血型血清学疑难问题.ppt

　　血型血清学疑难问题

　　xx市红十字血液中心 xxx

　　关于ABO及Rh定型 反应强度

　　在常规检测试验中如果红细胞发生凝集 强度试管法≥2+ ，则视为正常阳性反应。 小于6个月的新生儿血清(血浆)中并不一定具有预期存在的抗-A 和/或抗-B抗体; 因此, 对于小于6个月的新生儿只需要进行正定型。 如果出现弱反应、混合视野反应或正反定型结果不一致则需要进行附加试验。

　　预温技术 (1)

　　预温技术：指将存放在各自独立试管中的血清/血浆、红细胞及增强介质在水浴/孵育箱中预先孵育并达到预定温度后(一般是指37℃)才进行混合，然后按照试验技术的要求孵育一定的时间，孵育完成后如果需要洗涤红细胞，要用预温得生理盐水来洗涤。

　　预温技术(2)

　　用途：用于排除冷反应性抗体对间接抗人球蛋白试验的干扰，检测在37℃有增强反应的抗体。 缺点：不论是否使用增强介质，预温技术得到的阴性反应来排除抗体的存在具有风险，因为预温技术会降低许多具有潜在临床意义的弱反应性、新生成的、低亲和力的同种抗体反应强度，甚至漏检。

　　预温技术(3)预温盐水

　　预温技术中，洗涤红细胞的生理盐水温度不宜超过37℃，较高温度(如45℃)的生理盐水洗涤红细胞会导致特异性结合的抗原抗体复合体解离。 洗涤过程中，每次离心结束后应立即弃上情液，减少红细胞和预温盐水一起混合的时间。

　　预温技术(4)预温技术的使用条件：

　　必须确认存在冷自身抗体：IS盐水法具有反应活性、自身对照阳性 。 患者不存在近期输血情况：因如果近期有输血史，则最初形成的可能是IgM抗体，预温技术会漏检此IgM抗体。 对于已经确定具有临床意义的IgM抗体(如抗-Lea，不能使用预温技术。

　　弱D(1)

　　1984年，Moore为了避免此混乱提出了“弱D”的名称，此后，在大多数科技文献及正规出版物中使用“弱D”来代替“Du” 弱D红细胞在直接盐水介质凝集试验中和抗-D不反应。 使用IAT方法则和人血清IgG性质的抗-D产生阳性反应。

　　弱D(2)：产生的原因

　　编码D抗原转膜蛋白部分的基因缺失或突变导致其红细胞膜上的D抗原数量减少。许多此类弱D不会产生D同种免疫。 编码D抗原的在细胞膜表面抗原决定族部分的D基因发生缺失突变或基因重组，导致弱D表型。此为“部分D” 。此类个体具有产生与缺失抗原相对应抗体的危险。 RHD基因和RHCE基因重组引起。

　　弱D(3)——抗-D试剂

　　IgM性质抗-D：人单克隆IgM单克隆抗体，室温盐水方法可以检测出除DVI表位以外的所有D表位, 即检测不出弱D(DVI表位)以及部分D. IgG性质抗-D:使用IAT方法可以检测出DVI表位，即可以用于弱D检测。 混合型抗-D:单克隆IgM性质抗-D和IgG性质抗-D混合：室温盐水法可以检测除DVI以外的所有表位，IAT法可以检测出弱D(DVI)。

　　IgM抗-D 混合型抗D 自身对照 结果判定 + + - D阳性 - - - D阴性 + - - 需要进一步检测，是 - + - 否输入Rh不配合的血液 -/+ -/+ + 进行DAT试验，是否输入 Rh不配合的血液

　　弱D(4)患者的Rh(D)检测(待输血患者，孕妇及新生儿)

　　Rh阳性是指和两种试剂均产生强阳性，只有1+反应是不够的

　　弱D (5)：献血员Rh(D)检测

　　献血员检测：由采供血机构进行，使用IgM性质抗-D对献血员进行筛选，对所得的阴性献血员必须使用IAT方法采用IgG性质的抗-D进行弱D检测，对于IAT阳性的血液则视为D阳性，因为弱D的血液给D阴性患者使用也会产生免疫反应产生抗-D。因此弱D的血液只能当作D阳性血液使用 。

