多基因病的分子遗传学.ppt

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　　多基因病的 分子遗传学 xxx

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　　正文： 主要内容： 第一节 多基因病的一般特征 第二节 多基因病的研究方法(重点难点) 第三节 糖尿病的分子遗传学

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　　标题： 第一节 多基因病的一般特征

　　正文： 一 特征 1、病种多: 如高血压、冠心病、动脉粥样硬化、哮喘、高脂蛋白血症、糖尿病、胃及十二指肠溃疡、精神分裂症、风湿病、癫痫、甲亢、 唇裂、腭裂、先天性心脏病等。

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　　2、发病率高 (群体发病率)： 家庭复发风险比较： 单基因遗传病：25%—50%， 多基因遗传病：1%—10%。 群体发病率比较： 单基因病：低于1/10000， 多基因病：超过1/1000，有些1%—10%。

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　　3、危害性大 (直接危害人类的生存与健康) 4、病因复杂 ( 遗传因素和环境因素) 5、微效性 6、累加作用 7、对其研究具有前沿性

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　　多基因病是复杂疾病，遗传因素有以下特点： 1)参与发病的遗传因素多于一个，每个基因通过对中间 性状的影响直接或间接地促进疾病的发生; 2)每个基因参与发病的程度不同，大多数基因的作用较小， 但也可由一个或几个基因呈主基因效应; 3)每个基因只赋予个体某种程度的易患性，但每个基因的 作用不足以致病，也并非致病所需，需要多个基因累加 起来才会致病; 4)各基因参与发病的机制可能是，各自对不同的代谢途径 产生影响，疾病的最终发生是各基因在不同途径作用的 综合结果; 5)各基因致病效应的累积加上环境因素的作用构成了个体的 疾病易患性，当易患性超过一定阈值时即可导致疾病的发生。

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　　二 概念(易患性与发病阈值) 1、 易患性(liability) 人群中易患性变异：呈正态分布。 2、发病阈值(threshold)： 易患性达到或超过一定的限度后就 会发病，该限度的易患性即发病值。

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　　群体的易患性平均值： 从该群体的发病率作出估计，即群体 发病率是测量易患性平均值的依据。

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　　3、 遗传度 (heritability) 多基因病的易患性由遗传因素 和环境因素共同引起，其中遗传因素 所起作用的相对大小称为遗传度(heritability)。

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　　遗传度提供的其他信息： 若通过患者同胞发病率计算的遗传 度高于其他亲属发病率计算的遗传度， 或者遗传度超过100%，则提示单基因 遗传病的可能性。

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　　三 复发风险的一般规律 1、 遗传度高低; 2 、患者亲属级别：一级亲属的发病率 为群体发病率的开方值; 3、 家庭中患者数量; 4 、患者病情严重程度; 5、 近亲婚配; 6、 性别。

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　　正文： 第二节 多基因病的研究方法 当前对多基因病的研究，主要是 寻找疾病的主基因，或易感基因， 并试图阐明其遗传机制。 主要方法： 关联分析 (association study) 连锁分析 (linkage analysis) 基因组筛查 (genomic scanning) 候选基因研究 (candidate gene study)

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　　正文： 一、关联分析 (association study) 比较患者组与对照组某遗传标 记出现的频率，从而判断遗传标记 与疾病关系的研究方法。

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　　关联分析，选择与疾病代谢有关的蛋白或酶的 基因作为候选基因，在其位置已知的情况下， 首先选取该基因内部或附近的多态性位点作为遗传标记。 然后进行病例-对照研究，比较病例组与对照组在 遗传标记位点等位基因出现的频率，如果遗传标记 位点的频率在病例组和对照组有显著差异，则该标记 与疾病关联。 对于复杂性状的多基因病，关联分析较连锁分析 更为有效。因为关联分析研究对象是病人和正常人， 无需家系资料;且更容易找出只有微弱效应的基因; 即使显示关联的标记不是造成疾病的变异，但很可能 与变异连锁。因此关联分析更适合于多基因遗传模式。

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　　若差异极为显著，则遗传标记与疾病关联。 表明有三种可能： 1、遗传标记与致病基因座不在一 条染色体上; 2、 遗传标记与致病基因座在一 条染色体上; 3、遗传标记本身即致病基因座(与 疾病的发生机理有直接的关系)。 遗传标记主要是微卫星DNA(STR)和 单核苷酸多态性(SNP)。

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　　正文： 二、连锁分析 (linkage analysis) 连锁分析是分析两基因在染色体上相互关系的方法，通常是应用已知位点的遗传标记，在患者家系中进行分析，从而确定该致病基因在染色体上的粗略位置。

