factor， FGF

　　促进成纤维细胞生长 该家族已有23个成员 在我国，重组牛的bFGF和重组人的hFGF作为治疗外伤和褥疮外用药已于1996年获得国家新药证书。 同时还利用该顶技术成果拓展其应用领域，研制出滴眼制剂、口腔喷雾剂和bFGF美容护肤产品。