　　弱D (6)：患者Rh(D)检测

　　输血前检测：对于患者只需要使用IgM性质的抗-D检测，如果是阴性则视为D阴性。 对于患者不需要进一步检测弱D，因为弱D患者如果输用D阳性和弱D的红细胞和血小板同样也会产生免疫反应，因此即使检查出患者是弱D，也必须将他看作是D阴性，选择D阴性血液供其输用。 孕妇：对于孕妇不需要进行弱D检测。不论是D阴性还是弱D孕妇在怀孕期间及分娩后都需要用RhIG进行治疗。

　　立即离心交叉配血的重要性

　　立即离心法是预温技术、间接抗人球法无法替代的。 立即离心技术可以用于： 检测ABO不配合：血型鉴定错误、血袋上标签错误、存在亚型抗体、骨髓移植产生的嵌合体。 存在缗钱现象 存在冷特异性抗体(如抗-Lea) 存在冷自身抗体 预温技术和IAT技术会漏检弱的具有临床意义的冷抗体(如抗-Lea, 抗-A1, 抗-E等) 我们在配血时，不能只选用IAT方法，必须同时选用立即离心技术和IAT技术。

　　立即离心交叉配血阳性的处理

　　首先考虑ABO系统不配合：对患者及供者的ABO血型再次鉴定。 ABO不配合的骨髓移植产生的嵌合现象，或输注大量血浆带入大量外源性抗-A或抗-B抗体 缗钱：采用盐水替代试验。 自身冷抗体：预温试验 冷特异性抗体：抗体鉴定

　　临床医院对ABO/Rh血型复检

　　有的医院认为，采供血机构检查合格的血液才发放到医院，因此医院不必要再次复检化验血型的观点是错误的。 因为采供血机构初复检化验的样本是采血时的留样，且全血采集后分别制备成各种成分，可能会发生血样、贴标签差错。 用户医院复检的样本是和血袋直接相连的小辩，因此可以将结果和血袋上标签所示的血型核对，避免差错。

　　自家冷凝集血样的ABO定型

　　正定型用红细胞的准备: 血样采集后,立即离心,获得压积红细胞 用37℃温盐水洗涤红细胞 45℃热放散3分钟 巯基试剂处理(DTT或2-ME): 破坏IgM抗体

　　自家冷凝集血样的ABO定型

　　反定型用血浆或血清的准备 血样采集后放置4℃冰箱静置24小时,使红细胞充分吸收自身冷凝集抗体 用自身红细胞吸收去除自身冷抗体 用O型红细胞吸收去除ABO系统以外的非特异性及特异性抗体。

　　DAT阳性红细胞的Rh(D)定型

　　对于DAT阳性的红细胞，由于包被大量IgG抗体，干扰Rh血型检定 需要将包被红细胞的抗体通过洗脱技术除去而不破坏抗原。 洗脱时必须作平行对照实验：每次处理患者红细胞的同时，处理抗原阳性及抗原阴性的红细胞做平行对照，而后用定型试剂检测处理后的患者及对照红细胞。

　　去除DAT阳性红细胞上抗体的方法 酸洗脱法

　　原理：酸化的环境导致抗原抗体上所带电荷改变，从而互相排斥。 优点： 放散液可以用于抗体检测 所需孵育时间少，去除抗体效率高于二磷酸氯喹法 处理好得到DAT阴性红细胞可以用于抗原检测及次侧配血。对于Rh、Kidd、Duffy、Lewis系统抗原及M、N、P1抗原没有影响。 用途：获得的红细胞可以用于抗原检测、自身吸收，获得的放散液也可以用于抗体检测

　　溶液Ⅰ与溶液Ⅱ按照1:4体积比例混合

　　洗脱液配制

　　洗涤DAT阳性RBC

　　加入放散试剂放散

　　离心得到放散液

　　放散过程

　　放散液调节

　　3号液

　　滴加3号液，注意放散液颜色变化

　　调节完成 (颜色改变)

　　放散液检测(卡法)

　　放散液可以用卡法进行抗体筛选或抗体鉴定

　　除去IgG抗体的红细胞验证

　　红细胞DAT由阳性转为阴性，此时可以用于微柱凝胶卡进行血型定型(ABO及Rh定型)

　　温自身抗体的特异性

　　大多数是多特异性抗体，且和Rh系统抗原相关。用Rhnull或D--细胞来鉴定 。 类似特异性：如类似抗-c,抗-e特异性(指此抗体和具有该抗体对应抗原的红细胞反应强度要明显强于缺乏对应抗原的红细胞) 具有单特异性：如抗-e、抗-c、抗-D、抗-E、抗-C的特异性抗体。 其他系统：很少见，如Kidd、Kell、LW、Duffy、Ena等。 一般不需要对自身温抗体进行抗体特异性鉴定。因为绝大多数自身抗体属于Rh系统的抗体，且具有多特异性，只有少数具有单特异性。且温自身抗体鉴定无助于疾病的诊断、治疗以及输血，因此不需要常规进行。