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　　连锁分析，是确定两个遗传标记或者更多遗传标记 之间的物理关系，以确定致病基因的位置。它根据生殖 细胞减数分裂时，染色体发生交换和重组的原理，如果 标记与特定基因位于不同的染色体，那么向子代传递时， 它们将会发生自由分离;反之，如果标记与特定基因位于 同一染色体且相距较近，在传递过程中，它们将不会发生 自由分离，而呈现共分离的现象(行为一致)。利用这个 原理，如发现某个标记物与疾病存在(很强的)连锁关系， 则可将疾病相关基因确定在和该遗传标记(非随机)共同 传递的区域。该方法的好处是它将致病基因限定在一个小 的范围内，以便进一步寻找引起疾病的突变。不足之处是， 不能直接发现致病基因，且很难收集到合适的大家系。 所以在探索多基因病相关基因的应用中受到一定限制。

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　　正文： 三、基因组筛查 (genomic scanning) 是指在不需要事先了解该基因位置、生物学功 能、致病机制的情况下，利用高密度的多态性标记，通 过全基因组扫描，划定与疾病相关的易感区域，再在此 区域内选择适当的多态性标记精细扫描，然后根据连锁 分析的方法，评价疾病与标记物的相关性，从而定位与 疾病相关的染色体区域或致病基因。

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　　正文： 其流程如下： 1、家系收集及基因组DNA提取; 2、微卫星标记或SNP标记的选择; 3、标记的引物合成和PCR扩增; 4、电泳检测(基因分型); 5、等位片段分析(通过电脑); 6、基因组扫描综合分析：计算LODS值(两基因 非随机出现的概率与随机出现的概率之比， 再取对数)，若某个标记的LODS值大于3 (比值大于103)，即可肯定标记与致病基因 连锁，进而将致病基因定位在标记所在区域内。

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　　全基因组筛查：选择并使用覆盖23条 染色体上的、密度适当的遗传标记，结合家系 进行分析; 部分基因组筛查：选择并使用覆盖 某一条染色体或其部分区段上的、密度适当 的遗传标记，结合家系进行分析。

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　　四、 候选基因研究(candidate gene study) 基于对代谢途径的认识(已知代谢途径)， 选择关键酶的基因,作为疾病的候选基因, 研究 其编码顺序或非编码顺序与疾病的关系。 即 研究患者中该基因的编码序列是否有基因突变; 非编码序列是否有多态性位点基因与调控关联 或与调控连锁。 确认或排除候选基因是否致病基因。 进而可能克隆疾病基因，用于基因诊断或 药物生产。

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　　正文： 综上所述，目前对于多基因病易感基因的研究，主要有两种方法： 1、候选基因策略的关联分析; 2、全基因组扫描的连锁分析。

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　　正文：

　　比较：对于多基因病而言，关联分析可能 比连锁分析更有效。因为关联分析相对于连锁分 析更易找到只有很微小效应的基因。而且不需要 很难找到的家系。 结论： 关联分析更适合于多基因遗 传的模式。

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　　正文： 对几种方法作选择时需要考虑的因素： 家系、样本数、经费、已有资源、 研究时间、疾病等。

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　　第三节 糖尿病的分子遗传学 糖尿病(diabetes mellitus，DM)，乃多基因病复杂性 的代表。是继肿瘤、心血管疾病之后第3位严重威胁 人类健康的重大疾病。全世界约有1. 5亿多患者，其研究 已经成为世界性的难题。 可分为： 胰岛素依赖性糖尿病(IDDM) I 型糖尿病 T1DM 非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)II型糖尿病 T2DM 占 90% 发病率：城市近10%; 农村3%。

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　　正文： 糖尿病，其遗传机制的复杂性历来 是遗传学家头痛的问题。 from headache to nightmare.

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　　一、当前研究方法： 1、候选基因法 确定一个或数个在糖代谢中起重要作用的酶的基因， 在群体或家系中研究这个基因与发病的关系。 研究患者中该基因的编码序列是否有突变;非 编码序列是否有多态性位点与基因调控关联或连锁 (不平衡)。以确认是否致病基因。

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　　正文： 候选基因有： 醛糖还原酶基因(AR)、 血管紧张素—Ⅰ转换酶基因(ACE)、 血管紧张素原基因(AGT)、 一氧化氮合成酶基因(NOS)、 葡萄糖激酶基因(GCK)、 胰岛素基因、 胰岛素受体基因等。

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　　2、遗传标记排除作图法(连锁分析法) 寻找与糖尿病发病相关的分子遗传学标记。 通常对糖尿病家系进行连锁分析，确定或排除 某一区段与糖尿病的尚未知的致病基因连锁。 这是对未知代谢途径研究的有效方法。 以上两种方法，既有区别，也有联系。

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　　正文： I 型糖尿病相关基因位点比较肯定， 主要有：IDDM1—15。 II 型糖尿病相关基因位点正在进行大量 研究，现已报道的阳性重复位点主要有： 20q12-13 、1q21-23 、 12p13、7q21 等。

