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　　细胞培养技术介绍 Cell Culture Technology

　　目录

　　一、细胞培养概念 二、细胞培养仪器、耗材、试剂 三、细胞传代 四、细胞冻存 五、细胞复苏 六、原代培养

　　细胞培养概念

　　为什么要在体外培养细胞? 模拟体内生理过程，研究细胞正常生理作用(例如:代谢研究、衰老研究)、药物和毒性化合物对细胞的致突变和致癌等; 用于药物筛选和开发以及生物药物的大规模生产(例如:疫苗、治疗性蛋白) 等; 获得稳定、可重复的结果(使用一批同源细胞)。

　　细胞培养 细胞培养是指从动物活体体内取出细胞、组织等，在模拟体内生理环境的体内条件下(无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等)，进行孵育培养，使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。

　　细胞体外生存的必要条件

　　①严格的无菌无毒环境。 体外培养的细胞缺乏对微生物和有毒物质的防御能力，一旦被污染就会死亡。 ②合适的营养物质。 培养基可为细胞提供生长和增殖所必需的营养物质和促生长因子。 ③合适的生存环境。 包括恒定适宜的温度(37℃)、pH(7.2-7.4)和气相环境(主要是O2和CO2 )。

　　生物安全柜(主要的操作平台)

　　二氧化碳培养箱

　　显微镜

　　液氮罐

　　离心机

　　细胞培养实验室

　　恒温水浴锅

　　(Gp:) 01

　　(Gp:) 贮存

　　(Gp:) 普通冰箱(4℃， -20℃) 超低温冰箱(-80℃) 液氮罐(约-196 ℃)

　　(Gp:) 02

　　(Gp:) 03

　　(Gp:) 04

　　LOGO

　　细胞培养设备试剂

　　灭菌

　　高压灭菌锅 灭菌去离子水(CO2 培养箱) 紫外灯(位于生物安全柜中) 75%乙醇(细胞培养过程中)

　　培养设备

　　生物安全柜 倒置显微镜 离心机 CO2培养箱 移液器、移液枪 细胞培养容器(培养瓶，多孔板)

　　培养试剂

　　培养基 血清 胰酶 磷酸盐缓冲液

　　细胞培养的设备和耗材

　　生物安全柜：细胞培养的主要操作平台，中央区域是严格的无菌区域。 生物安全柜内有风道和循环空气高效过滤网，可以清洁空气保证无菌。

　　生物安全柜

　　离心机

　　离心机：细胞培养时，通常使用离心机制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤和收集细胞。 一般常规配置4000rpm台式离心机;细胞离心常规选用80-100G离心力，因为离心力过大会损伤细胞。

　　CO2培养箱

　　CO2培养箱：能够提供细胞培养时细胞生长和增殖所需要的环境 温度： 37℃ 气相：95%空气和5% CO2 CO2的作用：细胞生长需要碳源、维持PH 水盘：水盘的水补充高温蒸发的水(无菌水)，保持培养箱的湿润环境

　　倒置显微镜

　　倒置式显微镜：用于日常了解细胞的生长情况并观察有无污染发生。 选用配置有照相系统的高品质相差显微镜、解剖显微镜、荧光显微镜、录像系统或缩时电影拍摄装置等，可随时拍摄并记录细胞生长情况。

　　24h

　　48h

　　72h

　　细胞培养镜下观察

　　移液器和移液管

　　移液器和移液管：用于转移培养基等液体试剂 移液管根据不同的需求有不同的规格，上面标有刻度，便于读数。

　　细胞培养板和培养瓶

　　(Gp:) 75mm3

　　(Gp:) 25mm3

　　(Gp:) 150mm3

　　(Gp:) 六孔板

　　(Gp:) 二十四孔板

　　(Gp:) 四十八孔板

　　(Gp:) 十二孔板

　　(Gp:) 九十六孔板

　　细胞培养的试剂

　　(Gp:) 培养基

　　(Gp:) 培养基的主要成分

　　(Gp:) 氨基酸 碳水化合物 无机盐 维生素 其它辅助物质

　　(Gp:) 培养基种类

　　(Gp:) MEM：成分简单，适合多种细胞层生长; RPMI-1640： 适用于多种正常细胞和肿瘤细胞的生长; DMEM ：营养成分较高，为糖型和低适用附着性差的肿瘤贴壁生长; F12：营养成分低，适用于单细胞的密度克隆化培养。