　　WAIHA患者的输血(1)

　　原则建议不要输血，因为对于WAIHA患者： 1、患者机体对于贫血已经具有耐受性，除非病人的生命处在危险中，血色素明显快速下降，已经危及到患者生命安全，，否则不要输血。 2、很难找到完全相配合的血液： WAIHA患者输血要比常规的输血治疗更加危险，由于很难找到和患者相配合的血液(即缺乏自身抗体相对应抗原的血液);因此输入的血液和自身血液一样都是不配合的，且输入的红细胞在体内存活期短于自身细胞。

　　WAIHA患者的输血(2)

　　3、输血会引起患者同种免疫，容易产生同种抗体，给以后输血造成困难。 4、输血有可能导致溶血病情加重： (1)由于自身抗体的存在，很难排除是否存在 同种抗体，输血可能导致输血反应。 (2)输血会促进自身抗体的生成，加快溶血速 度，且输入的红细胞干扰血清学检测。

　　WAIHA患者的输血 (3)

　　(3)、输血会抑制患者自身的代偿性造血机能，反而加重病情。 (4)对于WAIHA患者，溶血也是线性的，即体内红细胞越多，溶血的就越多，因此输血增加了患者的血容量，同时造成更多输入的红细胞溶血，产生的血红蛋白造成患者脏器如肾脏负担加重。

　　WAIHA患者的输血(4)

　　血色素超过8g/L的慢性WAIHA患者很少需要输血，很多5g/L甚至更低的患者也不必输血治疗。 当患者必须输血来挽救生命时，需要输血治疗，以提供足够的携氧能力，如： 患者血色素快速下降，数值很低且血压过低 血色素快速下降引起的严重贫血 患者严重贫血并伴发心肺疾病 患者出现缺氧的症状 输注量：以维持足够携氧能力的最少量的红细胞，且在输注过程中密切观察患者情况。

　　WAIHA样本进行放散试验的重要性

　　简单的血清学检验已经表明是WAIHA，仍然需要进行放散检测： 放散的目的是来确认是温自身抗体引起的WAIHA，还是药物依赖性抗体引起的免疫性溶血性贫血。WAIHA样本的放散液必须和所有的试剂红细胞产生典型的阳性反应。 放散液反应阴性表明免疫性溶血性贫血可能是药物依赖性抗体导致的，由于放散液中缺乏药物，所以产生阴性反应。 确定存在药物依赖性抗体，且是药物导致，则需要更换治疗药物。

　　关于药物型溶血性贫血检测

　　检测是否为药物型溶血：通过直接抗人球蛋白实验、血浆抗筛试验、红细胞放散液试验来区分温自身溶血和药物依赖型溶血。 通过对疑似引起药物型溶血的药物进行血型血清学检测，来确定引起药物溶贫的药物，指导临床合理选择合适的药物。 药物型溶血的患者配血可采用经典的抗人球蛋白法。

　　在抗体筛选时需要自身对照吗

　　对受血者进行抗体筛选时不需要进行自身对照试验和DAT试验。 如果血清和筛选红细胞呈阴性反应，则意外抗体筛选结果为阴性，不必考虑自身对照和DAT的结果。 如果意外抗体筛选结果为阳性，则必须进一步试验来鉴定这些抗体。谱细胞鉴定抗体特异性试验应该包括自身对照，来确定患者血清中的抗体反应活性是同种抗体引起，还是自身抗体引起，或是同种抗体加上自身抗体共同引起。

　　抗体鉴定的复检

　　对于已经明确有不规则抗体记录的患者，没有必要重复抗体鉴定，无论现在反应性如何，都必须选择不含对应抗原的血液输用。 存在下列情形一种或多种的，则需要进一步进行 抗体鉴定确认是否有新抗体产生： 即使抗原阴性的供者血交叉配血也不相合 输注不规则抗体所对应抗原阴性的血液出现黄疸血清 输注不规则抗体所对应抗原阴性的血液可能有迟发性输血反应。 抗体筛选反应格局改变。

　　患者血液样本的采集管

　　建议不要使用血清分离管：因为管中有凝胶，很难获得不被凝胶污染的红细胞，如果红细胞悬液中的凝胶在血型定性试验中被误认为是凝集，则会产生假阳性反应，导致定型错误 用凝胶血清分离管来采集血样可以在紧急情况下采用，不做常规使用。