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　　二、主要候选基因或基因位点 (一) HLA II类抗原基因与 T1DM 的关联 1、HLA基因谱 HLA是多基因家族中的超基因，位于6号染色体短 臂。见示意图。

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　　正文： 复等位基因数： II类基因区有4个亚区，每个亚区的等位基因数 分别是：DP区6个、D区26个、DQ区9个、DR区20个。 一条染色体上的每个亚区内都各有多个α、β链 基因，基因产物为糖蛋白。分别由各亚区α、β基因 合成α和β链，再形成非共价二聚体。

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　　2、HLA-DR 和 HLA-DQ 与 T1DM 的关联 (1)DR3、DR4、DRw6 DRw8与 T1DM 关联。 (2)DQ基因区与 T1DM 的相关性比DR基因区更强。 例如，0.2%的美国人为 T1DM 所困，而携带DR3 和DR4的白人发病率是正常人的20倍。

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　　(3)DQ β基因可能决定 T1DM 的易感性和耐受性。 (4)可能有某单倍型的几个位点共同参与了 T1DM 的易感性。

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　　(二)其它1型糖尿病的易感位点 IDDM2 胰岛素基因 IDDM3 15q26 IDDM4 D11S1253-1374 IDDM5 6q25与雌激素受体基因连锁 IDDM6 18S478 IDDM7 2q31(谷氨酸脱羧酶抗体基因) IDDM8 6q25-27 IDDM9 IDDM10 D10S193-588 IDDM11 14q24.3-q31D14S67与糖尿病连锁 IDDM12 D2S272(2q33)(细胞毒素相关因子) IDDM13 D2S164(2q24) IDDM15 6q21(与HLA连锁)

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　　虽已报道15个易感位点，但还会有新 位点发现。还需要进行研究以便确认或排 除。还需进一步精细定位，进而克隆易感 基因，阐明易感基因的生物学功能。

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　　(三)胰岛素基因 人胰岛素基因位于11p15, 由1355bp组成，包 括3个外显子和2个内含子。5’侧翼区是调节顺 序，启动子位于第一个外显子上游25bp处，第 一外显子上游168bp—258bp之间的顺序为增强 子。该基因区称为IDDM2。

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　　胰岛素是最为保守的生物大分子之一，哺乳 类动物之间的胰岛素基因结构差异很小。 人胰岛素基因突变很少发生在编码区，因此， 胰岛素基因突变不是糖尿病的主要病因。

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　　在胰岛素基因5’侧翼区，在距转录起始点363bp 处，有一个高度变异区(INS 5’HVR)，其重复单位 为14bp(ACAGGGGTGTGGGG),可将其作为一个 遗传标记。按此HVR的长度，可将其分为三型等位基因 Ⅰ型等位基因：小于600bp 重复40多次 Ⅱ型等位基因：600---1600bp 重复80多次 Ⅲ型等位基因：1600---2470bp 重复160多次

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　　三型基因按孟德尔方式传递，人群中存 在六种基因型： Ⅰ/Ⅰ Ⅰ/Ⅱ Ⅰ/Ⅲ Ⅱ/Ⅱ Ⅱ/Ⅲ Ⅲ/Ⅲ 在欧美(高加索人种)，糖尿病患者 Ⅰ型等位基因的频率显著高于对照。

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　　(四)胰岛素受体基因 胰岛素作用于靶细胞需要胰岛素受体与 之结合。胰岛素受体是一种质膜糖蛋白， 它由连接胰岛素的两个α亚单位和具有 酪氨酸激酶活性的两个β亚单位组成。

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　　正文： 胰岛素受体基因突变使受体与胰岛素的 结合性降低，产生靶细胞抵抗胰岛素的现象， 这主要是 T2DM 的特征。 总之，胰岛素受体基因突变可导致糖尿病， 但基因的保守性，决定其也不是糖尿病的主要原因。

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　　(五)葡萄糖激酶(GCK)基因 GCK存在于肝脏和胰岛的β细胞，GCK对 血糖的调节如下图：

　　血糖(-)

　　血糖(+)

　　β细胞葡萄糖 感受器 (胰岛GCK)

　　胰岛素(+)

　　肝葡萄糖感受器(+) (肝GCK)

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　　如果GCK活性降低，正常代谢平衡出现 紊乱，则导致血糖增高，引起糖尿病。

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　　1、GCK基因结构及多态性 GCK基因定位于7p13,由12个外显子，11 个内含子组成。这12个外显子从5’向3’方向 依次命名为1B、1H、1C、2、3、4、5、6、7、 8、9、10，其中1B仅出现在胰岛细胞，而 1H和1C仅出现于肝细胞，其他外显子在两种 组织内相同。