　　细胞培养基

　　培养基是细胞体外培养最重要的营养成分，主要是糖类、蛋白质、维生素等营养物质，根据营养物质的不同可以分为不同的培养基。

　　(Gp:) 胎牛血清

　　血清是在血浆中除去纤维蛋白原及某些凝血因子后分离出的淡黄色透明液体。 血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，可以增强细胞的存活和生长能力。 一般配置培养基的时候，添加10%的胎牛血清。

　　胎牛血清

　　(Gp:) 胰蛋白酶

　　胰蛋白酶是从牛、猪、羊的胰脏提取 作用：消化细胞。 水解细胞间的蛋白质，从而使细胞离散，细胞从培养板上脱落下来。 胰酶分散细胞的活性与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH 为 8.0 、温度为 37℃ 时，胰酶溶液的作用能力最强。 此外Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的作用。 终止消化时，可用含有血清培养基。

　　胰蛋白酶

　　(Gp:) PBS

　　PBS缓冲液( Phosphate Buffered Saline )在传代、冻存细胞的时候对细胞进行冲洗，洗去培养基，便于胰酶消化。 PH值在7.2-7.4之间，是细胞最适合的PH值范围。 PBS可以维持最佳条件保证生物活性物质保持其最完整的特性。

　　磷酸缓冲盐溶液

　　细胞培养-细胞传代

　　细胞传代

　　显微镜下观察到细胞密度已经覆盖培养瓶底部的80%，可以进行传代。

　　目的：维持细胞的持续培养(将细胞由一个培养瓶传至2-4个培养瓶中继续生长) 细胞传代时间：正常细胞达到汇合状态时会停止生长(接触抑制)，故细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代。 对数期细胞已经适应环境,细胞生长很快，易于存活。

　　细胞生长曲线

　　细胞传代过程

　　(Gp:) 试剂和生物安全柜的准备

　　(Gp:) 显微镜观察细胞密度 覆盖培养瓶底部的80%

　　细胞传代过程

　　(Gp:) 移除培养基

　　(Gp:) 用PBS清洗细胞

　　(Gp:) 用PBS清洗细胞

　　细胞传代过程

　　(Gp:) 移除PBS

　　(Gp:) 加入0.25%的胰酶，消化细胞

　　细胞传代过程

　　(Gp:) 消化细胞时，让胰酶覆盖细胞，放在培养箱中消化3-5min

　　(Gp:) 显微镜观察是否消化完成

　　细胞传代过程

　　(Gp:) 加入培养基终止消化

　　(Gp:) 将胰酶和细胞的混合液移到50ml离心管，1000rpm离心5min

　　细胞传代过程

　　(Gp:) 离心后的细胞

　　(Gp:) 移除培养基

　　细胞传代过程

　　(Gp:) 在离心管中加入新的培养基

　　(Gp:) 将细胞分别移入2-4个新的培养瓶中

　　细胞传代过程

　　(Gp:) 晃匀细胞和培养基

　　(Gp:) 将传代好的培养瓶做好标记后，放入培养箱中培养

　　细胞冻存

　　(Gp:) 细胞冻存管

　　细胞冻存：将细胞放在置于-196℃液氮中低温保存，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。 取对数生长期的细胞进行冻存，易于保种。

　　细胞复苏

　　细胞复苏：将冻存在液氮或者-80℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。

　　原代细胞培养

　　原代培养是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养。 动物胚胎或幼龄动物体细胞的生命力旺盛，细胞分裂能力强，因此进行动物细胞培养时，最好选用健康动物胚胎或幼龄动物个体的体细胞。

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