　　对于有临床意义抗体记录患者的配血

　　随时间推移，患者体内有临床意义的抗体会减弱以至无法检测出来。 30~35%的抗体在鉴定为阳性的1年后检测转为阴性。 接近50%的抗体在10年后检测转为阴性。 抗原抗体的反应强度与所采用的检查技术有关。 对于有临床意义抗体记录患者的配血，仅仅交叉配血相合是不够的，还必须保证相合的供者红细胞上不含有与记录中有临床意义抗体相对应得抗原。

　　试剂中的防腐剂引发的假阳性

　　使用抗筛细胞进行抗体筛选时，与筛选红细胞均产生阳性反应，而交叉配血均为阴性。抗筛细胞中的防腐剂引起的。 使用增强介质如LISS时，会导致阳性反应，而使用盐水介质IAT则均为阴性。原因1是存在依赖防腐剂(如硫柳汞)的凝集素会导致假阳性反应，因素2是被检者的自身凝集素表现为低亲和力，只有在低离子环境下才会产生反应，没有临床意义。

　　不同交叉配血方法的选择(1)

　　不使用增强介质的方法：IAT 使用增强介质的方法： PEG-IAT LISS-IAT 酶方法 凝聚胺 凝胶卡式

　　不同交叉配血方法的选择(2)增强介质的使用

　　对于有临床意义的弱反应性特异性抗体，如果不使用增强介质，就有可能丢失有临床意义抗体的检出。 根据自身对照试验的结果，选择不同的增强介质 PEG-IAT方法的灵敏度>Liss-IAT >IAT

　　不同交叉配血方法的选择(3)

　　对于抗体筛选阳性，自身对照为阴性的样本，为了提高反应强度，有助于弱抗体的检出，可以采用PEG-IAT、Liss-IAT的方法、凝胶卡的方法。

　　不同交叉配血方法的选择(4)

　　对于温自身抗体，则不适合采用非常灵敏的PEG-IAT方法或ID卡法。而采用相对灵敏的Liss-IAT(或IAT)方法，可以避免无临床意义的温自身抗体的检出，但仍可以有效的检测出同种抗体。

　　延长抗原抗体混合后的孵浴时间会增强抗原抗体反应吗?(抗原抗体混合后的孵育时间与反应强度关系)

　　IAT试验中孵育是让抗体有充足的时间和红细胞上的抗原相结合，结合可以划分为3个阶段 第一阶段：抗原抗体结合率高且快，抗原抗体复合体解离率低且慢。 第二阶段：结合和解离速度相同，达到平衡。 第三阶段：抗原抗体复合体解离率增高，抗原抗体结合率降低。 理想的孵育时间是在第二阶段，因此不同方法的孵育时间也有所不同。如果孵育太长的时间，进入第三阶段，则很可能导致假阴性反应。

　　关于微柱凝胶卡

　　一定要严格按照0.8-1%的浓度配制红细胞。 样品槽中的加样量严格按照50微升红细胞25微升血浆的比例加入。 注：卡法中的0.8-1%浓度的50微升红细胞相当于2-4%浓度的红细胞12.5微升，所加入的血浆25微升，与试管法的血浆红细胞加入量一致，只是为了保持卡法的低离子环境才将红细胞用liss液稀释到0.8-1%浓度。 血浆样本要严格离心，去除任何细胞(白细胞、血小板)以及其他任何不容物(细胞碎片等)。 用于间接抗人球蛋白试验的红细胞一定要用Liss液将红细胞配制成0.8-1%浓度才能保证孵育15分钟得到可靠结果。

　　输血前检查血浆样本过滤器适用于临床输血前检查血浆样本过滤，可有效去除浑浊血浆中脂肪及细胞碎片、纤维蛋白等不溶物，过滤后的血浆(血清)可用于血型鉴定、抗体筛查、抗体鉴定及交叉配血。

　　输血前检查血浆样本过滤器的应用

　　血浆过滤前后比较

　　血浆过滤前后卡法定型结果对比

　　输用IVIG会导致DAT阳性吗?

　　在很多情况下，IVIG是用作网状内皮组织的阻断剂(输入的IgG竞争结合巨噬细胞上的Fc受体)。 输注IVIG可以引起DAT阳性。IVIG是利用多个供者(成千上万)的混合血浆制备。由于如此多供者血浆混合，因此IVIG制品中时常会含有抗-A和/或抗-B。

　　谢谢