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　　这种组织特异性是由基因的特异 启动子所决定的，即组织不同启动子 不同，在GCK基因的不同部位转录， 形成各自特异的GCKmRNA。

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　　在GCK基因区3’端处，发现3个 (GC)n、2个(GA)n 不连续串联重复 序列，即GCK微卫星DNA多态性标志之一， 称为GCK-1。

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　　现发现GCK-1含有七个等位基因，将含195bp的 等位基因命名为Z，其他六种分别为Z+2、Z+4、 Z+6、Z+8、Z+10、Z-15。它们的不同之处就在于上 述不连续双核苷酸重复序列长度不同，如Z+2含 197bp,Z-15含180bp,依此类推。

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　　2、GCK基因与 T2DM 的关联 美国黑人Z+4等位基因与 T2DM 关联， 可看成该人群 T2DM 的遗传标记。 毛里求斯人Z+2等位基因与 T2DM 关联。 白人、印第安人Z等位基因与 T2DM 负关联。

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　　3、GCK基因突变与MODY型糖尿病 目前已知，GCK基因突变是MODY的病因一：GCK基 因第七外显子发生无意义突变(Glu-279-----AM),即 谷氨酸-----提前终止，或发生错义突变(Gly-261--- --Arg),即谷氨酰胺-----精氨酸。突变的GCK改变了与 葡萄糖的亲合力，还引起细胞的ATP/ADP比值改变，干 扰了胰岛素的分泌，导致MODY发生。

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　　正文： (六)NOS基因 一氧化氮作为细胞信号传递的信使是近年 来生命科学的重要成就，一氧化氮(NOS)合 成酶基因与糖尿病的关系应受到关注。 人类NOS由多个基因编码，可分为诱导型 (iNOS)、神经元型(nNOS)和内皮细胞型 (eNOS)。

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　　正文： NOS是内源性NO生成的限速酶。影响NOS基因转录、翻译 的因素都可以影响NO的生成。 iNOS定位于17cen→q11.2区域，长约37kb，包含26 个外显子。 nNOS定位于12q24.2-24.31,长约120kb，有28个外显子。 eNOS定位于7q35-36，长约21kb,有26个外显子。

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　　正文： 在糖尿病微血管并发症鼠中发现eNOS表达下降，iNOS表达增加。 iNOS基因启动子区的一个多态性位点可能与欧洲人的2型糖尿病相关。 在南非，观测到nNOS基因的7、9等位基因在2型糖尿病患者中显著增多。 在eNOS基因中发现四种突变可能影响糖尿病的微血管并发症。

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　　正文： 我们研究了中国汉族人iNOS基因和eNOS基因微卫星DNA各等位基因与2型糖尿病的关系。 发现iNOS基因(CCTTT)14和(CCTTT)15与DM负相关; eNOS基因(CA)34与DM正相关。 对DM及其并发症发生机制有了新的认识。有必要进一步研究正常人群和DM及微血管病变患者NOS基因编码区的差异。

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　　正文： 单核苷酸多态性(SNPs)是稳定 的分子标志，基因编码区的SNPs可引 起密码子改变，导致氨基酸变化并改变 酶蛋白的构象，致使原有功能丧失或降 低。拟进行NOS基因的分子流行病学研 究。

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　　三、IDDM与NIDDM的遗传流行病学 对于多基因病的基因分离，首先要回答有多少基因参与，是否有主基因的作用。 流行病学研究表明，IDDM和NIDDM都很可能有主基因的作用。 主基因到哪里去寻找呢?

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　　要从大量的适合分析的患者家系中去寻找。家系中有较多的患者，其遗传背景又相近，应用分子生物学方法，有可能找到糖尿病的相关基因。 因此，家系是国家的重要遗传学资源，国家对此进行严格的归口管理。

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　　IDDM已经找到许多相关基因位点。 NIDDM的研究进展缓慢。 据计算，IDDM的λs值(同胞患病率/群体 患病率)可达15以上，而NIDDM的λs值 较低(有的仅3.5)。

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　　在不同地区、不同民族，某些家系的 NIDDM的λs值可能较高，有望构成NIDDM的 亚型。 因此，对这些家系的核心家系，判明遗 传方式后，可用遗传标记进行连锁分析， 排除或确认标记位点与NIDDM的连锁关系， 从而为基因定位和克隆提供依据。

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　　基因研究要有适合的家系。 “找到好的家系如同发掘到宝藏”这种说法 并不夸张。可选择以下方法寻找易感基因： 1、大家系的连锁分析 2、大量核心小家系的连锁分析 3、患者同胞对分析

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　　正文： 其它多基因病的分子遗传学研究策略与糖 尿病的研究相似。 多数是候选基因(candidate gene)研究; 其余是应用疾病家系资源进行排除作图或 部分基因组扫描(genomic scanning)研究。

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　　正文： 谢谢大家。